Name: 用立方体进行全肾三维染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 31 s
Description: 了解使用CUBIC-L透明化技术进行全肾三维免疫荧光染色的完整实验方案。该方法通过组织透明化和抗体渗透优化，实现肾脏宏观结构的清晰三维成像，为肾脏病理学研究提供创新视角。

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本工作部分是通过与东京大学的Hiroki R. Ueda教授、顺天堂大学的Etsuo A. Susaki教授、东北大学的Tetsuhiro Tanaka教授、东海大学的Masafumi Fukagawa教授、Takehiko Wada博士以及Hirotaka Komaba博士合作完成的。

所有实验均经东京大学机构审查委员会批准。所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的指导原则进行。本研究使用了8周龄的雄性C57BL/6NJcl小鼠，小鼠购自商业来源（见材料表）。
1. 动物准备与肾脏固定
<ol>
	<li>按照以下步骤进行灌注固定。
	<ol>
		<li>通过吸入异氟烷（3%，2.0 L/min）以及腹腔注射盐酸美托咪啶（0.3 mg/kg）、酒石酸布托啡诺（5 mg/kg）和咪达唑仑（4 mg/kg）对小鼠进行麻醉（参见材料表）。</li>
		<li>经心脏左心室灌注20 mL PBS（pH 7.4）和30 mL 4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在灌注固定及肾脏取样后立即进行浸没固定9。
	<ol>
		<li>将肾脏置于4%多聚甲醛中，4 °C条件下继续固定16 h，随后用PBS洗涤2 h（共三次）9（图1）。 
		&#8203;注意：甲醛和多聚甲醛为有毒刺激物。操作时应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脱色与脱脂
<ol>
	<li>配制用于脱色和脱脂的CUBIC-L溶液，包含10 wt% Triton X-100和10 wt% N-丁基二乙醇胺（参见 材料表），参照先前已发表的报告4,8,9.</li>
	<li>按照以下步骤使用CUBIC-L进行脱色和脱脂。
	<ol>
		<li>将固定好的肾脏置于14 mL圆底管中，加入7 mL 50% (v/v) CUBIC-L（水与CUBIC-L按1:1体积比混合），浸没组织（见 材料表）在室温下轻轻振荡孵育6小时（图2A然后，将其浸入14 mL圆底管中的7 mL CUBIC-L溶液中，在37 °C下轻轻振荡孵育5天。</li>
		<li>在此过程中每天更换CUBIC-L。脱色和脱脂过程结束后，用PBS在室温下洗涤肾脏2小时（共三次）。9 (图1）。使用分液勺进行样品处理（图2B).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 整体免疫荧光染色
<ol>
	<li>准备染色缓冲液。
	<ol>
		<li>通过将0.5% (v/v) Triton X-100、0.5% 酪蛋白溶于PBS，并加入0.05% 叠氮化钠9，配制用于一抗的染色缓冲液。</li>
		<li>通过将0.5% (v/v) Triton X-100、0.1% 酪蛋白溶于PBS，并加入0.05% 叠氮化钠9，配制用于二抗的染色缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行一抗染色。
	<ol>
		<li>在染色缓冲液中，加入一抗（1:100 或 1:200，参见材料表），于37 °C、轻柔振荡条件下对脱脂肾脏进行免疫染色，持续7天。 
		注意：单个肾脏所需的染色缓冲液体积为500–600 µL（图2C）。</li>
		<li>在室温下，用含0.5% (v/v) Triton X-100的PBS（PBST）洗涤肾脏1天9（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行二抗染色。
	<ol>
		<li>在染色缓冲液中，加入二抗（1:100 或 1:200，参见材料表），于37 °C、轻柔振荡条件下对肾脏进行免疫染色，持续7天。随后在室温下用PBST洗涤肾脏1天9（图1）。</li>
		<li>后固定9：将肾脏浸入含1% 甲醛的PB溶液（37% 甲醛与PB按1:36比例混合）中，固定3小时，随后在室温下用PBS洗涤6小时（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 折射率（RI）匹配
<ol>
	<li>配制 CUBIC-R+。
	<ol>
		<li>通过混合 45 wt% 的 2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林和 30 wt% 的烟酰胺来配制 CUBIC-R（见材料表）。</li>
		<li>按照先前发表的文献方法4,8,9，向 CUBIC-R 中加入 0.5 v% 的 N-丁基二乙醇胺，配制成用于折射率（RI）匹配的 CUBIC-R+。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行折射率匹配。
	<ol>
		<li>将肾脏组织置于含有 7 mL 50%（v/v）CUBIC-R+（水与 CUBIC-R+ 按 1:1 体积比混合）的 14 mL 圆底管中，在室温下轻轻振荡孵育 1 天。随后，将其转移至另一含有 7 mL 纯 CUBIC-R+ 的 14 mL 圆底管中，在室温下继续轻轻振荡孵育 2 天9（图 1）。 
		注意：尽管在折射率匹配初期肾脏组织会漂浮于 50% CUBIC-R+ 溶液中，但在 CUBIC-R+ 处理结束时，组织会下沉并变得透明（图 2D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 图像采集与重建
<ol>
	<li>在图像采集过程中，将折射率匹配的肾脏浸入硅油（折射率 = 1.555）与矿物油（折射率 = 1.467）按55:45比例混合的溶液中（总体折射率 = 1.51）5（图3）。</li>
	<li>使用自行搭建的9光片荧光显微镜（见材料表）对整个肾脏进行三维成像。所有原始图像数据以16位TIFF格式保存。使用图像分析软件（Imaris，见材料表）对三维重建图像进行可视化观察与图像采集。</li>
</ol>

<ol><li>Velez-Fort, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stimulus+selectivity+and+connectivity+of+layer+six+principal+cells+reveals+cortical+microcircuits+underlying+visual+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The stimulus selectivity and connectivity of layer six principal cells reveals cortical microcircuits underlying visual processing.</a> Neuron. 83 (6), 1431-1443 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Landscape+for+Tissue+Clearing+Based+on+Hydrophilic+Reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical Landscape for Tissue Clearing Based on Hydrophilic Reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution%3A+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li>
<li>Keller, P. J., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+three-dimensional+analysis+%28CUBIC-kidney%29+visualizes+abnormal+renal+sympathetic+nerves+after+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Comprehensive three-dimensional analysis (CUBIC-kidney) visualizes abnormal renal sympathetic nerves after ischemia/reperfusion injury.</a> Kidney International. 96 (1), 129-138 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., Inoue, T., Inagi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and kidney disease.</a> Kidney Research and Clinical Practice. 38 (3), 282-294 (2019).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oral+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibitor+enarodustat+counteracts+alterations+in+renal+energy+metabolism+in+the+early+stages+of+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The oral hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor enarodustat counteracts alterations in renal energy metabolism in the early stages of diabetic kidney disease.</a> Kidney International. 97 (5), 934-950 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+sympathetic+signaling+in+macrophages+blocks+systemic+inflammation+and+protects+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Activation of sympathetic signaling in macrophages blocks systemic inflammation and protects against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 32 (7), 1599-1615 (2021).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11 (1), 1-22 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案实现了对交感神经、集合管、动脉、近端小管和肾小球等多种结构的全肾三维成像9,10,11。该染色方法可进行宏观观察，并推动了新的生物学发现，例如通过可视化缺血-再灌注损伤后肾交感神经的变化9,10，以及糖尿病肾病早期阶段的肾小球肥大11。
组织的不透明性源于其光学上的非均质性5。各种组织透明化方法的共同原理是去除导致光散射或吸收的成分，并用折射率匹配的试剂填充所留空间。与基于有机溶剂的方法（如3D成像溶剂透明化器官法（3DISCO/iDISCO）3,14）相比，CUB...

肾脏由多种细胞群体组成。尽管传统病理学为我们提供了大量关于肾脏微环境的信息，但仍需要三维（3D）成像技术来精确理解肾脏疾病进展过程中的细胞间相互作用。过去，实现全器官三维成像需要进行大量连续切片和图像重建工作1。然而，该方法耗时耗力，且在可重复性方面存在诸多问题。
光学透明化是克服这一障碍的有效策略2,3。组织不透明主要源于光的散射和吸收，因为每种器官都由多种物质组成，包括水、蛋白质和脂质。因此，组织透明化的基本策略是用水和脂质可渗透的折射率（RI）匹配试剂替代组织中的水和脂质，使这些试剂的光学性质与蛋白质相匹配4。为了观察透明样本，光片荧光显微镜技术非常有用5。光片从侧面照射透明样本，激发信号则通过位于垂直位置的物镜采集6。该显微技术可在单次扫描中获取横截面信息，不同于共聚焦或双光子荧光显微镜。因此，它能够以较低的光漂白水平快速获取z轴堆叠图像。
透明、无阻碍的脑/全身成像鸡尾酒法及计算分析（Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational Analysis，CUBIC）是一种组织透明化技术，可结合光片荧光显微镜实现整个器官的成像2,7,8。本研究优化了CUBIC技术与整体免疫荧光染色方法，用于可视化小鼠肾脏的三维结构9,10,11。利用该整体染色方法，可在全肾脏中观察到缺血-再灌注损伤后肾交感神经的变化9,10、糖尿病肾病早期的肾小球肿大11，以及血管、近端小管和集合管的结构9。

<table><tbody><tr><td>14 mL 圆底高透明度聚丙烯试管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>组织透明化、染色、洗涤</td></tr><tr><td>2,3-二甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮/安替比林</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>D1876</td><td>CUBIC-R+</td></tr><tr><td>37% 甲醛溶液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>16223-55</td><td>后固定</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-85</td><td>肾脏固定</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的驴抗羊 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-21436</td><td>二抗（1:100）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的驴抗兔 IgG 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>二抗（1:200）</td></tr><tr><td>抗水通道蛋白 2（AQP2）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab199975</td><td>一抗（1:100）</td></tr><tr><td>抗足细胞蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372</td><td>一抗（1:100）</td></tr><tr><td>抗钠-葡萄糖共转运蛋白 2（SGLT2）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab85626</td><td>一抗（1:100）</td></tr><tr><td>抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab113</td><td>一抗（1:100）</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白（&amp;alpha;-SMA）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>一抗（1:200）</td></tr><tr><td>PBS 中的酪蛋白封闭剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>37528</td><td>染色缓冲液</td></tr><tr><td>酒石酸布托啡诺</td><td>Meiji</td><td>005526</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>C57BL/6NJcl</td><td>Nippon Bio-Supp.Center</td><td>N/A</td><td>小鼠品系</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>成像分析软件</td></tr><tr><td>宏变焦显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td>定制显微镜的观察单元</td></tr><tr><td>盐酸美托咪啶</td><td>Kyoritsu-Seiyaku</td><td>008656</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>SANDOZ</td><td>27803229</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>浸油</td></tr><tr><td>N-丁基二乙醇胺</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>B0725</td><td>CUBIC-L, CUBIC-R+</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>N0078</td><td>CUBIC-R+</td></tr><tr><td>聚乙二醇单对异辛基苯基醚/Triton X-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-45</td><td>CUBIC-L, PBST</td></tr><tr><td>硅油 HIVAC-F4</td><td>Shin-Etsu Chemical</td><td>50449832</td><td>浸油</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Wako</td><td>195-11092</td><td>染色缓冲液</td></tr></tbody></table>

完整肾脏三维染色技术（cubic）

Whole-Kidney Three-Dimensional Staining with CUBIC

尽管传统病理学提供了大量关于肾脏微结构的信息，但由于缺乏三维（3D）信息，仍难以精确了解肾脏内血管、近端小管、集合管、肾小球及交感神经的精细结构。光学透明化是一种克服这一重大障碍的有效策略。通过结合组织透明化与三维成像技术，可在单细胞分辨率下对完整器官中的多个细胞进行分析。然而，适用于完整器官成像的细胞标记方法仍不完善。特别是整体器官染色面临抗体穿透困难的挑战。本方案开发了一种基于CUBIC（透明无阻脑/体组织成像试剂与计算分析）组织透明化方法的小鼠肾脏整体染色技术，用于三维成像。该方案已成功实现从整体视角可视化缺血-再灌注损伤后的肾脏交感去神经化现象，以及糖尿病肾病早期阶段的肾小球肥大。因此，该技术通过提供宏观视角，有望推动肾脏研究领域的新发现。

利用该染色方法，可对整只肾脏中的交感神经[抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体]和动脉[抗α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）抗体]进行可视化观察（图4A、B 和 视频1）9。在缺血/再灌注损伤（IRI）后，异常的肾交感神经也可被可视化9,10（图4C）。此外，利用该方案还可实现对整个脾脏中交感神经的可视化13（图4D）。图5展示了对三维免疫荧光数据进行定量分析的一个示例。
此外，成功实现了对完整肾脏中集合管[抗水通道蛋白2（AQP2）抗体]、近端小管S1段[抗钠-葡萄糖协同转运蛋白2...

本方案描述了一种用于肾脏三维（3D）成像的组织透明化方法及整体免疫荧光染色技术。该技术可提供肾脏病理学的宏观视角，有助于获得新的生物学发现。

完整肾脏三维染色技术（CUBIC）

尽管传统病理学提供了大量关于肾脏微结构的信息，但难以获知血液微循环的精确结构……

该方案可实现对完整肾脏中三维结构的可视化，通过提供宏观视角，有助于推动肾脏研究领域的创新性发现。由于抗体难以穿透组织，整体器官染色具有较大挑战性。本方案展示了利用抗体对肾脏进行高质量的整体染色效果。首先，在灌注固定和肾脏取样后立即进行浸入式固定，即将肾脏浸入4%多聚甲醛中，在4摄氏度条件下固定16小时。使用PBS洗涤三次，每次两小时。将固定后的肾脏置于14毫升圆底管中，加入7毫升50%CUBIC-L溶液，在室温下轻轻振荡，进行脱色和脱脂处理。六小时后，将肾脏浸入含有7毫升CUBIC-L的14毫米圆底管中，在37摄氏度下轻轻振荡处理五天。每天更换一次CUBIC-L。当脱色和脱脂完成后，使用移液勺进行样品操作，并在室温下用PBS洗涤肾脏三次，每次两小时。将脱脂后的肾脏置于含有稀释的一抗的染色缓冲液中，在37摄氏度的摇床孵育器中轻轻振荡孵育七天。随后，用含0.5% Triton X-100的PBS（即PBST）在室温下洗涤肾脏一天。进行二抗染色时，将肾脏置于染色缓冲液中的二抗溶液中，避光并在37摄氏度下轻轻振荡孵育七天。在室温下用 PBST 洗涤一天以固定染色。后固定步骤中，将肾脏浸入含 1% 甲醛的 PB 溶液中 3 小时，然后在室温下用 PBS 洗涤 6 小时。通过将肾脏置于 14 毫升圆底管中，加入 7 毫升 50% CUBIC-R+ 溶液，在摇床上孵育一天进行折射率匹配，随后在室温下用 7 毫升 CUBIC-R+ 溶液继续在摇床上处理两天。借助免疫染色方法，可在全肾三维成像中可视化交感神经和动脉。此外，缺血-再灌注损伤后可观察到异常的肾交感神经。该方案还有助于在全脾脏中可视化交感神经。此处展示了三维免疫荧光染色的数据量化过程。此外，集合管、近端小管的S1段以及肾小球在完整肾脏中均成功实现了可视化。通过在糖尿病肾病早期阶段给药所抑制的肾小球肿大，也在三维成像中得以可视化。该方案可对整个肾脏内的特定分子进行标记，从而使研究人员能够分析血管系统的结构变化，或在肾组织中发现罕见事件。

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用立方体进行全肾三维染色

本视频演示了一种利用CUBIC（透明、无阻碍的脑/体成像鸡尾酒溶液及计算分析）组织透明化方法结合免疫荧光染色技术，对小鼠肾脏进行整体染色的实验方法。肾脏经过组织透明化处理，包括去脂、脱色以及折射率匹配溶液处理，从而使组织变得透明，以实现最佳的三维成像效果。随后使用荧光标记的抗体对组织进行染色，并在光片显微镜下观察肾脏中的交感神经和动脉结构。...

一种用于肾脏三维成像的全器官整体染色技术

组织工程化肾脏结构为解决器官短缺及透析带来的有害影响提供了一种方案。本文描述了一种从小鼠肾脏中显微解剖分离皮质-髓质节段的实验方案。这些节段被植入无支架的细胞结构中，形成肾脏类器官。...

原发性肾组织节段的显微解剖及其与新型无支架构建技术的整合

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。...

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

本文介绍了一种利用专为X射线计算机断层扫描设计的X射线特异性染色方法，对微观组织结构进行三维可视化的实验方案。...

利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

本研究描述了两种用于研究器官发育的方法：一种是改进的禽类胚胎绒毛尿囊膜（CAM）异种移植体系，可实现培养的胚胎器官和类器官的血管化；另一种是新型的固定z轴方向器官培养方法，通过优化实验条件，可实现高分辨率的共聚焦显微镜延时成像。...

肾类器官和类器官型培养的优化：促进血管化、延长发育及改善显微成像

本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对厚度从100...

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

该方法展示了一种基于体素的3D打印工作流程，可直接从医学影像进行打印，具有精确的空间保真度以及空间和对比度分辨率。这使得能够对形态复杂、梯度变化的材料实现精确且渐进的材料分布控制，且材料分布与放射密度相关，同时不丢失或改变原始数据。...

体素打印解剖学：通过位图打印设计与制造用于术前规划的逼真模型

本文介绍了一种利用双光子显微镜在具有表层肾小球的慕尼黑维斯塔大鼠中定量研究长期输尿管梗阻对肾小球动力学和功能影响的实验方案。...

利用双光子显微镜定量分析单侧输尿管慢性梗阻对肾小球结构的影响

本研究提供了一套易于使用、完整且简便的方法，用于标记和分析经CUBIC透明化处理的小鼠肾脏中的肾小球。利用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖、光片荧光显微镜（LSFM）或常见的共聚焦显微镜，结合Imaris等软件，可轻松、可靠地获取肾小球数量和体积等数据。...

一种高效快速的小鼠肾小球标记与分析方法

在此，我们介绍了利用胶原蛋白及胶原蛋白-琼脂糖基质在微生理系统中建立三维细胞培养的具体操作方案。这些方案支持肾近端小管细胞与肾细胞癌球状体的共培养，以模拟 体内...

利用微流控共培养健康与肿瘤肾上皮细胞模拟肾癌进展

本文介绍了一种用于表征腹膜转移灶三维结构的多重免疫荧光染色方案。...

采用迭代漂白扩展多重性方法对荷瘤组织进行三维成像

了解使用CUBIC-L透明化技术进行全肾三维免疫荧光染色的完整实验方案。该方法通过组织透明化和抗体渗透优化，实现肾脏宏观结构的清晰三维成像，为肾脏病理学研究提供创新视角。

完整肾脏三维染色技术（CUBIC）

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