完整肾脏三维染色技术（CUBIC）
2022年7月18日
本方案描述了一种用于肾脏三维（3D）成像的组织透明化方法及整体免疫荧光染色技术。该技术可提供肾脏病理学的宏观视角，有助于获得新的生物学发现。
该方案可实现对完整肾脏中三维结构的可视化，通过提供宏观视角，有助于推动肾脏研究领域的创新性发现。由于抗体难以穿透组织，整体器官染色具有较大挑战性。本方案展示了利用抗体对肾脏进行高质量的整体染色效果。
首先，在灌注固定和肾脏取样后立即进行浸入式固定，即将肾脏浸入4%多聚甲醛中，在4摄氏度条件下固定16小时。使用PBS洗涤三次，每次两小时。将固定后的肾脏置于14毫升圆底管中，加入7毫升50%CUBIC-L溶液，在室温下轻轻振荡，进行脱色和脱脂处理。
六小时后，将肾脏浸入含有7毫升CUBIC-L的14毫米圆底管中，在37摄氏度下轻轻振荡处理五天。每天更换一次CUBIC-L。当脱色和脱脂完成后，使用移液勺进行样品操作，并在室温下用PBS洗涤肾脏三次，每次两小时。
将脱脂后的肾脏置于含有稀释的一抗的染色缓冲液中，在37摄氏度的摇床孵育器中轻轻振荡孵育七天。随后，用含0.5% Triton X-100的PBS（即PBST）在室温下洗涤肾脏一天。进行二抗染色时，将肾脏置于染色缓冲液中的二抗溶液中，避光并在37摄氏度下轻轻振荡孵育七天。
在室温下用 PBST 洗涤一天以固定染色。后固定步骤中，将肾脏浸入含 1% 甲醛的 PB 溶液中 3 小时，然后在室温下用 PBS 洗涤 6 小时。通过将肾脏置于 14 毫升圆底管中，加入 7 毫升 50% CUBIC-R+ 溶液，在摇床上孵育一天进行折射率匹配，随后在室温下用 7 毫升 CUBIC-R+ 溶液继续在摇床上处理两天。
借助免疫染色方法，可在全肾三维成像中可视化交感神经和动脉。此外，缺血-再灌注损伤后可观察到异常的肾交感神经。该方案还有助于在全脾脏中可视化交感神经。
此处展示了三维免疫荧光染色的数据量化过程。此外，集合管、近端小管的S1段以及肾小球在完整肾脏中均成功实现了可视化。通过在糖尿病肾病早期阶段给药所抑制的肾小球肿大，也在三维成像中得以可视化。
该方案可对整个肾脏内的特定分子进行标记，从而使研究人员能够分析血管系统的结构变化，或在肾组织中发现罕见事件。
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概述
该方案可实现对完整肾脏中三维结构的可视化，提供宏观视角，有助于推动肾脏研究领域的创新性发现。该方法包括组织透明化处理和整体免疫荧光染色，以提高成像质量。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 病理学
背景
- 由于抗体渗透困难，整体器官染色具有挑战性。
- 高质量的染色对于准确的三维成像至关重要。
- 本方案解决了肾脏成像中的常见问题。
- 宏观视角可带来新的生物学见解。
研究目的
- 建立一种可靠的三维肾脏成像方法。
- 增强肾脏结构的可视化效果。
- 促进肾脏病理学领域的创新性发现。
使用的方法
- 在 4°C 下用 4% 多聚甲醛浸没固定 16 小时。
- 用 PBS 洗涤三次，每次两小时。
- 使用 50% CUBIC-L 进行脱色和脱脂。
- 脱脂过程中在室温下轻轻振荡。
主要结果
- 展示了高质量的肾脏整体染色。
- 实现了更优的抗体渗透。
- 提供了肾脏结构的清晰三维可视化图像。
- 实现了宏观视角，有助于更好地理解肾脏病理学。
结论
- 该方案成功增强了肾脏成像技术。
- 它为肾脏研究中的新发现开辟了途径。
- 未来的研究可在此方法基础上获得更深入的见解。
常见问题
行业重要性概述
采用CUBIC技术对整个肾脏进行三维染色，可全面可视化肾微结构，克服了传统病理学的局限性。该技术能够实现对血管、肾小管、肾小球及交感神经的高分辨率成像，为肾脏疾病研究中的早期发现和机制性风险排除提供关键见解。该方法在临床前项目推进的关键转折点上显著提升了预测的可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单细胞分辨率下解析肾脏结构和细胞网络。
- 通过可视化损伤或干预后的结构变化，支持生物学风险降低。
- 通过全面绘制交感神经和肾小球的分布图谱，促进功能靶点的验证。
- 提高优先筛选肾脏疾病靶点的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游成像和定量分析工作流程制备经过验证的三维生物系统。
- 标准化全器官染色流程，确保不同研究间结果具有可重复性和可比性。
- 实现对肾脏组织中稀有事件和结构变化的可扩展成像。
- 支持对化合物对肾微细解剖结构影响的可靠评估。
转化与临床前研究
- 将三维成像结果与疾病相关的生物标志物（如肾小球肥大）进行对齐。
- 通过可视化干预效应，实现从发现到临床前验证的连贯性。
- 基于全面的组织分析，支持进行风险调整后的研发推进决策。
- 为转化性肾脏研究项目提供可预测的风险评估支持。
流程与工作流整合
这种全肾脏3D染色方案可融入从发现到临床前研究的连续流程，支持肾病研究中的假设验证、靶点确证以及转化生物标志物的比对。
- 发现生物学：通过绘制肾脏结构和损伤反应图谱，促进假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可直接用于检测的、可重复的三维成像结果，用于实验条件的定量比较。
- 分析：实现对结构变化的测量与量化，支持可靠的统计分析。
- 转化研究：将成像结果与疾病模型及早期生物标志物识别相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的全器官成像平台，适用于肾脏及相关组织研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高肾脏靶点验证的预测可信度，降低机制上的不确定性。
- 操作价值：提供标准化、可扩展且可重复的三维成像工作流程。
- 战略价值：通过实现全面的组织分析，改善项目推进或终止的决策过程，提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的肾脏疾病项目优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备组织透明化、免疫染色和三维成像分析方面的专业技术。
- 需要能够使用先进的成像仪器和计算分析工具。
- 要求跨团队标准化操作，以确保可重复性和数据可比性。
- 可能需要根据不同的器官系统或抗体组合进行调整。
- 抗体渗透和染色时间是全器官成像的实际限制因素。
