原代培养中分化的小鼠脂肪细胞:胰岛素抵抗模型

该协议描述了从皮下脂肪中分离小鼠前脂肪细胞，它们分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗。通过蛋白质印迹的胰岛素信号通路成员的磷酸化/激活来评估胰岛素作用。该方法可以直接测定原代脂肪细胞的胰岛素抵抗/敏感性。

可以在原代脂肪细胞中评估胰岛素抵抗，从而可以在不同的生理病理学背景下研究供体，例如瘦与肥胖，或来自不同脂肪沉积物的细胞。原代脂肪细胞保留了许多内在特性，可以在规定的条件下长时间培养，并严格控制细胞环境因素。要开始分化过程，细胞必须处于80%汇合。

如果分化从较低或较高的汇合处开始，细胞将分化较少或失去分化能力。牺牲动物后，用70%乙醇摩擦对小鼠进行消毒。解剖每只小鼠的腹股沟皮下脂肪组织，并将其收集在15毫升锥形管中，其中含有15毫升冰上的一型胶原酶溶液。

用无菌手术剪刀将脂肪组织切成小块，并通过在 37 摄氏度的轨道振荡器中以 150 RPM 的速度与 1 型胶原酶溶液一起孵育 30 分钟来消化样品。每 10 分钟检查一次消化，以确保其正常工作，并防止过度消化。使用200微米网状注射器过滤以消除未被胶原酶消化的组织，并将过滤器通过管的边缘以将尽可能多的细胞排入溶液中。

加入 15 毫升冷 DMEM 1%BSA 以停止消化，并在 400 摄氏度下以 400 G 离心 10 分钟。吸出含有成熟脂肪细胞的顶层和大部分液体层。向其中加入20毫升冷PBS 2%FBS，并重悬沉淀。

再次离心五分钟后，通过吸出上层除去上清液以消除剩余的脂肪细胞和脂肪。将沉淀重悬于一毫升ACK裂解缓冲液中。在冰上孵育五分钟。

加入10毫升PBS 2%FBS并混合。离心五分钟并吸出上清液后，将沉淀重悬于200微升抗FC溶液中。在冰上孵育五分钟，然后将细胞悬液转移到适合磁性细胞分离器的预冷架的五毫升管中。

离心5分钟并除去上清液后，加入200微升CD 31单克隆抗体生物素和CD 45单克隆抗体生物素的混合物。充分混合，在冰上孵育15分钟。然后加入400微升PBS 2%FBS，并在4摄氏度下再次以400G离心5分钟。

吸出上清液并将其在100微升抗生物素微珠中在冰上孵育15分钟。加入 400 微升 PBS 2%FBS，并在 400 摄氏度下再次以 400 G 离心五分钟，如前所示。弃去上清液后，将沉淀重悬于350微升PBS 2%FBS中。

要使用 70 微米预分离过滤器从单细胞悬浮液中去除细胞聚集体或大颗粒，请用 100 微升 PBS 2%FBS 激活过滤器。将细胞悬液通过过滤器，并将其收集在干净的管中。然后用100微升PBS 2%FBS清洗过滤器。

要使用负分离策略对细胞进行磁性分离，请将样品放置在冷藏架的位置A中，将两个空管放在位置B和C处以回收未标记和标记的细胞。然后将洗涤缓冲液和电泳缓冲液装入相应的瓶子中。在分离部分中，选择要分离的样品数量并选择耗尽方案。

按运行并开始分离。在程序结束时，恢复未标记的单元格。接下来，通过添加 400 微升 2.5% 基底膜基质覆盖每个孔的整个表面，用基底膜基质涂覆 12 孔板。

取出多余的溶液，让板在层流罩内干燥至少一小时。离心五分钟并弃去上清液后，将沉淀重悬于500微升生长培养基中。将脂肪细胞前体细胞或APCs接种在先前用2.5%基底膜基质包被的12孔板的一个孔中。

在37%二氧化碳气氛中以37摄氏度孵育，每48小时更换一次培养基，直到细胞达到80%汇合。完全除去培养基后，用350微升PBS 2%FBS洗涤细胞。用350微升0.05%tripsin EDTA在37摄氏度下收获细胞两分钟，并加入两毫升生长培养基。

将细胞收集在新的50毫升锥形管中，并以400 G离心五分钟。将APC传代到先前涂有2.5%基底膜基质的12孔板中，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育。每48小时更换一次培养基，直到细胞达到80%汇合。

在80%汇合时，吸出任何生长培养基，并用500微升分化培养基代替，每孔中含有3.3纳摩尔骨形态发生蛋白。48小时后，用每孔500微升分化培养基和分化混合物替换培养基。72小时后取出培养基，并在500微升新鲜分化培养基中加入100纳摩尔胰岛素。

48小时后，用每毫升4毫微克的肿瘤坏死因子α或TNF α诱导胰岛素抵抗。吸出任何分化培养基，并用 500 微升含有 TNF α 的简单培养基 2%FBS 代替。孵育24小时后，在简单的培养基0%FBS中加入每毫升TNF α4纳克。

24 小时后，通过加入 100 纳摩尔胰岛素激活胰岛素信号通路，并在 37% 二氧化碳气氛中在 57% 的气氛中孵育 15 分钟，如前所述。孵育后，除去培养基并用500微升PBS洗涤，包括没有胰岛素处理的对照孔。提取蛋白质并通过蛋白质印迹测量胰岛素信号标志物的磷酸化。

该图显示了在12孔培养板中诱导分化之前皮下脂肪细胞前体细胞在80%汇合，以及诱导分化7天后的原代脂肪细胞。TNF α在皮下原代脂肪细胞中诱导的胰岛素抵抗通过胰岛素诱导的胰岛素受体、胰岛素受体底物1和蛋白激酶B或AKT磷酸化减少来证明。用抗磷酸化胰岛素受体、抗磷酸化胰岛素受体底物一、抗磷酸化AKT探测膜，抗β微管蛋白作为上样对照。

通过化学发光检测对信号进行可视化。此处显示了代表性印迹和三个独立实验的定量结果。在尝试此程序时，需要注意的一件事是，TNF α诱导胰岛素抵抗是2%FBS持续24小时，最后24小时使用0%FBS。