Name: 原代培养中分化的小鼠脂肪细胞:胰岛素抵抗模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习小鼠原代脂肪细胞分化与胰岛素抵抗模型的建立方法。本实验通过分离皮下脂肪前体细胞，诱导其分化为成熟脂肪细胞，并利用TNF-α诱导胰岛素抵抗，最终通过蛋白质免疫印迹分析胰岛素信号通路磷酸化水平，为代谢疾病研究提供可靠的细胞模型。

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感谢Daniel Mondragón、Antonio Prado、Fernando López-Barrera、Martín García-Servín、Alejandra Castilla和María Antonieta Carbajo提供的技术协助，感谢Jessica Gonzalez Norris对稿件的审阅与修改。本方案由墨西哥国家科学技术理事会（CONACYT）教育研究专项基金&#160;资助，项目编号284771（资助对象：Y.M.）。

所有啮齿类动物实验均经墨西哥国立自治大学神经生物学研究所生物伦理委员会批准，方案编号为075。
1. 小鼠脂肪细胞前体细胞的分离
<ol>
	<li>处死 8–10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠（例如通过 CO2&#160;吸入并随后进行颈椎脱位）（每次分离使用四只动物）。用 70% 乙醇擦拭小鼠进行消毒，并在处死后立即获取脂肪组织。 
	注意：在啮齿类动物安乐死后，应立即分离脂肪组织，并在无菌超净工作台内完成所有操作步骤。小鼠饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下，可自由摄食和饮水。</li>
	<li>从小鼠中解剖出腹股沟皮下脂肪组织。仅去除脂肪组织，避免带入肌肉、皮肤或其他任何组织，并将其收集至含有 15 mL I 型胶原酶溶液（1.5 mg/mL）的 50 mL 圆锥形离心管中，置于冰上。将 I 型胶原酶溶解于含高糖和 1% 牛血清白蛋白（BSA）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，并通过 0.2 µm 注射器滤器过滤。</li>
	<li>使用无菌手术剪将脂肪组织剪成小块，然后在 37 °C 条件下，于旋转摇床（150 rpm）中用 I 型胶原酶溶液孵育 30 分钟进行消化（将含有脂肪和胶原酶的离心管水平放置，以增大振荡接触面积）。每 10 分钟检查一次消化情况，确保消化有效进行（可见组织降解），并防止过度消化（参见补充图 S1）。</li>
	<li>使用已预先高压灭菌的 200 µm 网筛注射器过滤，以去除未被胶原酶消化的组织。将滤器在离心管边缘轻压，尽可能使细胞进入溶液。加入 15 mL 冷的含 1% BSA 的 DMEM 以终止消化反应，并在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>吸除上层液体，其中包括成熟脂肪细胞和大部分液体层；注意避免触碰或扰动沉淀物。加入 20 mL 冷的含 2% 胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），重悬沉淀。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，先吸除上层以去除残留的脂肪细胞和脂质。将沉淀重悬于 1 mL 氯化铵-钾（ACK）裂解缓冲液中（用于裂解红细胞），冰上孵育 5 分钟。加入 10 mL 含 2% FBS 的 PBS，混匀后在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于 200 µL 抗 Fc 溶液中（用含 2% FBS 的 PBS 稀释纯化的抗小鼠 CD16/CD32 大鼠抗体至 1:150），以减少目的抗体通过 Fc 受体介导的非特异性结合。冰上孵育 5 分钟。将细胞悬液转移至适合预冷磁性细胞分选仪支架的 5 mL 管中，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 200 µL 抗体混合液，包括 CD31（PECAM-1）单克隆抗体（390）-生物素（1:100）和 CD45 单克隆抗体（30-F11）-生物素（1:100），充分混匀后冰上孵育 15 分钟（抗体稀释液使用抗 Fc 溶液；参见表 1）。加入 400 µL 含 2% FBS 的 PBS，混匀后在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。 
	注意：CD31 和 CD45 分别为内皮细胞和造血细胞的标志物。</li>
	<li>吸除上清液，在 100 µL 抗生物素微珠（1:5）中冰上孵育 15 分钟（抗体稀释液使用抗 Fc 溶液，参见表 1）。加入 400 µL 含 2% FBS 的 PBS，混匀后在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 350 µL 含 2% FBS 的 PBS 中。使用预分离滤器（70 µm）去除单细胞悬液中的细胞聚集体或大颗粒。首先用 100 µL 含 2% FBS 的 PBS 润洗滤器，然后将细胞悬液通过滤器过滤（收集至洁净离心管中），最后用 100 µL 含 2% FBS 的 PBS 冲洗滤器。</li>
	<li>使用磁性细胞分选仪，采用阴性分选策略进行细胞磁分离。
	<ol>
		<li>将样品置于预冷支架的位置 A（确保支架已预冷），在位置 B 和 C 分别放置两个空管，用于收集未标记细胞和标记细胞。</li>
		<li>在开启设备前，将洗涤缓冲液和运行缓冲液加入相应瓶中。将设备程序设置为使用DEPLETE方案进行磁性细胞分离。 
		注意：该方案适用于标准模式下的细胞耗竭，用于去除抗原正常表达的细胞（本实验中为被抗 CD31 和抗 CD45 标记的细胞），当以最高回收率为优先目标时使用。</li>
		<li>在分离界面中，选择待分离的样本数量，并选择DEPLETE方案。点击运行开始分离。程序结束后，收集未标记细胞，并在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL 生长培养基中（参见表 1）。</li>
	<li>将脂肪前体细胞（APCs）接种至已预先包被 2.5% 基底膜基质的一块 12 孔板中的一个孔内（每次可获得约 50,000–75,000 个细胞）。每孔加入 400 µL 2.5% 基底膜基质，使其完全覆盖孔底表面。吸除多余液体，仅保留薄层后，立即在超净工作台内（无盖）干燥至少 1 小时。随后在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。每 48 小时更换一次培养基，直至细胞达到 80% 汇合度。</li>
	<li>当细胞达到 80% 汇合度时，完全移除培养基，并用 350 µL 含 2% FBS 的 PBS 洗涤。加入 350 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在 37 °C 条件下消化 2 分钟。加入 2 mL 生长培养基终止消化，将细胞收集至新的 50 mL 圆锥形离心管中，然后在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将 APCs 传代至已预先包被 2.5% 基底膜基质的 12 孔板中（每孔接种 10,000–20,000 个细胞）。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。每 48 小时更换一次培养基，直至细胞达到 80% 汇合度。 
	注意：APCs 仅可传代一次。此后，其增殖和分化能力将丧失。APCs 分离流程参见补充图 S2。</li>
</ol>
2.&#160;脂肪细胞分化及胰岛素抵抗的诱导
注意：将细胞置于 37 °C、5% CO2&#160;条件下培养，更换培养基以及使用 TNF-α 和胰岛素处理等操作均须在无菌操作台内进行。
<ol>
	<li>当细胞融合度达到80%时，开始诱导分化；吸除所有生长培养基，每孔加入500 µL含3.3 nM骨形态发生蛋白（BMP4）的分化培养基（表1）。</li>
	<li>48小时后，更换为分化培养基（每孔500 µL）和分化诱导混合物（表1）。</li>
	<li>72小时后吸除培养基，每孔加入含100 nM胰岛素的新鲜分化培养基500 µL。 
	注意：细胞开始呈现圆形，并在胞内出现小脂滴。</li>
	<li>48小时后吸除分化培养基，每孔加入500 µL基础培养基-2% FBS（表1）；使用4 ng/mL TNF-α诱导胰岛素抵抗，设置未添加TNF-α的对照孔。</li>
	<li>孵育24小时后，在基础培养基-0% FBS（表1）中加入4 ng/mL TNF-α；对照孔不添加TNF-α。</li>
	<li>24小时后，通过加入100 nM胰岛素激活胰岛素信号通路，在37 °C、5% CO2条件下孵育15分钟。吸除培养基，用500 µL PBS洗涤。设置未添加胰岛素的对照孔。</li>
</ol>
3. 通过蛋白质印迹法评估胰岛素信号通路
<ol>
	<li>蛋白质提取与定量
	<ol>
		<li>用 500 µL PBS 清洗每个细胞孔，置于冰上，随后在 50 µL RIPA 裂解缓冲液中裂解细胞表1) 加入1%蛋白酶抑制剂混合物（在样品分离前立即添加）。用枪头刮取孔板表面全部内容物，将裂解液转移至0.6 mL微量离心管中（保持在冰上）。</li>
		<li>4 °C 条件下在旋转摇床上孵育 1 小时，&#160;涡旋混匀，8,000 × g 4 °C下离心15分钟，收集上清液（置于冰上保存）。</li>
		<li>使用 Bradford 法测定蛋白浓度（定量时不要稀释样品）。</li>
		<li>取相应体积的样品，使其蛋白含量为40–60 µg，加入6x Laemmli缓冲液进行变性表1）由&#160;在97 °C孵育15分钟，同时以550 rpm振荡。冻存备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
	<ol>
		<li>使用厚度为1.5 mm的7.5%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将凝胶插入电泳槽中，并加入电泳缓冲液表1).</li>
		<li>向凝胶的第一个孔中加入 3 µL 预染蛋白质标准品，随后将每个样品加入后续的孔中。</li>
		<li>以80 V电压电泳约15分钟，确保样品进入聚丙烯酰胺浓缩胶基质。随后将电压提高至90 V，持续电泳2.5小时，或直至37 kDa分子量标准蛋白在凝胶底部边缘可见。</li>
		<li>将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上，在半干式转移槽中以25 V电压转移35分钟。转移前，将凝胶、膜和滤纸浸入转移缓冲液中表1几分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹
	<ol>
		<li>转膜后，用含0.1%吐温20的Tris缓冲盐水（TBS-T 0.1%）洗涤膜表1）振荡 3 分钟，转速为 30 rpm。</li>
		<li>用封闭液封闭膜表14 °C下恒定旋转孵育1小时。</li>
		<li>根据分子量标记将膜切成三部分，分别在4 °C下以不同的初级抗体（用封闭液稀释）在恒定旋转条件下过夜孵育：Phospho-IRS1 (Tyr608) 抗体（1:1,000），预期条带位于180 kDa；Phospho-Insulin receptor β (Tyr1150/1151) 抗体（1:1,000），预期条带位于95 kDa；Phospho-Akt (Ser473) 抗体（1:1,000），预期条带位于60 kDa。</li>
		<li>用含0.1%吐温-20的TBS缓冲液洗涤膜，每次5分钟，共洗5次。</li>
		<li>将膜在室温下与相应的辣根过氧化物酶偶联的二抗（用封闭液稀释）孵育2小时，持续旋转：辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L）（1:5,000）。</li>
		<li>用含0.1% Tween-20的TBS缓冲液洗涤膜，每次5分钟，共洗5次。</li>
		<li>使用化学发光检测系统检测蛋白质。根据制造商说明书配制底物。</li>
		<li>将膜放入塑料袋中，加入200 µL化学发光底物，完全覆盖膜表面。去除多余底物，并排除任何气泡。</li>
		<li>在与化学发光兼容的高性能成像系统中，对每张印迹膜曝光30-60秒。</li>
		<li>剥离膜（参见 Western 印迹部分的步骤 10–13），以破坏抗体-抗原相互作用，从而允许硝酸纤维素膜重新杂交。回收膜，并用含 1% TBS-T 缓冲液在 50 rpm 条件下洗涤 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在 0.2 M NaOH 溶液中于 50 rpm 条件下孵育 7 分钟。</li>
		<li>用自来水在50 rpm条件下洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>用1% TBS-T溶液在50 rpm条件下洗涤10分钟。</li>
		<li>重复 Western blot 部分的步骤 2–9，使用 1:1,000 稀释度的抗-beta tubulin（55 kDa）抗体孵育膜，作为上样对照。</li>
		<li>进行光密度分析25&#160;使用 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/）对每种蛋白质进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文提供了一种利用经TNF-α处理的原代脂肪细胞培养体系研究胰岛素抵抗的方法。该模型的优势在于，原代脂肪细胞可在定义明确的条件下长期培养，并能严格控制细胞所处的环境因素26。实验周期为15至20天，尽管不同实验间脂肪细胞分化比例可能存在差异。与细胞系相比，原代脂肪细胞具有优势，因其未在体外持续扩增，更能真实反映其来源组织的细胞异质性27。此外，利用原代脂肪细胞可研究来自不同生理-病理背景供体的细胞，例如瘦型与肥胖型、男性与女性、年轻与年老个体，以及来自不同脂肪组织部位的细胞。该方法的另一优势在于，可在分离前脂肪细胞（APCs）后，建立来自CRE和基因敲除小鼠的细胞系。
在 APCs 的分离与分化过程中，一个可能的问题是这些细胞可能会失去分化能力，这种情况很可能在分化过程开始时细胞融合度超过 80% 时发生。培养基的更换也应非常轻柔，尤其是在脂质积累之后，因为已分化的脂肪细胞容易从培养皿上脱落。此外，每一批次的胶原酶都必须检测其消化效率、细胞得率以及细胞毒性<sup class="xref...

胰岛素是由胰岛β细胞产生的一种合成代谢激素，是调节葡萄糖和脂质代谢的关键因子。在众多功能中，胰岛素可调节葡萄糖摄取、糖原合成、糖异生、蛋白质合成、脂质生成以及脂解作用1。胰岛素与其受体（IR）结合后最初的分子信号是激活IR内在的酪氨酸蛋白激酶活性2，导致其自身磷酸化3&#160;，并继而激活一类被称为胰岛素受体底物（IRS）的蛋白质家族；这些底物与衔接蛋白结合，引发一系列蛋白激酶的级联激活4。胰岛素激活两条主要的信号通路：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）&#160;和Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）。前者构成一个主要的分支点或节点4,5&#160;，可激活多种下游效应分子，参与包括能量物质稳态调节在内的多种生理功能；而后者则主要调控细胞生长与分化4,6。胰岛素的作用最终取决于细胞类型及生理环境7。
胰岛素响应性代谢组织之一是脂肪组织。白色脂肪组织是人类和啮齿类动物体内最丰富的脂肪类型，分布于皮下脂肪（位于皮肤与肌肉之间）和内脏脂肪（围绕在腹腔器官周围）。由于体积较大，脂肪细胞（即脂肪细胞）是脂肪组织中最主要的细胞类型。这些脂肪细胞可以是棕色/米色（具有产热功能）、粉色（存在于乳腺中）以及白色8,9。白色脂肪细胞以甘油三酯的形式储存机体主要的能量储备，这一过程依赖于胰岛素。胰岛素促进葡萄糖转运和脂质合成，同时抑制脂肪分解（即脂解作用）7,10。此外，胰岛素还能促进前脂肪细胞向成熟脂肪储存细胞分化11。
当正常的胰岛素水平产生减弱的生物学反应时，就会发生胰岛素抵抗，从而导致代偿性高胰岛素血症12。胰岛素抵抗是一种与超重和肥胖相关的病理状态5，当两者共同存在时，可导致2型糖尿病（T2D）及其他代谢性疾病13。高胰岛素血症通过代偿外周组织中的胰岛素抵抗，以维持正常的血糖水平14。然而，最终β细胞功能丧失或衰竭，加上胰岛素抵抗进一步加重，会导致血糖水平升高，符合2型糖尿病的诊断标准5。因此，胰岛素抵抗和高胰岛素血症可能促进由肥胖引发的代谢性疾病的进展15。此外，肥胖可能引起慢性低度局部炎症，从而促进脂肪组织中的胰岛素抵抗15,16,17。另外，肥胖引起的脂肪组织改变，如纤维化、炎症反应，以及血管生成和脂肪生成减少，会导致血清脂联素水平降低（脂联素为胰岛素增敏因子），并增加纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）、游离脂肪酸和外泌体等因子向血液中的释放，进一步加剧胰岛素抵抗17。
胰岛素抵抗背后的许多机制仍不明确。体外和体内模型已被开发用于研究主要靶组织（包括脂肪组织）中介导胰岛素抵抗的机制。体外模型的优势在于研究人员能够更好地控制环境条件，并可在特定细胞类型中评估胰岛素抵抗。特别是脂肪细胞前体细胞（APCs）具有供体组织的个体表型特征，可能比脂肪细胞系更能反映生理状态。在体外诱导胰岛素抵抗的一个主要因素是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。TNF-α是一种由脂肪组织中的脂肪细胞和巨噬细胞分泌的促炎性细胞因子18。尽管其在脂肪组织正常重塑和扩张过程中具有必要作用19，但长期暴露于TNF-α可在体内导致脂肪组织的胰岛素抵抗，也可在体外诱导脂肪细胞的胰岛素抵抗20。对多种细胞类型进行慢性TNF-α处理会导致胰岛素受体（IR）和胰岛素受体底物-1（IRS-1）的丝氨酸磷酸化水平升高，从而抑制其酪氨酸磷酸化21。IRS-1丝氨酸残基的磷酸化增加会抑制IR的酪氨酸激酶活性，可能是慢性TNF-α处理损害胰岛素作用的关键机制之一22,23。TNF-α可激活涉及核因子κB激酶β（IKKβ）这一丝氨酸/苏氨酸激酶以及c-Jun氨基末端激酶（JNK）的信号通路24。JNK不仅诱导复杂的促炎性转录程序，还可直接磷酸化IRS-16。
了解胰岛素抵抗的发病机制对于指导未来针对2型糖尿病（T2D）的治疗策略开发日益重要。前脂肪细胞（APCs）已被证实是研究脂肪细胞生物学（包括对胰岛素的敏感性与抵抗性）以及识别脂肪细胞在脱离系统环境影响下固有特性的理想模型。APCs可从不同脂肪组织库中轻松获取，并在适当条件下分化为成熟脂肪细胞。利用该方法，可在脂肪细胞中直接评估对胰岛素抵抗/敏感性的影响。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;1. 小鼠脂肪细胞前体细胞的分离&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>抗生物素微珠&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>抗CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro 分离仪</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>基底膜基质（Matrigel）</td><td>康宁</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45单克隆抗体（30-F11）－生物素&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 1 型</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM低糖培养基</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS 混合物</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>亚油酸-白蛋白</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 培养基</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>生长因子</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>预分离滤器（70 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16 / CD32&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;2. 脂肪细胞分化与胰岛素抵抗诱导&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>分化诱导剂混合物</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>分化诱导剂混合物</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>分化诱导剂混合物</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>罗格列酮</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>分化诱导剂混合物</td></tr><tr><td>TNF&amp;alpha;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>210-TA-005&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;3. 通过蛋白质印迹法评估胰岛素信号通路&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗β微管蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>161-0404</td><td>Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>FluorChem E 系统</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>运行与转膜缓冲液</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>转移缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>NaOH&amp;nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>Na₃VO₄</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1706404</td><td>封闭液</td></tr><tr><td>预染蛋白质标准品&amp;nbsp;</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>杰克逊免疫研究公司</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化胰岛素受体 &amp;beta;&amp;nbsp;</td><td>细胞信号传导</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 Akt（Ser473）抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 IRS1（Tyr608）抗体</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖&amp;nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>RIPA缓冲液</td></tr><tr><td>SDS</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>1610302</td><td>跑胶与Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>跑胶、转膜与Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>RIPA缓冲液 - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

原代培养中分化的鼠脂肪细胞：胰岛素抵抗模型

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

胰岛素抵抗是指胰岛素对其靶细胞的作用减弱，通常源于胰岛素受体信号传导的下降。胰岛素抵抗参与了2型糖尿病（T2D）及其他在全球范围内高发的肥胖相关疾病的发生发展。因此，阐明胰岛素抵抗的潜在机制具有重要意义。已有多种模型被用于研究胰岛素抵抗 体内 和 体外；原代脂肪细胞是研究胰岛素抵抗机制、鉴定可拮抗该状态的分子以及胰岛素增敏药物分子靶点的理想选择。本文中，我们建立了使用经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理的培养原代脂肪细胞构建胰岛素抵抗模型的方法。
通过磁性细胞分离技术，从小鼠皮下脂肪组织经胶原酶消化后分离获得脂肪细胞前体细胞（APCs），并将其分化为原代脂肪细胞。随后，使用促炎性细胞因子TNF-α处理以诱导胰岛素抵抗，该因子可降低胰岛素信号通路中相关蛋白的酪氨酸磷酸化/活化水平。通过蛋白质印迹法（western blot）定量检测胰岛素受体（IR）、胰岛素受体底物（IRS-1）和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平下降情况。该方法为研究介导脂肪组织中胰岛素抵抗的分子机制提供了优良工具。

近年来，肥胖症和2型糖尿病（T2D）患病率的上升促使人们深入研究介导脂肪组织胰岛素抵抗的机制。通过本文所述的实验方案，可将脂肪前体细胞（APCs）诱导分化为成熟脂肪细胞，以评估其胰岛素抵抗与敏感性。当APCs达到融合状态后，需10天时间完成向成熟脂肪细胞的分化，并通过TNF-α诱导产生胰岛素抵抗（图1）。
APCs 呈现成纤维细胞样的形态，表现为扁平且细长的形状，并在接种后 48 小时内完成对培养板的贴壁（图 2A）。APCs 需要 2–5 天达到 80% 汇合度（具体时间取决于接种的细胞数量），此时通过加入诱导分化培养基启动分化过程（图 2A）。在接下来的 6–8 天内，开始出现成熟的脂肪细胞。分化后的脂肪细胞具有圆形的形态特征，并在细胞内积累脂滴。在分化过程结束时，多达 80% 的细胞完成分化（图 2B）。
<p class="jov...

本方案描述了从小鼠皮下脂肪中分离前脂肪细胞、将其分化为成熟脂肪细胞以及诱导胰岛素抵抗的方法。通过蛋白质印迹法检测胰岛素信号通路中相关蛋白的磷酸化/活化水平，以评估胰岛素作用。该方法可直接测定原代脂肪细胞中的胰岛素抵抗/敏感性。

胰岛素抵抗是指胰岛素在其靶细胞上的作用减弱，通常源于胰岛素受体信号传导下降。胰岛素抵抗……

胰岛素抵抗可以在原代脂肪细胞中进行评估，从而研究不同生理病理条件下供体的情况，例如瘦型与肥胖型，或来自不同脂肪沉积部位的细胞。原代脂肪细胞保留了其许多内在特性，并可在定义明确的条件下长期培养，同时对细胞环境因素进行严格控制。启动分化过程时，细胞汇合度必须达到80%。如果细胞在较低或较高的融合度下开始分化，则其分化能力会减弱或丧失。处死动物后，用70%乙醇擦拭小鼠进行消毒。从小鼠体内分离腹股沟皮下脂肪组织，并将其收集至含有15毫升冰上预冷的I型胶原酶溶液的15毫升锥形管中。使用无菌手术剪将脂肪组织剪成小块，加入I型胶原酶溶液，在37摄氏度、150转/分钟的摇床中孵育30分钟以消化样品。每10分钟检查一次消化情况，确保消化充分并防止过度消化。使用200微米孔径的筛网注射器过滤，去除未被胶原酶消化的组织，并将滤器在离心管边缘轻压，使尽可能多的细胞进入溶液中。加入15毫升冷的含1% BSA的DMEM以终止消化，在4°C下以400 × g离心10分钟。吸除上层含有成熟脂肪细胞和大部分液体的部分。加入20毫升冷的含2% FBS的PBS，重悬沉淀。再次离心5分钟后，通过抽吸上层液体去除上清液，以清除残留的脂肪细胞和脂肪。将沉淀物重悬于1毫升ACK裂解缓冲液中，在冰上孵育5分钟。加入10毫升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液，混匀。离心5分钟后吸除上清液，将沉淀重悬于200微升抗FC溶液中。冰上孵育5分钟，然后将细胞悬液转移至适合放入预冷磁性细胞分选仪支架的5毫升试管中。离心5分钟后弃去上清液，加入200微升CD31单克隆抗体生物素和CD45单克隆抗体生物素的混合液，充分混匀后冰上孵育15分钟。然后加入400微升含2% FBS的PBS缓冲液，在4摄氏度下以400 × g离心5分钟。吸弃上清液，加入100 µL抗生物素微珠，在冰上孵育15分钟。加入400 µL含2%FBS的PBS，于4°C下以400 ×g离心5分钟，操作如前所述。弃去上清液后，将沉淀重悬于350 µL含2%FBS的PBS中。为了从单细胞悬液中去除细胞聚集体或大颗粒，使用70微米的预分离滤膜，先用100微升含2%FBS的PBS润洗滤膜。将细胞悬液通过滤膜过滤，并收集到干净的离心管中。随后用100微升含2%FBS的PBS洗涤滤膜。采用阴性分离策略进行细胞磁分离时，将样品置于预冷架的 A 位，在 B 位和 C 位各放置一个空管，用于收集未标记细胞和标记细胞。然后将洗涤缓冲液和运行缓冲液分别加入对应的瓶子中。在分离步骤中，选择待分离样品的数量，并选择去除（deplete）程序。按下运行并开始分离。程序结束后，收集未标记的细胞。接下来，通过向每个孔中加入400微升2.5%的基底膜基质，使其覆盖每个孔的整个表面，从而对12孔板进行包被。吸除多余溶液，将培养板置于超净工作台中干燥至少一小时。离心五分钟并弃去上清液后，将沉淀物重悬于500 µL生长培养基中。将脂肪细胞前体细胞（APCs）接种至已预先包被2.5%基底膜基质的12孔板的一个孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育，并每48小时更换一次培养基，直至细胞达到80%融合度。完全移除培养基后，用350微升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液洗涤细胞。加入350微升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度下消化2分钟以收集细胞，随后加入2毫升生长培养基终止消化。将细胞收集至新的50毫升锥形管中，在400 G条件下离心5分钟。将抗原呈递细胞传代至预先包被2.5%基底膜基质的12孔板中，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。每隔48小时更换一次培养基，直至细胞达到80%融合度。当细胞融合度达到80%时，吸除任何生长培养基，并替换为每孔500微升的分化培养基，其中含有3.3纳摩尔的骨形态发生蛋白。48小时后，将培养基更换为每孔500微升的分化培养基及分化诱导混合物。72小时后移除培养基，并在500微升新鲜分化培养基中加入100纳摩尔的胰岛素。48小时后，使用每毫升4纳克的肿瘤坏死因子α（TNFα）诱导胰岛素抵抗。吸除任何分化培养基，并替换为500微升含2%FBS和TNFα的简单培养基。在培养24小时后，在不含FBS的简单培养基中加入每毫升4纳克的TNFα。24小时后，通过加入100纳摩尔胰岛素激活胰岛素信号通路，并在37摄氏度、5%二氧化碳气氛中孵育15分钟，如前所示。孵育结束后，移除培养基，并用500微升PBS洗涤，包括一个未加胰岛素处理的对照孔。提取蛋白质，并通过Western blot检测胰岛素信号通路标志物的磷酸化水平。本图展示了在12孔培养板中诱导分化前达到80%融合度的皮下脂肪细胞前体细胞，以及诱导分化7天后的原代脂肪细胞。肿瘤坏死因子α（TNF alpha）诱导的胰岛素抵抗表现为皮下原代脂肪细胞中胰岛素诱导的胰岛素受体、胰岛素受体底物1（IRS-1）以及蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平降低。通过使用抗磷酸化胰岛素受体抗体、抗磷酸化胰岛素受体底物1抗体、抗磷酸化AKT抗体进行膜染色，以抗β-微管蛋白抗体作为上样对照。通过化学发光检测对信号进行可视化。此处展示的是三次独立实验的代表性印迹图及定量结果。在进行该实验操作时，需注意一个关键点：使用TNFα诱导胰岛素抵抗时，应先在含2%FBS的培养基中处理24小时，随后在无FBS（0%FBS）的培养基中继续处理24小时。

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

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JoVE Journal

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生物学

原代培养中分化的小鼠脂肪细胞:胰岛素抵抗模型

本视频展示了骨髓基质细胞（BMSCs）向脂肪细胞的分化过程。该过程分为两步：在特定生长因子和激素存在下，未分化的BMSCs首先分化为前脂肪细胞；第二步通过葡萄糖和胰岛素处理，最终形成含有多个脂滴的成熟脂肪细胞。...

体外小鼠骨髓基质细胞向脂肪细胞的分化

从小鼠白色脂肪组织中分离得到的原代白色前脂肪细胞可分化为米色/褐色样细胞。本文介绍了一种可靠的细胞模型系统，用于研究白色脂肪“褐变”的分子调控机制。...

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一种用于研究蛋白质和微小RNA调控对脂肪细胞功能影响的脂肪细胞培养模型

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从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

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本方案描述了从小鼠脂肪组织中半自动化分离基质血管组分（SVF）以获取前脂肪细胞并实现脂肪细胞分化的步骤...

使用组织解离仪半自动化分离小鼠白色脂肪组织中的基质血管组分

成熟脂肪细胞的尺寸和脆弱性限制了可用于其研究和分离的技术与工具。本文介绍了一种分离成熟小鼠脂肪细胞的方案，该方案可轻松适用于不同的脂肪组织库和小鼠饮食模型。...

从瘦型与肥胖型小鼠中分离和培养原代小鼠脂肪细胞

本实验方案描述了一种分离和培养小鼠耳蜗柯蒂器官（可选择性保留或去除螺旋缘和螺旋神经节神经元）的方法。我们还展示了通过电穿孔技术在柯蒂器官外植体中表达外源报告基因的方法。...

小鼠耳蜗柯蒂氏器的原代培养与质粒电穿孔转染

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内...

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

学习小鼠原代脂肪细胞分化与胰岛素抵抗模型的建立方法。本实验通过分离皮下脂肪前体细胞，诱导其分化为成熟脂肪细胞，并利用TNF-α诱导胰岛素抵抗，最终通过蛋白质免疫印迹分析胰岛素信号通路磷酸化水平，为代谢疾病研究提供可靠的细胞模型。

原代培养中分化的鼠脂肪细胞：胰岛素抵抗模型

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