使用一步水相交联共纳米聚合方法合成刺激响应性纳米凝胶

本方案通过一步交联共聚技术，在温和的水相反应条件下，实现了小于100纳米的载蛋白纳米凝胶的合成，代表了该领域的重要进展。该技术的主要优势在于能够在温和条件下合成载蛋白纳米凝胶，避免使用剧烈的有机溶剂和高温，从而保持生物活性成分的完整性。首先，使用过滤后的去离子水清洗玻璃器皿。

为干燥玻璃器皿，将一个牢固的喷嘴连接到通风橱侧面的压缩空气出口。用手握紧小瓶，将喷嘴插入瓶内，打开压缩空气，释放出受控的气流。接着，取一个10毫升玻璃小瓶，加入去离子水，并用橡胶隔垫密封。

为了去除水中的氧气，先用氮气充满一个气球，并在气球上安装一根针头。将气球置于隔膜上方，刺穿橡胶隔膜以使氮气流入。同时，在烧瓶上安装一根排气针，以保持持续稳定的氮气流。

接下来，将 BSA 或 Cy7 标记的 BSA 溶解于脱氧去离子水中。然后将该溶液加入一个洁净的 10 毫升玻璃小瓶中。向烧瓶中加入 AETC 溶液，并用另一块橡胶隔垫密封。

将丙烯酰胺和脱氧去离子水溶解后，加入小瓶中的混合物中。然后将二硫交联剂溶解于去离子水中，并将其加入小瓶中的混合物。用氮气冲洗该混合物20分钟。

随后，将SDS溶解于脱氧去离子水中。使用经氮气冲洗的注射器将其加入混合物中。接着，向反应混合物中加入TEMED。

在持续通入氮气的条件下，使混合物脱氧三分钟。将过硫酸铵溶于1毫升脱氧去离子水中，然后加入反应混合物中。随后在氮气氛围下密封烧瓶，并在室温下搅拌混合物3小时30分钟。

为了终止反应，从烧瓶上移除密封盖。当混合物变为澄清且无色时，反应即告完成。为了纯化纳米凝胶，将反应混合物加入一个15毫升的离心过滤装置中。

用去离子水填充离心单元，并进行离心以去除未反应的化学物质或未包封的载荷。在离心单元中加入 2 mL 去离子水以稀释纳米凝胶样品。将最终样品储存在 2 至 8 °C 条件下，以防止包封的蛋白质降解。

取一个比色皿或一次性折叠毛细管池用于分析。先用滤过的去离子水清洗，再用压缩空气吹扫，以去除任何较大的灰尘颗粒。然后向比色皿中加入50至100微升样品，并用750至1,000微升滤过的去离子水稀释。

将比色皿插入DLS仪器时，打开样品室盖，捏住比色皿顶部边缘，避免在光学窗口留下指纹。将比色皿正确对准仪器的光路位置。然后关闭样品室，以隔绝环境光。

使用DLS仪器上的相关软件开始粒径测量。测量完成后，选择与样品相关的结果，包括Z均粒径、平均多分散系数（PI）、每分钟计数率、zeta电位及相关图形。确认相关函数显示平滑的S形曲线，表明样品均一。

分析完成后，小心地从DLS仪器中取出比色皿。观察到与BSA蛋白相关的峰强度逐渐降低，表明蛋白已被包封在纳米凝胶结构内部。对载有Cy7标记BSA的纳米凝胶进行理化表征，结果显示在50至100纳米处出现单一明确的峰。

然而，空载纳米凝胶表现出不一致且较大的粒径。在48小时内，多达86%的Cy7标记BSA被释放。另一方面，未添加谷胱甘肽的对照实验仅导致15%的蛋白质释放。

傅里叶变换红外光谱分析显示，在纳米凝胶合成过程中分离出的牛血清白蛋白（BSA）以及经谷胱甘肽孵育后的BSA均保持了其结构完整性，表现为在1,662 cm⁻¹处出现代表完整β转角的特征峰。然而，储存30天后的纳米凝胶中提取的BSA在1,613 cm⁻¹处出现新峰，提示存在分子间β片层结构及蛋白质聚集现象。圆二色光谱显示其光谱特征与天然BSA相似，表明α螺旋结构得以保留。

然而，30天后分离的BSA特征峰出现轻微畸变，表明存在一定程度的聚集。保持持续的氮气流对于防止氧气抑制自由基聚合反应至关重要。此外，引发体系各组分需迅速加入，以确保合成成功。

经过该步骤后，可通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）以及与生理还原剂谷胱甘肽孵育来评估氧化还原响应性，进一步表征纳米凝胶的粒径分布、形态及载药释放动力学。