Name: 使用水性一步交联和共纳米聚合合成刺激响应纳米凝胶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学习水性一步交联共聚合法合成亚100纳米蛋白质负载纳米凝胶。该方法在温和水相条件下进行，避免使用有机溶剂和高温，有效保护生物活性物质的完整性，适用于生物制剂递送研究。

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感谢伦敦帝国理工学院化学系和英国医学研究理事会生命科学研究所提供的支持。

1. 氧化还原响应性交联剂的合成
<ol>
	<li>加入2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐（44.79 mg，0.270 mmol）和三乙胺0.063 mL至3 mL无水二氯甲烷中，在惰性氮气氛围下搅拌混合20 min2 25 mL 圆底烧瓶中的气体。</li>
	<li>溶解4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,44,47,50,53-十六氧杂-28,29-二硫代六十五烷二酸二-N-琥珀酰亚胺酯（100 mg，0.045 mmol）溶于1 mL无水二氯甲烷中，加入反应瓶。</li>
	<li>向烧瓶中加入 4 mL 无水二氯甲烷。用铝箔包裹反应烧瓶，并在 N₂ 氛围下搅拌留置2 在室温下</li>
	<li>通过薄层色谱法确认产物生成。采用该方法确认产物生成时，应确保起始物料的正确对照。
	<ol>
		<li>薄层色谱是一种基于亲和性的方法，用于从反应混合物中分离目标化合物。在此实验中，使用高极性且具有吸附性的硅胶板作为固定相。将起始原料样品和反应混合物样品点样于硅胶板的一端，然后将硅胶板垂直放入含有洗脱剂（流动相：5% 甲醇 : 二氯甲烷）的密闭玻璃烧杯中。</li>
		<li>通过毛细作用，流动相沿硅胶板向上移动，样品中的各组分因其对固定相和流动相的亲和力不同而迁移不同的距离。当溶剂前沿迁移至板长的3/4时th 的平板，取下平板并晾干。分离的化合物在平板上呈现为斑点。测定保留因子（Rf) 目标化合物的比移值（Rf）计算公式为：化合物迁移距离除以溶剂迁移距离。此处，Rf 产物的比移值为0.35。可使用紫外光或染色法（高锰酸钾）显色以观察斑点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浓缩混合物 真空条件下 通过快速柱层析纯化（等度洗脱体系：5% 甲醇:二氯甲烷）36将反应混合物加至填充有硅胶（固定相）的玻璃柱顶端，然后用溶剂体系（流动相）洗脱。36收集所有馏分，并使用薄层色谱法（TLC）进行分析，根据先前确定的Rf值区分产物馏分。f 值</li>
	<li>使用旋转蒸发仪（温度：）蒸发溶剂，浓缩纯化后的组分。 40 °C），将真空压力调至大气压，先除去低沸点的二氯甲烷。当溶剂液面不再下降时，将真空压力调至337 mbar，以除去甲醇，得到淡黄色油状物，随后对该产物进行进一步表征以确认目标产物的生成37.</li>
	<li>进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析38, 1H NMR（在氘代二甲基亚砜（DMSO-d6))39, 13C 核磁共振39 基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-ToF）40 在进行后续步骤之前，进行分析以确认产物的形成。
	<ol>
		<li>进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析时，将1 mg油样加载至仪器中以获取光谱。</li>
		<li>对于核磁共振（NMR）分析，将10 mg产物重新溶解于0.75 mL相应的NMR溶剂中，转移至NMR管内并密封严实，防止泄漏。将样品装入NMR仪器后，采集谱图。39.</li>
		<li>进行质谱分析时，将1 mg产物密封于样品瓶中，用DMSO溶解后上机检测。 
		注：红外分析可提供目标产物中关键官能团的信息，即通过在 1650 cm⁻¹ 处的尖锐峰所识别的羰基伸缩振动（C=O）。-1 表明酰胺键的形成，从而凸显产物的生成。该 1H NMR 和 13C可提供有关化学环境的信息，因此可通过鉴定化合物中存在的化学环境来确定目标产物的化学组成。最后，质谱法可用于验证目标产物的精确质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用谷胱甘肽检测二硫交联剂的裂解
<ol>
	<li>将二硫交联剂（终浓度为 4.55 mg/mL）与还原剂谷胱甘肽（终浓度 [GSH]：10 mM）在 1.5 mL 玻璃小瓶中混合，总体积为 1 mL，孵育 24 小时。</li>
	<li>为确认二硫键连接子的断裂，将小瓶送样进行 MALDI-ToF 分析26,40。</li>
</ol>
3. 氧化还原响应性纳米凝胶的合成
<ol>
	<li>确保所有用于反应的玻璃器皿均无灰尘，使用过滤的（0.20 µm) 去离子水，随后使用通风橱侧面的压缩空气接口吹干玻璃器皿。在压缩空气出口处连接一个牢固的喷嘴以方便操作。牢固握住小瓶，并将喷嘴插入其中。打开压缩空气，向小瓶内释放一股可控的气流。观察整个过程，确保有效干燥，并检查是否存在任何残留污染物或水分。</li>
	<li>用去离子水填充一个10 mL玻璃小瓶，并用橡胶隔垫密封。通过向水中通入N₂气泡以去除氧气。2 在开始反应前，需先让氮气通过至少30分钟。为此，用氮气充满一个气球2 气体，并在气球上连接一根针；将气球置于隔膜上，用针刺穿橡胶隔膜，使 N2 流。将一个出口针头连接到烧瓶上，以确保 N₂ 持续流动2.</li>
	<li>将牛血清白蛋白（BSA；2 mg，30 nmol）或Cy7标记的BSA（2 mg，30 nmol）溶解于1 mL脱氧去离子水中，加入另一洁净的10 mL玻璃小瓶中。</li>
	<li>加入[2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵（AETC）溶液（12.00 mg/10.86 µL，0.060 mmol）加入烧瓶中，并用另一个橡胶隔垫密封。确保反应混合物始终保持在持续的 N₂ 气流下2 通气并搅拌30分钟。</li>
	<li>将丙烯酰胺（9.21 mg，0.13 mmol）溶于1 mL脱氧去离子水中，然后加入小瓶中的混合物。</li>
	<li>将二硫交联剂（4.44 mg，0.004 mmol）溶于1 mL去离子水中，加入小瓶中的混合液。用N₂吹洗混合液2 气体处理20分钟。</li>
	<li>将十二烷基硫酸钠（2 mg，0.007 mmol）溶于1 mL脱氧去离子水中，通过N2 用惰性气体冲洗注射器，并搅拌混合物30分钟。 
	注意：通过用 N 冲洗注射器2 我们尽量减少反应混合物暴露于大气中的氧气，以避免抑制自由基聚合反应。</li>
	<li>添加 N,N,N',N'-四甲基乙二胺（1.5 µL，0.010 mmol）并让反应混合物在 N₂ 下脱氧 3 分钟2 气体</li>
	<li>将过硫酸铵（1 mg，0.004 mmol）溶于1 mL脱氧去离子水中，加入反应混合物。确保 N2 气体通入反应混合物中持续10分钟。 
	注意：如果 N2 若省略加样步骤，反应瓶中很可能形成白色颗粒物。这些颗粒物尺寸较大，可能为聚集体，会干扰后续的任何表征分析。</li>
	<li>在 N₂ 氛围下密封烧瓶2 在常温下于惰性气氛中搅拌反应3小时30分钟。</li>
	<li>为终止反应，移去烧瓶的密封装置，使反应混合物继续搅拌至少10分钟。此举将使反应混合物暴露于大气水平的O₂中。2 气体，从而淬灭反应混合物中任何残留的自由基。当混合物呈现清澈的蓝色乳光外观时，反应结束。</li>
	<li>为纯化纳米凝胶，将反应混合物加入15 mL离心过滤单元（100 kDa截留分子量），并加入去离子水至充满离心单元。在1000 ×g条件下离心反应混合物 x g 10分钟，以去除分子量小于100 kDa的未反应化学物质（或未包封的载荷），并浓缩纳米凝胶样品。</li>
	<li>当离心单元中的水位降低后，加入 2 mL 去离子水稀释纳米凝胶样品，并离心以浓缩产物。重复此步骤 3 次。</li>
	<li>将样品储存在 2-8 °C 以防止包封蛋白的降解。</li>
	<li>进行FT-IR和 1H NMR（在氘代二甲基亚砜（DMSO-d6））分析以确认聚合反应39,41取1 mL纳米凝胶溶液置于1.5 mL样品瓶中，冷冻干燥以制备样品。冷冻干燥过程包括将样品冻结，随后施加真空，使冻结的溶剂通过升华去除，留下粉末状残余物。冷冻干燥后，将样品溶于相应的核磁共振（NMR）溶剂中，转移至NMR样品管并严密封口。按照前述方法将样品装入NMR仪器中进行检测。39对于傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，应将1 mg干燥粉末样品装入仪器以获取光谱。</li>
</ol>
4. 纳米凝胶形态学表征
<ol>
	<li>动态光散射（DLS） 
	注意：使用DLS仪器在25 °C、632.8 nm激光波长和173°信号检测器条件下测量流体动力学直径（nm）、多分散指数（PI）和zeta电位。每次运行包含25次子扫描循环。
	<ol>
		<li>流体动力学尺寸（nm）测量
		<ol>
			<li>使用过滤的去离子水清洗比色皿或一次性折叠毛细管池，然后向比色皿中吹入压缩空气（适用于DLS和zeta电位测量），确保其无大颗粒灰尘污染。</li>
			<li>向比色皿中加入至少50–100 µL样品，并用750–1000 µL过滤的去离子水稀释。使用zeta电位比色皿时，应确保样品填充过程中无气泡产生，以免干扰测量结果。</li>
			<li>将比色皿放入DLS仪器中，确保正确插入。操作时打开DLS仪器的样品室盖，用手握住比色皿顶部边缘，避免在光学窗口留下指纹。确保比色皿稳固地放置在比色皿架中，水平并对准仪器的光路。关闭样品室以防止环境光干扰。 
			注意：稀释介质使用孔径为0.45 µm的注射器滤膜过滤。</li>
			<li>点击相应DLS仪器软件以启动粒径测量。</li>
			<li>选择与样品对应的结果，获取z-平均值（平均粒径）、平均PI、每秒千计数（kcps）、zeta电位及相关图形。确保相关函数呈现平滑的S形曲线，这表明样品均一。</li>
			<li>分析完成后，从DLS仪器中取出比色皿。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）
	<ol>
		<li>取10 µL纳米颗粒溶液（0.077 mg/mL）滴加到碳支持的铜网上，室温下空气中干燥1小时。</li>
		<li>用过滤的去离子水清洗铜网，并用5 µL过滤的1%醋酸铀水溶液染色2分钟。</li>
		<li>用滤纸吸去多余染色液后，室温下过夜干燥。次日使用明场相机在45,000倍放大倍数下采集TEM图像。</li>
		<li>使用配套软件进行图像处理（分辨率：2048 x 2048像素）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 采用微量双环己酮草酰二腙（BCA）法测定纳米凝胶包封蛋白（BSA）的含量
<ol>
	<li>根据微BCA法测定试剂盒说明书（制造商网站提供）中的实验方案，基于预定义的蛋白质浓度绘制标准曲线42.</li>
	<li>合成后，使用截留分子量为100 kDa的15 mL离心过滤装置（1000 x g, 10 分钟），具体步骤如 3.12–3.14 所述。</li>
	<li>收集滤液，并使用microBCA法（方案见试剂盒生产商网站）进行分析。使用酶标仪在562 nm处测定吸光度。由于该测定值与未包封蛋白浓度相关，据此计算包封蛋白的质量。包封效率（EE）%的计算公式如下： 
	<img alt="包封率计算公式，%EE = (测得的蛋白质量 / 加入的蛋白质量) × 100，方程" src="/files/ftp_upload/63981/63981eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"></li>
</ol>
6. 在谷胱甘肽存在下定量测定纳米凝胶的蛋白质释放
<ol>
	<li>孵育 200 µL 5 mg/mL 载有 Cy7BSA 的纳米凝胶 200 µL 10 mM 谷胱甘肽（GSH）加入至 0.5 mL 离心过滤单元（100 kDa MWCO）中。将过滤单元置于水浴中以维持温度 37 °C.</li>
	<li>以 1000 离心 x g 每10分钟一次，每次3分钟，持续至少1小时，之后每2-8小时一次。</li>
	<li>收集滤液并用于后续分析。保持滤液体积在离心过滤装置中 500 µL 通过添加更多的去离子水或 PBS。</li>
	<li>通过参考Cy7BSA负载纳米凝胶的标准曲线，使用NanoDrop仪器在750 nm处测定滤液中荧光蛋白的吸光度，从而测量滤液中的蛋白含量。 
	注意：可通过配制浓度范围为 0 mg/mL 至 2 mg/mL 的 Cy7BSA 系列稀释液来绘制该标准曲线。纳米分光光度计测得的数值可据此标准曲线插值，以确定包封效率。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。无任何财务细节需要声明。

生物制药行业对靶向特异性生物制剂日益增长的需求推动了对能够提升其性能技术的需求 体内 药理学特性，同时防止其在生理条件下的快速降解，并抵消任何不良副作用。基于此，本文描述了一种制备载蛋白纳米凝胶的简便合成方法。如实验方案所示，在进行纳米凝胶合成之前，需先合成氧化还原响应型交联剂。随后加入其余关键单体，并在添加十二烷基硫酸钠（SDS）后 原位 由自由基聚合引发 N,N,N',N'四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（APS）。高溶解性的丙烯酰胺（AM）可在水相环境中维持纳米凝胶的稳定性，2-丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵（AETC）盐可维持目标蛋白载荷的静电模板作用，并减少其过早释放26此外，聚乙二醇二硫代二丙烯酸酯交联剂可实现有效载荷的可控释放28,32随后通过纯化方法去除SDS，包括用去离子水洗涤三次后离心，或透析。
全球许多研究人员已采用多种不同的合成策略制备了聚合...

纳米凝胶是一类三维、亚微米级的水凝胶，具有交联的聚合物网络结构，能够在其核壳结构中容纳大量液体，同时不破坏其形态完整性1。通常，纳米凝胶通过在非均相胶体体系（如油包水反相微乳液）中，采用物理或化学交联方式对功能单体进行聚合而合成2,3。两亲性共聚物可在水性环境中自组装形成纳米级结构。然而，这些结构必须通过化学交联策略加以稳定，例如引入二硫键或基于酰胺的偶联反应、点击化学，或通过物理手段（如疏水作用、静电作用或氢键作用）以及光诱导方式进行稳定4。在这些策略中，先通过物理自组装形成聚合物结构，再进行化学交联的方法已被证实为一种成功的纳米凝胶制备技术5。尽管历史上首个纳米凝胶由Vingradov等人6、Akiyoshi等人7和Lemieux等人8于20世纪90年代提出，但近年来，已开发出多种由天然和合成聚合物组成的智能纳米凝胶，并被广泛探索用于各类生物医学应用9。
纳米凝胶具有强大的载物保留能力、较大的比表面积、体内稳定性，以及可定制的化学和机械性能10。纳米凝胶的合成具有可扩展性，且可基于水相进行。此外，纳米凝胶较高的含水量使其成为敏感生物载物的有效载体11。同时，其高比表面积可满足多种生物偶联需求，从而允许连接靶向基团以实现主动靶向。值得注意的是，纳米凝胶设计的多功能性使其可采用多种刺激响应性单体，从而精确调控其理化性质9。这种独特的可工程化特性使得纳米凝胶的设计得以合理优化，而这一点在传统使用的脂质体、胶束或聚合物囊泡中难以实现12,13。通过在特定设计的单体中引入刺激响应性基元，可使纳米凝胶在响应多种生理相关刺激（如pH、氧化还原条件、酶等）时触发其载物的可控释放9,14。这类智能纳米凝胶相较于传统纳米凝胶更具优势，因其具有更优异的稳定性，可延长血液循环时间，并能耐受生理环境以维持载物完整性，进而在目标部位实现可控释放15。事实上，由于其多功能特性，纳米凝胶已在生物医学领域获得广泛关注，在开发用于多种诊疗和诊断应用的刺激响应性纳米凝胶方面取得了显著进展2,16,17。
生物制剂可代表一类由蛋白质、肽和/或核酸组成的药品，因其卓越的选择性而彻底改变了治疗领域，从而成为增长最快的治疗药物类别18。事实上，此类药物市场的快速增长在美国食品药品管理局（FDA）批准数量的急剧上升中得到了明显体现，2023年生物制剂约占全部药物批准总数的40%19。除了其特异性和高效性之外，新药靶点的快速发现、更高效的生物工程工艺以及对这些药物在体内的命运（in vivo fate）的深入了解也推动了其应用的增加20。传统的生物制剂包括干扰RNA、替代蛋白、细胞因子和激素，通常通过重组DNA技术生产21。自1982年人源重组胰岛素获批以来，生物制剂已广泛应用于多种疾病的治疗，包括癌症（如曲妥珠单抗、阿维鲁单抗）、炎症性肠病（如阿达木单抗、赛妥珠单抗）以及罕见遗传病（如米波美森、美而赞、阿而赞、法布赞）21。尽管生物制剂与其靶点之间高度特异性的相互作用理论上应能抵消脱靶效应，但在临床应用中仍出现了与不良反应相关的若干担忧22。这些不良反应可分为两类：药理作用过度（靶点过度激活）和免疫原性。此外，生物制剂还存在半衰期短、生物利用度有限、易受蛋白酶降解、保质期较短以及生产成本高昂等问题，限制了其治疗效果21。传统缓解这些问题的方法包括对生物制剂进行共价修饰，但这可能损害其功能，从而降低疗效23。相比之下，纳米医学方法通过将治疗性载荷包裹于纳米颗粒中，可带来多种药理学优势，其中最重要的是通过增强渗透与滞留（EPR）效应实现对炎症部位的被动靶向24。其他与纳米颗粒相关的优点还包括延长血液循环时间、降低清除率、提高制剂灵活性、增强血管通透性以及促进细胞摄取25。尽管目前有大量不同类型的纳米颗粒制剂正在研究用于递送生物类载荷，但能够模拟纳米凝胶多功能性的仍属少数。实际上，纳米凝胶的载药能力超过了脂质体和胶束类纳米颗粒，且其胶体稳定性优于大多数无机纳米颗粒。因此，纳米凝胶为多种生物治疗药物的递送提供了一个极具价值的平台。
我们此前已成功将一种抗氧化酶递送至新型基质金属蛋白酶响应性交联聚合物纳米凝胶中，所采用的温和包封策略在酶释放后仍能保持其生物活性26在本研究中，我们展示了用于递送基于蛋白质的载荷的氧化还原响应型纳米凝胶的优化合成方法。值得注意的是，该合成方法可在温和条件下实现纳米凝胶的制备，从而包封目标载荷，无需使用剧烈的有机溶剂或高温。我们利用细胞内环境中的氧化还原稳态来调控包封载荷的释放。27,28通常，天然存在的抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）可调控细胞外和细胞内的氧化还原电位，其浓度分别在2–20 µM和1–10 mM之间。29,30迄今为止，已有大量氧化还原响应性纳米颗粒被报道，使其成为实现药物可控释放的一种成熟且可靠的策略。 体内27,28事实上，已通过使用含二硫键的交联剂在聚合物纳米材料中引入了二硫键31,32含二硫键单体的可生物降解聚合物的自组装33以及氧化还原响应性聚合物前药或药物/聚合物偶联物34,35因此，本研究探讨在聚合物纳米颗粒中引入一种独特的、对谷胱甘肽（GSH）高度敏感的二硫交联剂，从而实现对包封蛋白载荷的可控释放。
在本研究中，纳米凝胶的设计围绕以下标准展开，以实现特异性和载荷递送：小尺寸（约100 nm）和均匀的尺寸分布（多分散指数（PI）< 0.2）、负电荷表面（ζ电位 < −30 mV）、高载药效率以及在生理条件下的长期胶体稳定性。&#60;0.3）以确保有效穿透内皮层并 体内 稳定性27；蛋白质负载物的高效包封，以及响应谷胱甘肽（GSH）的负载物可控释放。我们报道了GSH响应性交联纳米凝胶的合成，该纳米凝胶可形成均一的、粒径小于100 nm的纳米颗粒，对目标蛋白质负载物的包封效率达76%。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-(&lt;br/&gt; 丙烯酰氧基)乙基]三甲基氯化铵溶液&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>496146</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基乙基甲基丙烯酸盐盐酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>4,7,10,13,16,19,22,25,32,35,38,41,&lt;br/&gt; 44,47,50,53-十六氧杂-28,29-二硫代六十五烷二酸二-N-琥珀酰亚胺酯&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>671630</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23701</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Cy7标记的牛血清白蛋白</td><td>Nanocs</td><td>BS1-S7-1</td><td></td></tr><tr><td>氘代二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>547239</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997 (无水) 和 D65100</td><td></td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-四甲基乙二胺&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471283</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Agar Scientific&amp;nbsp;</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;纳米凝胶合成与表征所需设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置（100 kDa 截留分子量）&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>C7715</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>Veleta</td><td></td></tr><tr><td>碳支持铜网</td><td>Agar Scientific&amp;nbsp;</td><td>AGS160</td><td></td></tr><tr><td>透析管（100 kDa 截留分子量）</td><td>Spectrum labs</td><td>11405949</td><td></td></tr><tr><td>动态光散射&amp;nbsp;</td><td>Malvern&amp;nbsp;</td><td>Zetasizer Nano Ultra</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>WZ-03336-01</td><td></td></tr><tr><td>红外光谱仪</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>Cary 630 FTIR</td><td></td></tr><tr><td>iTEM 软件</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Waters</td><td>Micromass MALDI microMX MALDI Q-ToF&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MF-MilliporeTM 膜过滤器（0.45/0.2&amp;mu;m 孔径）</td><td>Merck Millipore, UK</td><td>HAWP04700, GSWP04700&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Beckman</td><td>Coulter-PARADIGM</td><td></td></tr><tr><td>质子与碳-13 核磁共振数据</td><td>Bruker</td><td>400 MHz AV-400 NMR 波谱仪</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪&amp;nbsp;</td><td>Buchi&amp;nbsp;</td><td>R-114 旋转蒸发系统</td><td></td></tr><tr><td>一次性针头&amp;nbsp;</td><td>Sterican</td><td>4665643</td><td></td></tr><tr><td>Suba-Seal&amp;nbsp;隔垫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z124575</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Phillips&amp;nbsp;</td><td>CM 100 TEM&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop One/One C 微量&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

使用一步水相交联共纳米聚合方法合成刺激响应性纳米凝胶

Synthesis of Stimuli-responsive Nanogels using Aqueous One-step Crosslinking and Co-nanopolymerization

由交联聚合物纳米颗粒组成的纳米凝胶因其多功能的自下而上合成方法和良好的生物相容性，已被开发用于递送多种化学和生物治疗剂。尽管迄今为止已有多种方法被用于纳米凝胶的合成，但极少有方法能够在不使用可能破坏生物有效载荷完整性的剧烈有机溶剂或高温条件的情况下完成合成。相比之下，本文所介绍的方法可在温和反应条件下实现负载蛋白质的亚100 nm级纳米凝胶的合成。本文介绍了一种利用水相单步交联共聚技术合成纳米凝胶，并非共价包封基于蛋白质的有效载荷的方法。在该技术中，我们首先通过静电作用将基于蛋白质的有效载荷与阳离子型季铵盐单体结合，随后在过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺的作用下同时进行交联和共聚，形成能够包埋蛋白质有效载荷的纳米凝胶。采用动态光散射（DLS）测定纳米凝胶的粒径和多分散系数，通过透射电子显微镜（TEM）评估其表面形貌。通过计算包封效率来确定纳米凝胶内包埋的蛋白质质量。此外，还通过生物还原实验评估纳米凝胶通过氧化还原响应性结构单元逐步降解实现的可控释放能力。我们提供了纳米颗粒优化的示例数据，以展示采用该技术进行纳米凝胶合成与表征过程中的所有注意事项。总体而言，所获得的纳米凝胶粒径均一，平均粒径为57 nm，多分散系数为0.093。包封效率高达76%。此外，在谷胱甘肽存在条件下，纳米凝胶通过新型氧化还原响应组分的逐步降解，在48小时内实现了高达86%的包封蛋白的可控释放。

聚乙二醇二硫代二丙烯酸酯交联剂的合成与表征 氧化还原响应性交联剂通过亲核取代反应合成 N通过形成酰胺键，由2-氨基乙基甲基丙烯酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯反应图1所需产物的合成主要通过 1H NMR（补充图1），通过将产物样品溶解在氘代DMSO中进行，其中PEG链的亚甲基单元在δ3.48–3.53处的共振峰以及对应于(N)CH的三重峰2-CH2 δ3.59-3.65处的基团可用于鉴定产物的生成。还通过FT-IR对所生成的产物进行了进一步表征。补充图2），MALDI-ToF，（补充图3）和 13C NMR（补充图4).
在将交联剂（4.55 mg/mL）掺入纳米凝胶之前，于 PBS 中加入 GSH（11 mM），在 37 °C 下孵育 24 小时...

纳米凝胶是一种用于递送生物制剂的优良且多功能的纳米颗粒平台。采用一步交联共纳米聚合策略，在水相条件下合成了能够包载基于蛋白质的有效成分的响应性聚乙二醇基聚合物纳米凝胶。本文介绍了这些新型纳米颗粒的最佳制备方法及其表征过程。

由交联聚合物纳米颗粒组成的纳米凝胶因其在多种化学和生物治疗药物递送中的应用而得到开发，由于……

本方案通过一步交联共聚技术，在温和的水相反应条件下，实现了小于100纳米的载蛋白纳米凝胶的合成，代表了该领域的重要进展。该技术的主要优势在于能够在温和条件下合成载蛋白纳米凝胶，避免使用剧烈的有机溶剂和高温，从而保持生物活性成分的完整性。首先，使用过滤后的去离子水清洗玻璃器皿。为干燥玻璃器皿，将一个牢固的喷嘴连接到通风橱侧面的压缩空气出口。用手握紧小瓶，将喷嘴插入瓶内，打开压缩空气，释放出受控的气流。接着，取一个10毫升玻璃小瓶，加入去离子水，并用橡胶隔垫密封。为了去除水中的氧气，先用氮气充满一个气球，并在气球上安装一根针头。将气球置于隔膜上方，刺穿橡胶隔膜以使氮气流入。同时，在烧瓶上安装一根排气针，以保持持续稳定的氮气流。接下来，将 BSA 或 Cy7 标记的 BSA 溶解于脱氧去离子水中。然后将该溶液加入一个洁净的 10 毫升玻璃小瓶中。向烧瓶中加入 AETC 溶液，并用另一块橡胶隔垫密封。将丙烯酰胺和脱氧去离子水溶解后，加入小瓶中的混合物中。然后将二硫交联剂溶解于去离子水中，并将其加入小瓶中的混合物。用氮气冲洗该混合物20分钟。随后，将SDS溶解于脱氧去离子水中。使用经氮气冲洗的注射器将其加入混合物中。接着，向反应混合物中加入TEMED。在持续通入氮气的条件下，使混合物脱氧三分钟。将过硫酸铵溶于1毫升脱氧去离子水中，然后加入反应混合物中。随后在氮气氛围下密封烧瓶，并在室温下搅拌混合物3小时30分钟。为了终止反应，从烧瓶上移除密封盖。当混合物变为澄清且无色时，反应即告完成。为了纯化纳米凝胶，将反应混合物加入一个15毫升的离心过滤装置中。用去离子水填充离心单元，并进行离心以去除未反应的化学物质或未包封的载荷。在离心单元中加入 2 mL 去离子水以稀释纳米凝胶样品。将最终样品储存在 2 至 8 °C 条件下，以防止包封的蛋白质降解。取一个比色皿或一次性折叠毛细管池用于分析。先用滤过的去离子水清洗，再用压缩空气吹扫，以去除任何较大的灰尘颗粒。然后向比色皿中加入50至100微升样品，并用750至1,000微升滤过的去离子水稀释。将比色皿插入DLS仪器时，打开样品室盖，捏住比色皿顶部边缘，避免在光学窗口留下指纹。将比色皿正确对准仪器的光路位置。然后关闭样品室，以隔绝环境光。使用DLS仪器上的相关软件开始粒径测量。测量完成后，选择与样品相关的结果，包括Z均粒径、平均多分散系数（PI）、每分钟计数率、zeta电位及相关图形。确认相关函数显示平滑的S形曲线，表明样品均一。分析完成后，小心地从DLS仪器中取出比色皿。观察到与BSA蛋白相关的峰强度逐渐降低，表明蛋白已被包封在纳米凝胶结构内部。对载有Cy7标记BSA的纳米凝胶进行理化表征，结果显示在50至100纳米处出现单一明确的峰。然而，空载纳米凝胶表现出不一致且较大的粒径。在48小时内，多达86%的Cy7标记BSA被释放。另一方面，未添加谷胱甘肽的对照实验仅导致15%的蛋白质释放。傅里叶变换红外光谱分析显示，在纳米凝胶合成过程中分离出的牛血清白蛋白（BSA）以及经谷胱甘肽孵育后的BSA均保持了其结构完整性，表现为在1,662 cm⁻¹处出现代表完整β转角的特征峰。然而，储存30天后的纳米凝胶中提取的BSA在1,613 cm⁻¹处出现新峰，提示存在分子间β片层结构及蛋白质聚集现象。圆二色光谱显示其光谱特征与天然BSA相似，表明α螺旋结构得以保留。然而，30天后分离的BSA特征峰出现轻微畸变，表明存在一定程度的聚集。保持持续的氮气流对于防止氧气抑制自由基聚合反应至关重要。此外，引发体系各组分需迅速加入，以确保合成成功。经过该步骤后，可通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）以及与生理还原剂谷胱甘肽孵育来评估氧化还原响应性，进一步表征纳米凝胶的粒径分布、形态及载药释放动力学。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

使用水性一步交联和共纳米聚合合成刺激响应纳米凝胶

本文介绍了一种利用嵌段共聚物合成聚合物纳米颗粒的纳米沉淀方法。我们将讨论嵌段共聚物的合成、纳米沉淀技术及其潜在应用。...

通过纳米沉淀法制备双嵌段聚合物纳米颗粒

本实验室开发了DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，这是一种动态水凝胶系统，旨在更深入地理解调控组织刚度对细胞功能的影响。本文提供了制备此类水凝胶的示意图、说明及操作方案。...

DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

我们提出一种制备完全由同一种基础材料——聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）构成的Janus微凝胶的方案，其结构具有明显的区室化特征，基于过饱和NIPAAm单体溶液的相分离形成。所合成的Janus微凝胶表现出独特的性质，如各向异性的热响应性以及亲油/亲水性负载能力。...

合成具有各向异性热响应性及亲油/亲水负载能力的聚(N-异丙基丙烯酰胺) Janus 微凝胶

我们报道了将多种类型的聚合物包覆金属纳米颗粒“聚合”成长链“均聚物”和“共聚物”的实验方案。...

使用聚苯乙烯-嵌段-聚丙烯酸包覆的金属纳米粒子作为单体进行均聚和共聚

非搅拌沉淀聚合法提供了一种快速、可重复的原型制备方法，可用于合成粒径分布窄且对刺激敏感的聚（N-异丙基丙烯酰胺）微凝胶。本实验方案展示了在此类微凝胶合成过程中，利用宽场显微镜系统进行光散射表征及单颗粒荧光追踪的方法。...

高度均一的聚(N-异丙基丙烯酰胺)微凝胶的可控合成与荧光示踪

本文描述了基于聚合物低聚物通过腙键交联制备可降解温敏性水凝胶的方案，适用于宏观、微观和纳米尺度，其中纳米尺度可用于制备凝胶纳米颗粒和纳米纤维。...

通过反应性挤出、微流控、自组装和电纺丝在多个长度尺度上制备可降解温敏性水凝胶

本文介绍了一种调节共价交联纳米颗粒尺寸和交联密度的方法，这些纳米颗粒由含有侧链官能团的线性聚酯制备而成。通过调控合成参数（聚合物分子量、侧链官能团引入程度以及交联剂当量），可获得适用于药物递送应用的所需纳米颗粒尺寸和交联密度。...

纳米海绵在尺寸和交联密度上的可调性

本方案描述了可注射型超分子聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶生物材料的合成与配制方法。同时展示了这些材料在药物递送、生物制药稳定化以及细胞包封与递送中的应用。...

可注射的超分子聚合物-纳米粒子水凝胶在细胞与药物递送中的应用

本方案描述了一组用于合成微孔退火颗粒支架微凝胶构建单元的方法，该支架可用于多种再生医学应用。...

用于微孔退火颗粒支架的微凝胶构筑单元的微流控合成

故意设计的金属有机框架材料的合成、活化与表征具有挑战性，特别是当构筑单元不相容或热力学上不利于目标物相而有利于非期望多晶型时。本文描述了溶剂辅助配体交换、毛细管粉末X射线衍射及活化方法的应用 通过 超临界CO₂2...

功能化金属有机框架的合成与表征

学习水性一步交联共聚合法合成亚100纳米蛋白质负载纳米凝胶。该方法在温和水相条件下进行，避免使用有机溶剂和高温，有效保护生物活性物质的完整性，适用于生物制剂递送研究。

使用一步水相交联共纳米聚合方法合成刺激响应性纳米凝胶

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