层层自组装制备与表征双面纳米基质以促进软骨再生

本方案展示了我们在分子水平上组装和表征逐层构建的JBNm的方法。JBNm可包封TGF-B1，并防止其在周围组织中释放，从而促进局部软骨形成。JBNm的制备过程已实现标准化，可为未来应用构建不同的JBNm。

独特的逐层结构可实现生长因子的包封，形成稳定的局部释放，从而避免肥大并维持生长。JBNm 由于具有可注射性，可在限定区域内为软骨组织再生提供稳态的微环境，适用于不同场景，例如形状不规则的骨折或腔隙。首先，将 8 微升浓度为 1 毫克/毫升的 TGF-B1 水悬液加入到 32 微升浓度为 1 毫克/毫升的 Matrilin-3 水悬液中。

用移液器充分混合这些蛋白质。向TGF-B1、Matrilin-3溶液中加入80微升浓度为1毫克/毫升的水悬浮液Janus Base纳米管（JBNts）。

反复吹打以确保充分混匀。对于 JBNt 组，将 5 微升浓度为 1 毫克/毫升的 JBNts 加入 50 微升水中，配制成 90.9 微克/毫升的溶液。对于 Matrilin-3 组，将 40 微升浓度为 10 微克/毫升的 Matrilin-3 加入 15 微升水中，配制成 7.3 微克/毫升的溶液。

对于TGF-B1组，将10微升浓度为10微克/毫升的TGF-B1加入45微升水中，配制成1.8微克/毫升的溶液。对于Janus Base Nano-Matrix（JBNm）组，将40微升浓度为10微克/毫升的Matrilin-3与10微升浓度为10微克/毫升的TGF-B1混合。充分振荡以确保混合均匀。

然后，向溶液中加入 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts，反复吹打混匀样品。使用分光光度计测定每组的吸收光谱。按照生产商说明书，使用蛋白质标记试剂盒对 TGF-B1 进行标记。

取20微升浓度为20微克/毫升的标记TGF-B1，加入25微升水中，配制成8.9微克/毫升的测试溶液。使用单独的标记试剂盒对Matrilin-3进行标记。取20微升浓度为80微克/毫升的标记Matrilin-3，加入25微升水中，配制成36微克/毫升的测试溶液。

将20微升浓度为80微克/毫升的标记Matrilin-3与20微升浓度为20微克/毫升的标记TGF-B1以及5微升水混合，得到标记的TGF-B1与Matrilin-3复合物。用移液器反复吹打混合数次。将5微升浓度为1毫克/毫升的JBNts加入40微升水中，配制成浓度为111微克/毫升的溶液。

然后向标记有 TGF-B1、Matrilin-3 的溶液中加入 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts，反复吹打以混匀化合物。将每组样品转移至黑色 384 孔板的孔中。将该板放入多功能微孔板读数仪，按照制造商的操作说明，在激发波长 488 nm 和 555 nm 下进行检测。

在生理条件下，由于等电点的影响，Matrilin-3 的 zeta 电位呈负电性。在向 Matrilin-3 中加入 TGF-B1 后，TGF-B1 与 Matrilin-3 复合物的 zeta 电位升高至接近中性。JBNm 的 zeta 电位在三组中最高。

紫外-可见吸收光谱证实了JBNm具有逐层构建的层级内部结构，其中赖氨酸侧链的芳香环以及JBNts分别在220纳米和280纳米处产生了吸收峰。采用透射电子显微镜（TEM）对JBNts和JBNm的形貌进行表征。与蛋白质结合后，观察到JBNm形成较粗的束状结构，构成支架样结构。

荧光显微镜证实了逐层结构的存在，并展示了JBNm的横截面。经标记后，红色荧光的Matrilin-3包裹着JBNt束，并构成JBNm的外层，而绿色荧光的TGF-B1则形成内层。荧光共振能量转移在520纳米处显示标记的TGF-B1基团的发射峰，在570纳米处显示Matrilin-3基团的发射峰。

探讨了JBNm对HMSC黏附和细胞增殖的影响。结果显示，HMSCs沿JBNm聚集，而在JBNts上黏附的细胞较少。细胞在JBNm上的排列方式及细胞大小表明，JBNts在细胞黏附中发挥作用，而蛋白质则增强了细胞黏附的亲和力。

细胞培养第一天后，JBNm 和 TGF-B1 组的细胞增殖情况显著高于其他组。当细胞培养时间延长至三天和五天时，JBNm 和 TGF-B1 组的细胞增殖进一步增加。对 JBNm 进行荧光标记时，应先分别标记 TGF-B1 和 Matrilin-3，混合后再加入 JBNts，以确保逐层结构的正确形成。

对支架的进一步评估有助于理解其在治疗应用中的有效性。更具体而言，高通量增殖实验可用于确定体外最佳给药剂量，并进一步应用于体内研究。这种新型 NanoMatriX 技术使研究人员能够利用基于纳米材料的可注射支架来实现软骨再生。

这种多聚模拟方法可增强雄核发育并抑制位点增殖。