Name: 促进软骨再生的逐层Janus碱基纳米基质的制备和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习逐层Janus碱基纳米基质（JBNm）的组装与表征方法，用于软骨组织再生。该技术封装TGF-β1实现局部控释，为生物材料与再生医学研究提供可注射支架方案。

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本研究工作得到美国国立卫生研究院（NIH）资助项目7R01AR072027和7R03AR069383、美国国家科学基金会（NSF）职业奖1905785、NSF项目2025362以及康涅狄格大学的支持。本研究工作还部分得到NIH资助项目S10OD016435的支持。

1. JBNts 的合成
<ol>
	<li>采用先前发表的方法制备 JBNt 单体，该过程涉及多种化合物的合成12。</li>
	<li>合成后，使用反相柱通过高效液相色谱法（HPLC）纯化粗制的 JBNt 单体。使用溶剂 A：100% 水，溶剂 B：100% 乙腈，以及溶剂 C：pH = 1 的盐酸水溶液。流速为 3 mL/min。收集 HPLC 在 7.2 分钟处得到的最大峰组分。</li>
</ol>
2. JBNt/Matn1/TGF-β1 的制备（视频 1）
注意：视频 1 显示，JBNm 是一种在生理环境中（水溶液、无紫外线、无化学添加剂、无加热）可注射形成的固体，且具有生物启发性。
<ol>
	<li>将8 µL溶于H2O中的1 mg/mL TGF-β1加入32 µL溶于H2O中的1 mg/mL matrilin-3中。用移液器吹打以确保这些蛋白质充分混合。</li>
	<li>将80 µL溶于H2O中的1 mg/mL JBNts加入TGF-β1/matrilin-3溶液中。反复吹打以确保充分混匀。加入JBNts后立即可见白色絮状物，表明JBNm的形成（视频1）。</li>
</ol>
3. 使用紫外-可见光（UV-Vis）吸收观察样品
注意：通过紫外-可见吸收光谱分析来表征 JBNm 的组装情况。该测量包含四类样品：单独的 JBNts、单独的 matrilin-3、单独的 TGF-β1，以及由上述三种组分构成的完整层层组装 JBNm。所有初始浓度样品均悬浮于 H2O 中。
<ol>
	<li>对于 JBNt 组，将 5 µL 的 1 mg/mL JBNts 加入 50 µL H2O 中，配制成 90.9 µg/mL&#160;溶液。</li>
	<li>对于 matrilin-3 组，将 40 µL 的 10 µg/mL matrilin-3 加入 15 µL H2O 中，配制成 7.3 µg/mL 溶液。</li>
	<li>对于 TGF-β1 组，将 10 µL 的 10 µg/mL&#160;TGF-β1 加入 45 µL H2O 中，配制成 1.8 µg/mL 溶液。</li>
	<li>对于 JBNm 组，将 40 µL 的 10 µg/mL matrilin-3 与 10 µL 的 10 µg/mL&#160;TGF-β1 混合，振荡以确保充分混匀，然后向该溶液中加入 5 µL 的 1 mg/mL JBNts，反复吹吸以混匀样品。</li>
	<li>使用分光光度计测定各组的吸收光谱。</li>
</ol>
4. 样品的Zeta电位测量
注意：通过分析Zeta电位，可更好地预测JBNm与目标物的相互作用方式 体内 组织。测量了三组：单独的matrilin-3、matrilin-3与TGF-β1联合、以及完整的逐层JBNm。
<ol>
	<li>对于 matrilin-3 组，将 160 µL 的 10 mg/mL matrilin-3 加入 640 µL 的 H2O 中，配制成 800 µL 溶液。</li>
	<li>对于 matrilin-3/TGF-β1 复合物组，将 160 µL 的 10 µg/mL matrilin-3 与 40 µL 的 10 µg/mL TGF-β1 混合。反复吹打以确保充分混匀。然后将其加入 600 µL 的 H2O 中，最终得到 800 µL 溶液。</li>
	<li>对于 JBNm 组，将 160 µL 的 10 µg/mL&#160;matrilin-3 与 40 µL 的 10 µg/mL TGF-β1 混合。多次吹打以混合蛋白。然后向溶液中加入 20 µL 的 1 mg/mL JBNts，并吹打混匀。最后将 JBNm 溶液加入 580 µL 的 H2O 中，得到 800 µL 溶液。</li>
	<li>测定三组样品的 zeta 电位值。</li>
</ol>
5. 用于透射电子显微镜（TEM）的 JBNt/matrilin-3 纳米基质制备
注意：通过透射电子显微镜（TEM）表征来分析 JBNts 和 JBNm 的形貌。
<ol>
	<li>根据已发表的方案和制造商的说明，将两个载网放入等离子清洗仪中，以在对 JBNts 和 JBNm 进行负染色前彻底清洁载网12。</li>
	<li>将 10 µL 的 1 mg/mL JBNts 与 40 µL 去离子水混合，配制成 200 µg/mL 的 JBNt 溶液。</li>
	<li>将 30 µL 的 100 µg/mL matrilin-3 与 20 µL 的 100 µg/mL TGF-β1 混合，并反复吹打数次。向 matrilin-3/TGF-β1 混合液中加入 10 µL 的 1 mg/mL JBNts，以制备 JBNm 样品，再次反复吹打。</li>
	<li>分别在两个不同的载网上各加入 3 µL 的 JBNt 溶液（200 µg/mL）和 3 µL 的 JBNm 溶液，静置 2 分钟。</li>
	<li>用 100 µL 的醋酸铀酰溶液（0.5%）冲洗每个载网，使用滤纸吸去多余液体，并让载网自然风干。</li>
	<li>操作透射电子显微镜，按照先前发表的方法对样品进行适当观察和表征11,12。</li>
</ol>
6. 荧光标记蛋白质吸收光谱的测定
注意：通过吸收光谱分析观察 JBNm 的结构，以验证 JBNm 的结构。
<ol>
	<li>根据制造商说明书，使用蛋白质标记试剂盒对TGF-β1进行标记。将20 µL浓度为20 µg/mL的标记TGF-β1加入25 µL H2O中，配制成8.9 µg/mL的测试溶液。</li>
	<li>使用另一种标记试剂盒对matrilin-3进行标记。将20 µL浓度为80 µg/mL的标记matrilin-3加入25 µL H2O中，配制成36 µg/mL的测试溶液。 
	注意：TGF-β1的荧光染料标记后最终浓度为20 µg/mL，而matrilin-3标记后的最终浓度为80 µg/mL。</li>
	<li>将20 µL浓度为80 µg/mL的标记matrilin-3与20 µL浓度为20 µg/mL的标记TGF-β1以及5 µL H2O混合，得到标记的TGF-β1/matrilin-3复合物。反复吹打混匀。</li>
	<li>将5 µL浓度为1 mg/mL的JBNts加入40 µL H2O中，得到111 µg/mL的溶液。</li>
	<li>将20 µL浓度为20 µg/mL的标记TGF-β1与20 µL浓度为80 µg/mL的标记matrilin-3混合，并反复吹打。再向标记的TGF-β1/matrilin-3溶液中加入5 µL浓度为1 mg/mL的JBNts，反复吹打以充分混匀复合物。 
	注意：JBNt、标记TGF-β1和标记matrilin-3的最终浓度分别为111 µg/mL、8.9 µg/mL和36 µg/mL。</li>
	<li>将各组样品（即标记TGF-β1（步骤6.1）、标记matrilin-3（步骤6.2）、标记TGF-β1/matrilin-3（步骤6.3）、JBNts（步骤6.4）、JBNm（步骤6.5））分别加入黑色384孔板的独立孔中。</li>
	<li>将黑色384孔板放入多功能微孔板检测仪，按照制造商方案，在激发波长488 nm和555 nm下进行检测。</li>
</ol>
7. 体外 生物功能检测
<ol>
	<li>在预包被的盖玻片培养腔中进行细胞黏附实验
	<ol>
		<li>准备两个带有五组样品的腔室盖玻片，每种细胞类型使用一个盖玻片。</li>
		<li>将 1.25 µL 浓度为 1 mg/mL 的&#160;JBNts 加入 198.75 µL 蒸馏水中，得到浓度为 6.25 µg/mL 的溶液。</li>
		<li>将 10 µL 浓度为 10 µg/mL 的&#160;matrilin-3 加入 190 µL 蒸馏水中，得到浓度为 0.5 µg/mL 的溶液。</li>
		<li>将 2.5 µL 浓度为 10 µg/mL 的&#160;TGF-β1 加入 197.5 µg/mL 蒸馏水中，得到浓度为 0.125 µg/mL 的溶液。</li>
		<li>对于 JBNm 组，将 10 µL 浓度为 10 µg/mL 的&#160;matrilin-3 与 2.5 µL 浓度为 10 µg/mL 的 TGF-β1 混合，并反复吹打混匀。再加入 1.25 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts，再次吹打混匀。最后加入 186.25 µL 蒸馏水，得到总体积为 200 µL 的 JBNm 溶液。
		<ol>
			<li>对照组使用 200 µL 蒸馏水。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将各组样品分别加入 1.5 号腔室盖玻片的各个孔中。将盖玻片置于 -80 °C 冰箱中冷冻 1 小时，随后使用冷冻干燥仪进行冻干处理。</li>
		<li>将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）和人软骨细胞（每孔 10,000 个细胞）分别接种至已准备好的腔室盖玻片各孔中。</li>
		<li>将两个盖玻片在 37 °C 培养箱中孵育 4 小时，然后吸除培养基，并用 PBS 洗涤两次。</li>
		<li>用 4% 多聚甲醛固定细胞 5 分钟，随后去除固定液并用 PBS 洗涤样本。再次用 PBS 洗涤，以彻底去除残留的 4% 多聚甲醛。</li>
		<li>用 100 µL 浓度为 0.1% 的 Triton-X 孵育细胞 10 分钟，然后用 PBS 洗涤。每孔加入 100 µL 浓度为 0.165 µM 的罗丹明-鬼笔环肽（rhodamine-phalloidin），静置 30 分钟后再次用 PBS 洗涤。</li>
		<li>每孔加入 0.1 µg/mL 的&#160;DAPI 以染色细胞核。孵育 5 分钟后，用 PBS 洗涤两次。</li>
		<li>使用光谱共聚焦显微镜观察细胞形态并采集荧光图像。</li>
		<li>进一步使用图像处理软件分析细胞数量和形态。打开软件并导入图像，添加比例尺并对软件进行校准。统计每个样品指定区域内的细胞数量，然后使用测量工具采集各组样品的细胞形态数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞增殖实验
	<ol>
		<li>准备三个未经处理的 96 孔板，每块板中加入五组样品。
		<ol>
			<li>对于 JBNt 组，将 3.75 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts 加入 596.25 µL 蒸馏水中，得到总体积为 600 µL、浓度为 6.25 µg/mL 的 JBNt 溶液。</li>
			<li>对于 TGF-β1 组，将 7.5 µL 浓度为 10 µg/mL 的 TGF-β1 加入 592.5 µL 蒸馏水中，得到浓度为 0.125 µg/mL 的测试溶液。</li>
			<li>对于 matrilin-3 组，将 30 µL 浓度为 10 µg/mL 的 matrilin-3 加入 570 µL 蒸馏水中，得到浓度为 0.5 µg/mL 的测试溶液。</li>
			<li>对于 JBNm 组，将 7.5 µL 浓度为 10 µg/mL 的 TGF-β1 与 30 µL 浓度为 10 µg/mL 的 matrilin-3 混合，反复吹打数次，随后加入 3.75 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts。</li>
			<li>用 558.75 µL 蒸馏水稀释 JBNm 溶液，使 JBNt、TGF-β1 和 matrilin-3 的终浓度分别为 6.25 µg/mL、0.125 µg/mL 和 0.5 µg/mL。</li>
			<li>对照组使用 600 µL 蒸馏水。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将每组样品分配至六个孔中（每孔 100 µL 样品）。</li>
		<li>将三块含有所有样品的 96 孔板置于 -80 °C 冰箱中冷冻 1 小时，随后使用冷冻干燥仪进行冻干处理。</li>
		<li>将 hMSCs 接种至这些 96 孔板中，每孔加入含 5,000 个细胞的 100 µL 细胞悬液。将三块板分别在 37 °C、5% CO2 条件下培养 1 天、3 天或 5 天。</li>
		<li>每孔加入 10 µL CCK-8 溶液，并在 37 °C 下继续孵育 2 小时。</li>
		<li>使用多功能微孔板检测仪在 450 nm 波长下测定各孔的吸光度值。</li>
		<li>将已知梯度浓度的 hMSCs 接种至 96 孔板中，培养 4 小时。使用 CCK-8 法测定已知细胞数量的吸光度值，并绘制标准曲线。</li>
		<li>利用吸光度标准曲线计算细胞增殖情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>稳定性测试 
	注：使用人 TGF-β1 靶向 ELISA 试剂盒测定 JBNm 从琼脂糖水凝胶中释放的 TGF-β1 百分比。
	<ol>
		<li>通过将 400 mg 琼脂糖粉末加入 20 mL PBS 中并加热至 100 °C，使其完全溶解，制备 2% 琼脂糖溶液。</li>
		<li>在冷却的 2% 琼脂糖水凝胶中制备 JBNm。
		<ol>
			<li>将 10 µL 浓度为 10 µg/mL 的 TGF-β1、40 µL 浓度为 10 µg/mL 的 matrilin-3、5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts 与 195 µL PBS 混合。将该混合液与 250 µL 2% 琼脂糖混合，形成 JBNm 水凝胶。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>加入 500 µL PBS 作为释放介质，并确保每 3 天更换一次。收集每次释放的溶液，共持续 15 天。</li>
		<li>按照试剂盒说明书使用 ELISA 试剂盒检测所收集的各次释放液。 
		注：通过从理论载药量（100%）中减去 PBS 中释放的 TGF-β1 量，可确定剩余的 TGF-β1 含量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 PCR 进行细胞分化分析26。
	<ol>
		<li>准备七组样品，每组样品包含 20 µL 细胞悬液（4 × 104 个细胞）、30 µL 特定溶液（或 PBS，视样品组而定）以及 50 µL 2 wt % 琼脂糖。
		<ol>
			<li>对于 TGF-β1 组，将 5 µL 浓度为 10 µg/mL 的 TGF-β1 加入 25 µL PBS 中，得到浓度为 1.6 µg/mL 的溶液。</li>
			<li>对于 matrilin-3 组，将 20 µL 浓度为 10 µg/mL 的 matrilin-3 加入 10 µL PBS 中，得到浓度为 6.7 µg/mL 的溶液。</li>
			<li>对于 JBNt 组，将 2.5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts 加入 27.5 µL PBS 中，得到浓度为 83.3 µg/mL 的溶液。</li>
			<li>对于 J/T/M JBNm 组，将 10 µL 浓度为 10 µg/mL 的 matrilin-3 与 5 µL 浓度为 10 µg/mL 的 TGF-β1 混合，上下吹打混匀。然后加入 2.5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts，再次吹打混匀。最后用 2.5 µL PBS 稀释。</li>
			<li>各对照组使用 30 µL PBS 作为样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每孔加入 0.5 mL 细胞培养基，并确保每 3 天更换一次。
		<ol>
			<li>阳性对照组使用含有额外 TGF-β1 的商用 hMSC 软骨诱导培养基，其中 TGF-β1 的添加量与 TGF-β1 组和 J/T/M JBNm 组中的 TGF-β1 总量相等。</li>
			<li>一个阴性对照组使用不含 TGF-β1 的商用 hMSC 软骨诱导培养基；另一个阴性对照组使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基。</li>
			<li>其余各组均使用不含 TGF-β1 的商用 hMSC 软骨诱导培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样品培养 15 天。</li>
		<li>提取样品 RNA，并按照先前描述的方法26进行 PCR 以研究样品的分化情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>II 型胶原表达的免疫荧光染色检测
	<ol>
		<li>按照与 PCR 法细胞分化实验（步骤 7.4）相同的方法制备七组基于琼脂糖的样品。</li>
		<li>将样品培养 15 天。</li>
		<li>用 4% 甲醛固定样品 1 天，随后在 30% 蔗糖溶液中浸泡过夜，再用液氮在 -80 °C 下冷冻过夜。使用最佳切割温度化合物试剂（OCT，一种水溶性乙二醇与树脂的混合物）在 -10 °C 下固定样品。</li>
		<li>操作冷冻切片机，获取每份样品厚度为 20 µm 的冷冻切片。</li>
		<li>根据制造商的操作说明，用 1:800 稀释的抗 II 型胶原抗体和 PBS 稀释的荧光标记二抗对每张切片进行染色。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜观察每张切片，激发波长为 488 nm，目镜放大倍数为 40 倍。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Pei, M., Luo, J., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+maintaining+chondrogenesis+of+synovial+fibroblasts+by+cartilage+extracellular+matrix+protein+matrilins%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).</li>
<li>Bello, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrilin3%2FTGFbeta3+gelatin+microparticles+promote+chondrogenesis%2C+prevent+hypertrophy%2C+and+induce+paracrine+release+in+MSC+spheroid+for+disc+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50(2021).</li>
<li>Muttigi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrilin-3+codelivery+with+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+promotes+articular+cartilage+regeneration+in+a+rat+osteochondral+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).</li>
<li>Jayasuriya, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrilin-3+chondrodysplasia+mutations+cause+attenuated+chondrogenesis%2C+premature+hypertrophy+and+aberrant+response+to+TGF-beta+in+chondroprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).</li>
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<li>Mello, M. A., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+TGF-beta1+and+triiodothyronine+on+cartilage+maturation%3A+in+vitro+analysis+using+long-term+high-density+micromass+cultures+of+chick+embryonic+limb+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells.</a> Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).</li>
<li>Shi, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+TGF-beta+signaling+from+cell+membrane+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus.</a> Cell. 113 (6), 685-700 (2003).</li>
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<li>Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+%28siRNA%29-based+therapeutics+for+cartilage+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Engineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases.</a> Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).</li>
<li>Bi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+of+PEG+onto+PMMA+microchannel+surface+to+minimize+nonspecific+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption.</a> Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).</li>
<li>Chen, Y., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+osteoblast+functions+in+the+presence+of+BMP-7+short+peptides+for+nanostructured+biomaterial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).</li>
<li>Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+nanoparticle+delivery+with+in+vitro+bio-engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues.</a> Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).</li>
<li>Yau, A., Lee, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+protein+delivery+in+anticancer+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications.</a> Pharmaceutics. 13 (2), 155(2021).</li>
</ol>

陈宇鹏博士是易思科生物技术有限公司和NanoDe治疗有限公司的联合创始人。

本研究的目标是开发一种仿生支架平台——JBNm，以克服传统组织构建物依赖细胞培养环境来介导细胞分化的局限性。JBNm是一种逐层结构的支架，可用于构建自持性的软骨组织。该创新设计基于一种新型DNA启发的纳米材料——JBNts。JBNm由JBNts30、TGF-β1和matrilin-3组成，通过一种新颖的逐层组装技术构建而成，其支架的自组装过程在分子水平上得以控制。通过zeta电位测量、紫外-可见吸收光谱、透射电子显微镜（TEM）以及荧光光谱分析对JBNm的组装过程进行了观察和表征。
紫外-可见光谱在 图2B （步骤3）已证实JBNm具有分层逐层构建的内部结构。由于结合亲和力的差异，可观察到吸光度峰的不同。JBNts与matrilin-3之间的相互作用强于JBNts与TGF-β1之间的相互作用，表明JBNts在纤维形态和赖氨酸表面化学特性方面模拟了胶原蛋白。该技术对于观察JBNts与matrilin-3而非TGF-β1的结合至关重要，从而实现TGF-β1的包封，进而使其向周围组...

在组织工程中，支架对于为细胞附着及后续组织发育提供结构支持具有至关重要的作用1。通常，不使用任何支架的传统组织构建体依赖细胞培养环境和添加的生长因子来介导细胞分化。此外，将生物活性分子引入支架中通常是引导细胞分化与功能的首选方法2,3。某些支架可独立模拟天然组织的生化微环境，而另一些则可通过生长因子直接影响细胞功能。via然而，研究人员在选择支架时常面临挑战：既要确保支架能对细胞黏附、增殖和分化产生积极影响，又需在较长时间内提供最佳的结构支持与稳定性4,5。生物活性分子通常与支架结合不牢固，导致植入后这些蛋白迅速释放，进而在非预期部位产生释放效应。这最终可能导致对非靶向组织或细胞产生不良影响6,7。
支架通常由高分子材料制成。Janus基底纳米基质（JBNm）是一种仿生支架平台，采用新型逐层自组装方法制备，可用于构建自维持的软骨组织8。这些新型的DNA启发纳米管被称为Janus基底纳米管（JBNts），因其能够准确模拟细胞外基质（ECM）中胶原蛋白的结构和表面化学特性。通过添加如matrilin-3和转化生长因子β1（TGF-β1）等生物活性分子，JBNm可构建出理想的微环境，进而促进目标细胞和组织功能的发挥9。
JBNts 是一类新型纳米管，由腺嘌呤和胸腺嘧啶的合成类似物衍生而来。JBNts 通过自组装形成10；六个合成核碱基结合成环，这些环通过 π-π 堆积相互作用形成长度为 200–300 µm 的纳米管11。这些纳米管在结构上与胶原蛋白相似；通过模拟天然软骨微环境的某些特性，JBNts 已被证明可为软骨细胞和人源间充质干细胞（hMSCs）提供有利的附着位点11,12,13,14。由于该纳米管能够自发进行自组装，且无需任何引发剂（如紫外光），因此在难以触及的缺损区域作为可注射支架方面展现出令人期待的应用潜力15。
Matrilin-3 是一种存在于软骨中的结构性细胞外基质蛋白。该蛋白在软骨形成及维持软骨正常功能中发挥重要作用16,17。近年来，Matrilin-3 已被用于生物材料支架中，可促进软骨形成而不引发肥大化9,18,19。通过将该蛋白引入 JBNm 中，软骨细胞会被吸引至含有与其天然微环境相似成分的支架。此外，已有研究表明，Matrilin-3 是软骨细胞内 TGF-β1 信号通路正常运作所必需的20。生长因子作为信号分子，可诱导特定细胞或组织的定向生长。因此，为实现最佳的软骨再生效果，Matrilin-3 与 TGF-β1 是 JBNm 中必不可少的组分。将 TGF-β1 添加至逐层组装的支架中，可进一步促进组织构建物中的软骨再生。TGF-β1 是一种常用于促进骨软骨缺损修复的生长因子，可刺激软骨细胞和人骨髓间充质干细胞（hMSC）的增殖与分化21,22。因此，TGF-β1 在软骨再生用 JBNm（即 J/T/M JBNm）中起关键作用23，尤其当其定位于 JBNm 层内时，更能有效促进正常软骨生长。
如前所述，生长因子通常被组装在支架的外部，而没有特定的掺入方法。在此，通过精确设计的生物材料纳米结构，开发了可特异性靶向目标细胞和组织的JBNm。JBNm由内层JBNt表面附着的TGF-β1和外层JBNt表面附着的matrilin-3组成24,25。在逐层结构的内层中掺入TGF-β1，可在JBNm纤维周围形成高度局部化的微环境，从而构建出蛋白质释放速率显著减缓的稳态组织结构12。JBNm具备可注射性，使其成为未来多种生物材料应用中理想的软骨组织构建物26。

<table><tbody><tr><td>10% 正常山羊血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>50062Z</td><td>用于在染色过程中阻断非特异性抗体结合的试剂。</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Corning</td><td>07-200-740</td><td>用于比较性细胞培养的24孔板。</td></tr><tr><td>384孔黑色未处理板</td><td>Thermo Fisher</td><td>262260</td><td>用于吸收测量的384孔板。</td></tr><tr><td>8孔腔室盖玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409PK</td><td>用于比较性细胞培养的8孔盖玻片。</td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>Corning</td><td>07-200-91</td><td>用于比较性细胞培养的96孔板。</td></tr><tr><td>96孔未处理板</td><td>Thermo Fisher</td><td>260895</td><td>用于比较性细胞培养和分析的96孔板。</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>用于细胞培养的水凝胶。</td></tr><tr><td>琼脂糖凝胶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td>作为细胞培养环境使用的水凝胶。</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 微量蛋白质标记试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>A30006 (488) 和 A30007 (555)</td><td>用于标记蛋白质的荧光染料。</td></tr><tr><td>抗胶原X抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>41-9771-82</td><td>用于染色胶原X的抗体。</td></tr><tr><td>Bio-Rad PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>用于对样品进行PCR扩增的设备。</td></tr><tr><td>C28/I2 软骨细胞系</td><td></td><td></td><td>用于分析不同样品增殖能力的细胞。</td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒8</td><td>Milipore Sigma</td><td>96992</td><td>细胞增殖检测。</td></tr><tr><td>Cell Profiler</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>用于分析细胞图像的软件。</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td></td><td></td><td>用于制备样品薄片以进行染色和显微镜观察的设备。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>可与腺嘌呤-胸腺嘧啶DNA区域结合的蓝色荧光染料。</td></tr><tr><td>一次性比色皿</td><td>FISHER Scientific</td><td>14-955-128</td><td>用于分光光度法的容器。</td></tr><tr><td>DMEM细胞培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566032</td><td>用于支持细胞生长的培养基。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO</td><td>A4766801</td><td>用于细胞培养基中以支持细胞生长的血清。</td></tr><tr><td>Fluoromount-G封片剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>00-4958-02</td><td>用于免疫染色载玻片封片的溶液。</td></tr><tr><td>甲醛</td><td></td><td></td><td>用于在切片前固定样品的化合物。</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16110</td><td>用于蛋白质染色的抗体。</td></tr><tr><td>人源间充质干细胞</td><td>LONZA</td><td>PT-2501</td><td>用于分析不同样品分化能力的细胞。</td></tr><tr><td>人源间充质干细胞软骨形成培养基</td><td>LONZA</td><td>PT-3003</td><td>用于促进软骨分化过程的细胞培养基。</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>与显微镜联用的图像分析软件。</td></tr><tr><td>itaq Universal SYBR Green One-Step Kit</td><td>BioRad</td><td>1725150</td><td>用于PCR的试剂盒。</td></tr><tr><td>Janus碱基纳米管 (JBNts)</td><td></td><td></td><td>由合成碱基构成的纳米管，用作细胞支架工具。</td></tr><tr><td>LaB6 20-120 kV 透射电子显微镜</td><td>Tecnai</td><td></td><td>用于对样品进行透射电子显微镜观察的设备。</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>用于建模和数据分析的统计软件。</td></tr><tr><td>Matrilin-3</td><td>Fisher Scientific</td><td>3017MN050</td><td>作为软骨细胞黏附位点的结构蛋白。</td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>用于测量样品吸光度值的设备。</td></tr><tr><td>Nikon A1R 光谱共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>用于分析样品的共聚焦显微镜。</td></tr><tr><td>1.5号腔室盖玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>152250</td><td>用于无菌细胞培养和成像的环境。</td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂</td><td></td><td></td><td>用于在切片前包埋细胞的化合物。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td>用于固定细胞的化合物。</td></tr><tr><td>PDC-32G 等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td>用于在透射电子显微镜前处理载网的清洗设备。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15-140-148</td><td>用于抑制细胞培养过程中细菌生长的抗生素试剂。</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>用于洗涤细胞培养基并在实验过程中作为缓冲液的溶液。</td></tr><tr><td>罗丹明-鬼笔环肽</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td>F-肌动蛋白红色荧光染料。</td></tr><tr><td>RNeasy 植物微型试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td>用于RNA提取过程中过滤和均质化样品的试剂盒。</td></tr><tr><td>蔗糖溶液</td><td></td><td></td><td>用于切片前处理样品的溶液。</td></tr><tr><td>TGF beta-1 人ELISA试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>BMS249-4</td><td>用于检测样品中TGF-&amp;beta;1存在的检测试剂盒。</td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21C</td><td>用于刺激软骨分化和增殖的生长因子。</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td>用于裂解染色过程中未固定的细胞的化合物。</td></tr><tr><td>TRIzol试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td>用于分离RNA的试剂。</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td>用于测量样品Zeta电位值的设备。</td></tr></tbody></table>

层层自组装制备与表征双面纳米基质以促进软骨再生

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

已开发出多种生物材料支架，以引导细胞黏附和增殖，旨在促进特定功能的实现 体外 和 体内 应用。通常将生长因子添加到这些生物材料支架中，以提供最佳的细胞培养环境，介导细胞分化及其后续功能。然而，传统生物材料支架中的生长因子通常设计为在植入后释放，可能对周围组织或细胞产生 unintended 的副作用。在此，受DNA启发的Janus碱基纳米基质（JBNm）成功构建了具有逐层结构的高度局部化微环境，用于自持性软骨组织的构建。JBNm由Janus碱基纳米管（JBNts）、matrilin-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）自组装而成。 通过 亲和结合。JBNm 按照 TGF-β1:matrilin-3:JBNt 质量比为 1:4:10 进行组装，该比例已被确定为可实现逐层结构正确组装的最佳比例。首先，将 TGF-β1 溶液加入 matrilin-3 溶液中，随后反复吹打混合液以确保充分均一，再加入 JBNt 溶液。再次反复吹打后，形成逐层结构的 JBNm。通过多种实验对逐层结构 JBNm、单独 JBNt、单独 matrilin-3 以及单独 TGF-β1 进行表征。采用紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）研究 JBNm 的形成过程，并利用透射电子显微镜（TEM）观察其结构。由于这种创新的逐层 JBNm 支架在分子尺度上构建，因此可通过荧光染料标记的 JBNm 进行观察。TGF-β1 被限制在可注射 JBNm 的内层，从而防止生长因子向周围区域释放，促进局部软骨形成，并营造抗肥大性分化微环境。

按照方案，JBNts 成功合成，并通过紫外-可见吸收光谱和透射电子显微镜（TEM）进行了表征。JBNm 是一种可注射的固体支架，可在生理环境中经历快速的仿生过程。当将 JBNts 加入含 TGF-β1/matrilin-3 溶液的混合物后，在生理环境下形成了一种白色网状固体支架，表明 JBNm 成功组装，如图1所示。这一结果已在表征方法中得到验证。
在生理条件下，由于聚集体蛋白-3的等电点呈负电性27 (图2A加入TGF-β1溶液至matrilin-3溶液后，TGF-β1/matrilin-3复合物的zeta电位升高至接近中性值，表明两种蛋白已结合。 通过 电荷相互作用。如图所示 图 2A，由于JBNts的存在，JBNm的zeta电位在三组中最高，因为赖氨酸侧链在生理环境中的等电点约为9.74。JBNm的zeta电位值升高表明其逐层结构的成...

本方案描述了通过依次添加Janus碱基纳米管（JBNts）、matrilin-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）来组装逐层Janus碱基纳米基质（JBNm）支架的方法。该JBNm已被制备并表征，此外还表现出优异的生物活性，可促进细胞黏附、增殖和分化等功能。

已开发出多种生物材料支架，以引导细胞黏附和增殖，旨在促进体外和体内特定功能的实现……

本方案展示了我们在分子水平上组装和表征逐层构建的JBNm的方法。JBNm可包封TGF-B1，并防止其在周围组织中释放，从而促进局部软骨形成。JBNm的制备过程已实现标准化，可为未来应用构建不同的JBNm。独特的逐层结构可实现生长因子的包封，形成稳定的局部释放，从而避免肥大并维持生长。JBNm 由于具有可注射性，可在限定区域内为软骨组织再生提供稳态的微环境，适用于不同场景，例如形状不规则的骨折或腔隙。首先，将 8 微升浓度为 1 毫克/毫升的 TGF-B1 水悬液加入到 32 微升浓度为 1 毫克/毫升的 Matrilin-3 水悬液中。用移液器充分混合这些蛋白质。向TGF-B1、Matrilin-3溶液中加入80微升浓度为1毫克/毫升的水悬浮液Janus Base纳米管（JBNts）。反复吹打以确保充分混匀。对于 JBNt 组，将 5 微升浓度为 1 毫克/毫升的 JBNts 加入 50 微升水中，配制成 90.9 微克/毫升的溶液。对于 Matrilin-3 组，将 40 微升浓度为 10 微克/毫升的 Matrilin-3 加入 15 微升水中，配制成 7.3 微克/毫升的溶液。对于TGF-B1组，将10微升浓度为10微克/毫升的TGF-B1加入45微升水中，配制成1.8微克/毫升的溶液。对于Janus Base Nano-Matrix（JBNm）组，将40微升浓度为10微克/毫升的Matrilin-3与10微升浓度为10微克/毫升的TGF-B1混合。充分振荡以确保混合均匀。然后，向溶液中加入 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts，反复吹打混匀样品。使用分光光度计测定每组的吸收光谱。按照生产商说明书，使用蛋白质标记试剂盒对 TGF-B1 进行标记。取20微升浓度为20微克/毫升的标记TGF-B1，加入25微升水中，配制成8.9微克/毫升的测试溶液。使用单独的标记试剂盒对Matrilin-3进行标记。取20微升浓度为80微克/毫升的标记Matrilin-3，加入25微升水中，配制成36微克/毫升的测试溶液。将20微升浓度为80微克/毫升的标记Matrilin-3与20微升浓度为20微克/毫升的标记TGF-B1以及5微升水混合，得到标记的TGF-B1与Matrilin-3复合物。用移液器反复吹打混合数次。将5微升浓度为1毫克/毫升的JBNts加入40微升水中，配制成浓度为111微克/毫升的溶液。然后向标记有 TGF-B1、Matrilin-3 的溶液中加入 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts，反复吹打以混匀化合物。将每组样品转移至黑色 384 孔板的孔中。将该板放入多功能微孔板读数仪，按照制造商的操作说明，在激发波长 488 nm 和 555 nm 下进行检测。在生理条件下，由于等电点的影响，Matrilin-3 的 zeta 电位呈负电性。在向 Matrilin-3 中加入 TGF-B1 后，TGF-B1 与 Matrilin-3 复合物的 zeta 电位升高至接近中性。JBNm 的 zeta 电位在三组中最高。紫外-可见吸收光谱证实了JBNm具有逐层构建的层级内部结构，其中赖氨酸侧链的芳香环以及JBNts分别在220纳米和280纳米处产生了吸收峰。采用透射电子显微镜（TEM）对JBNts和JBNm的形貌进行表征。与蛋白质结合后，观察到JBNm形成较粗的束状结构，构成支架样结构。荧光显微镜证实了逐层结构的存在，并展示了JBNm的横截面。经标记后，红色荧光的Matrilin-3包裹着JBNt束，并构成JBNm的外层，而绿色荧光的TGF-B1则形成内层。荧光共振能量转移在520纳米处显示标记的TGF-B1基团的发射峰，在570纳米处显示Matrilin-3基团的发射峰。探讨了JBNm对HMSC黏附和细胞增殖的影响。结果显示，HMSCs沿JBNm聚集，而在JBNts上黏附的细胞较少。细胞在JBNm上的排列方式及细胞大小表明，JBNts在细胞黏附中发挥作用，而蛋白质则增强了细胞黏附的亲和力。细胞培养第一天后，JBNm 和 TGF-B1 组的细胞增殖情况显著高于其他组。当细胞培养时间延长至三天和五天时，JBNm 和 TGF-B1 组的细胞增殖进一步增加。对 JBNm 进行荧光标记时，应先分别标记 TGF-B1 和 Matrilin-3，混合后再加入 JBNts，以确保逐层结构的正确形成。对支架的进一步评估有助于理解其在治疗应用中的有效性。更具体而言，高通量增殖实验可用于确定体外最佳给药剂量，并进一步应用于体内研究。这种新型 NanoMatriX 技术使研究人员能够利用基于纳米材料的可注射支架来实现软骨再生。这种多聚模拟方法可增强雄核发育并抑制位点增殖。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

促进软骨再生的逐层Janus碱基纳米基质的制备和表征

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。...

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

本文所述方法展示了如何将商用喷墨打印机改装为具有同步紫外光聚合功能的生物打印机。该打印机能够利用细胞和生物材料构建三维组织结构。本研究成功构建了三维新生软骨。...

利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

在微流控装置中构建功能性微组织需要通过将传统细胞培养技术适应微器件的有限空间尺寸，以稳定细胞表型。对胶原蛋白进行修饰可实现超薄胶原组装体的逐层沉积，从而在微流控组织模型中稳定原代细胞（如肝细胞）。...

逐层胶原沉积微流控装置用于微组织稳定化

具有异质细胞群体的承重组织的构建与分析仍是一项挑战。本文中，我们描述了一种制备双层海藻酸盐水凝胶圆盘的方法，该圆盘可作为在同一结构内共培养不同细胞群体的平台。...

分层海藻酸盐构建体：异质细胞群体共培养平台

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

脱细胞软骨来源的支架可作为引导软骨修复的支架材料，并可用于再生骨软骨组织。本文详细描述了脱细胞过程，并提供了在体外环境中使用这些支架的建议。...

脱细胞软骨来源基质支架的制备

本方案描述了制备嵌入含有脱细胞基质（DM）的聚乳酸（PLA）微球的聚己内酯（PCL）丝材的方法，用于3D打印结构组织工程支架。...

用于3D打印脱细胞基质的新工艺

本实验方案的目的是展示由Janus基底纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组装仿生纳米基质（NM）的方法。当与人源间充质干细胞（hMSCs）共培养时，该纳米基质在促进hMSCs黏附方面表现出优异的生物活性。...

基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

本文介绍了一种制备脱细胞软骨细胞外基质（DC-ECM）水凝胶的新方法。DC-ECM水凝胶具有优异的生物相容性，可为细胞生长提供优越的微环境，因此可作为理想的细胞支架和生物递送系统。...

脱细胞软骨细胞外基质水凝胶的制备

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

学习逐层Janus碱基纳米基质（JBNm）的组装与表征方法，用于软骨组织再生。该技术封装TGF-β1实现局部控释，为生物材料与再生医学研究提供可注射支架方案。

层层自组装制备与表征双面纳米基质以促进软骨再生

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