Name: 通过三维细胞培养基质的紫外光图案化产生多库细胞微环境 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解利用紫外光图案化技术制备三维细胞培养基质的方法，结合多种微环境信号研究细胞行为。该方法使用PDMS材料和蛋白质图案化，为体外生理相关性研究提供可靠平台。

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我们感谢 Nello Formisano 博士（MERLN 再生医学技术研究所）提供人原代角膜细胞。本工作得到了 Chemelot InSciTe（项目 BM3.02）；欧洲研究理事会（资助编号 851960）；以及荷兰教育、文化和科学部对“材料驱动再生”重力计划 024.003.013 &#34;Materials Driven Regeneration&#34; 的支持。作者谨向 Alvéole 公司致谢，感谢他们的沟通、协助与技术支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

如今，细胞行为的研究通常在缺乏天然细胞微环境复杂性的平面培养基质上进行。三维环境（如支架和水凝胶）被用作替代方案。尽管这些细胞培养环境改善了 体内 相关性，对细胞行为的系统性研究以及读出方法的可行性仍然具有挑战性。为了系统地研究细胞在代表性培养基质上的行为，需要能够实现显微观察的、具有一致性的多信号基质。因此，在本方案中，我们描述了一种制备具有生理相关几何结构和图案化细胞外基质（ECM）蛋白的多信号细胞培养基质的方法。将组织几何结构和接触引导信号等环境刺激因素相结合的主要挑战在于 体外 平台的技术性质在很大程度上属于技术层面。传统施加接触引导线索的方法（例如软光刻、深紫外光刻和微接触印刷）35,36) 对细胞培养材料的优化主要针对平面基底。三维细胞培养材料与接触引导信号相结合的需求凸显了若干技术挑战，例如图案对准性差、分辨率低以及灵活性不足。为克服这些挑战，可采用一种高通量、无掩模、基于光的图案化方法45,49此处，光学显微镜可实现精确的图案对准，分辨率达到微米级（参见 图6此外，使用数字掩膜使研究人员能够研究细胞在多种图案上的行为，而无需制备费时费力的物理掩膜。 
紫外光图案化方法可与多种由不同材料制成的三维几何结构（例如圆柱体、马鞍形、穹顶形、凹坑）结合使用48。本研究中使用的三维细胞培养基底由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成；然而，也可使用其他材料。这可能需要采用不同的步骤来制备最终包含目标特征的细胞培养基底。由于已有研究表明细胞对细胞培养材料的表面粗糙度敏感，因此创建具有光滑表面的细胞培养芯片至关重要，以确保所观察到的细胞反应完全归因于三维几何结构和接触引导信号50,51。可采用光学轮廓仪、扫描电子显微镜或原子力显微镜等测量方法来评估表面粗糙度。在细胞培养材料制备完成后，可根据目标特征的具体尺寸选择基于单个或多个焦平面的图案化方法（见图3）。通常，使用单个焦平面可在约50 µm的Z轴范围内对某一区域进行图案化。实践表明，采用这一经验法则可保持图案分辨率的一致性（见图6）。然而，该方法的一个缺点是引入多个焦平面和图案后会显著增加图案化时间。在我们的实验中，利用多个焦平面，已成功实现了尺寸达16 mm × 16 mm × 0.17 mm（X × Y × Z）的三维几何特征的高质量图案化。
此外，需要指出的是，本方案可结合使用的几何特征的高度（Z轴方向）存在一定的限制。由于紫外光刻和许多细胞检测均依赖显微镜系统，物镜的工作距离决定了特征结构的最大高度。在我们的实验条件下，高度超过300 µm的几何结构仍可进行紫外光刻，并已使用配备40倍物镜的共聚焦显微镜完成检测。因此，利用本方案可实现从细胞内、细胞水平到组织尺度的 mechanobiological（机械生物学）研究。
另一个需要考虑的因素是样品在紫外光刻过程中或之后发生干燥的风险49。当使用三维结构时，这一问题尤为突出，因为凸起部分通常暴露在细胞培养材料之外。如图4所示，这可能导致图案不均匀，并在目标结构表面形成蛋白质聚集体。在蛋白质孵育后以及细胞培养期间对细胞培养芯片进行清洗，对于实现三维结构的均匀包被至关重要。因此，建议始终在细胞培养芯片表面保留少量工作溶液（如PBS、PLPP、蛋白质溶液或细胞培养基）。
迄今为止，已有多种蛋白质包被材料（纤连蛋白、I型和IV型胶原蛋白、明胶、FNC）以及多种细胞类型（人骨髓基质细胞、人肌成纤维细胞、人内皮细胞、人角膜细胞和真皮成纤维细胞）与所述的光图案化方法结合，应用于结构化的细胞培养材料。如先前一项研究48所示，优化蛋白质孵育参数对于在新细胞类型中进行系统性研究至关重要。因此，在使用新的蛋白质或细胞开展新实验之前，建议测试一系列蛋白质浓度、孵育温度和孵育时间。通过比较细胞在均一的、图案化平坦区域上初始黏附后的形态与在“常规”细胞培养条件下的细胞形态，可以获得一组优化的实验参数。此外，不同细胞类型可能需要不同的接种后时间，才能在特定的多信号环境中呈现出可识别的黏附形态（见图5）。为此，在步骤8.4的洗涤过程中，优化每种细胞类型在图案化区域上呈现接触事件所需的时间至关重要。例如，我们观察到，在条纹图案上，人角膜细胞在接种后30分钟内即表现出伸长的形态，而内皮细胞和真皮成纤维细胞则需要数小时才能显示出黏附形态的变化。因此，蛋白质孵育（步骤7）和细胞接种（步骤8）所需的实验参数可能取决于所选用的蛋白质和细胞类型。
在三维几何结构上施加接触引导信号的研究方法有助于深入理解细胞在复杂多信号环境中的行为。该方法可应用于对细胞内组分（如黏着斑和细胞核）的研究，也可用于在较大尺度上开展细胞或组织水平的实验。最终，有望将获得的知识应用于组织工程设计，通过构建复杂的细胞微环境来引导细胞行为，实现预期的生物学效应。

体内，细胞会受到来自细胞外基质（ECM）的各种机械、物理和生化性质的环境信号作用。已有大量环境信号被证实对调控细胞行为（如增殖、分化和迁移）起着至关重要的作用1,2,3,4,5。其中被广泛研究的现象之一是接触引导，即细胞通过黏附介导沿细胞外基质中存在的各向异性生化或拓扑结构排列6,7,8,9,10,11。除了引导细胞排列方向外，接触引导信号还被证明会影响其他细胞特性，如细胞迁移、细胞内蛋白的组织、细胞形态以及细胞命运12,13,14,15。此外，三维细胞环境的几何结构也被认为对细胞行为具有调控作用16,17。在人体中，细胞暴露于多种曲面几何结构中，尺度范围从微米级的胶原纤维、毛细血管和肾小球，到中等尺度的肺泡和动脉18,19。有趣的是，近期的体外研究表明，细胞能够感知并响应从纳米到中等尺度的此类物理信号20,21,22,23。
迄今为止，大多数研究细胞对环境信号响应的实验主要采用分离单一信号的实验设计。尽管这种方法极大地推动了人们对细胞感知环境信号基本机制的理解，但却难以真实再现细胞在体内所处的复杂环境 体内 能够同时呈现多种线索的环境。为了弥合这一差距，开发一种可独立且同时调控多种环境线索的培养平台具有重要意义。这一理念近年来受到越来越多的关注24,25，结合基质刚度与配体密度的研究26,27,28,29，基质硬度和孔隙率30，基质硬度和三维微环境体积31表面形貌与接触引导信号32,33,34以及具有介观曲率引导线索的纳米级接触引导线索23然而，以可控且高通量的方式将接触引导信号与多种三维几何结构相结合仍具挑战性。
本研究方案针对这一挑战，提出了一种方法，用于构建具有可控组合的细胞外基质蛋白图案化黏附区域（接触引导信号）与基底曲率（几何信号）的细胞培养基底。该方法能够以系统化和高通量的方式，在仿生多信号环境中解析细胞的响应行为。所获得的知识有助于进一步理解细胞在复杂环境中的行为，并可用于设计具有特定性能的指导性材料，以引导细胞反应达到预期结果。
三维蛋白质光刻图案化 
在细胞培养材料上创建细胞外基质（ECM）蛋白的黏附区域（接触引导信号）可通过多种技术实现，例如深紫外（deep-UV）光刻图案化或微接触印刷35,36。深紫外图案化利用紫外光透过掩膜投射到聚合物材料上，从而在细胞培养基底的特定位置降解钝化聚合物。随后将图案化基底与目标配体孵育，形成支持细胞黏附和培养的预定义黏附区域12,37,38。另一种引入蛋白质图案的方法是微接触印刷，该方法使用带有特定形状的弹性印章，将其涂覆选定的蛋白质后压印在细胞培养基底上，从而将蛋白质涂层转移至基底表面，供细胞黏附35,37,39,40。然而，由于这两种技术均依赖于掩膜制备和软光刻方法，实验过程耗时且劳动强度大，且在图案灵活性方面存在局限。此外，深紫外图案化和微接触印刷主要适用于平面材料，在三维环境中对配体进行图案化时，技术上极为困难，甚至无法实现。
为了改进这些传统方法，Waterkotte 等人结合了无掩模光刻、化学气相沉积和热压成型技术，以制备具有微图案的三维聚合物基底41。然而，该技术依赖于可热成型的聚合物薄膜，且蛋白质图案分辨率较低（7.5 µm），而已有研究表明细胞可响应小至 0.1 µm 的几何形蛋白质图案2,42。Sevcik&#160;等人描述了另一种有前景的方法，可在含有纳米和微米级形貌结构的基底上实现细胞外基质（ECM）配体的纳米级图案化43。该方法采用微接触印刷技术，将细胞外基质蛋白从聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章转移至温敏性聚（N-异丙基丙烯酰胺）（pNIPAM）基底上；随后，利用 pNIPAM 网络的温敏特性，将二维（2D）蛋白质图案转移至具有形貌结构的 PDMS 基底（沟槽深度为 10–100 µm），从而实现对形貌特征上黏附位点定位的控制。然而，并非所有可能的微米级形貌结构均可实现图案化，因为润湿性降低的问题使得在更深的形貌基底上进行图案化更加困难。据报道，沟槽深度与宽度的长宽比达到 2.4 时，已接近成功转移图案至形貌基底的极限43。此外，由于依赖微接触印刷技术，该方法在图案多样性及所生成图案分辨率方面均较为有限。
本文介绍了一种克服上述瓶颈的方法，提供了一种灵活且高通量的技术，用于制备可用于细胞培养的多线索基底（见图1）。在PDMS芯片中预先设计并微加工出具有生理相关性的几何结构（如圆柱形、穹顶形、椭圆形和鞍形表面），其曲率范围为 ĸ = 1/2500 至 ĸ = 1/125 µm-1。随后，通过采用分辨率达1.5 µm的光刻图案化技术，并结合多种数字图案设计，在这些三维几何结构表面构建接触引导线索44。具体而言，首先对PDMS芯片进行钝化处理，以防止细胞和蛋白质黏附；该钝化层随后可通过光引发剂4-苯甲酰基苄基三甲基氯化铵（PLPP）与紫外光照射的联合作用被选择性去除45。通过设计数字掩模来确定紫外光照射的位置，从而精确控制钝化层被去除的区域。蛋白质可选择性地吸附至这些区域，进而实现细胞的黏附。由于该图案化过程使用的是数字掩模（而非物理掩模），因此可快速生成多种不同的图案，避免了设计和制造额外光掩模所带来的繁琐流程与成本。此外，多种细胞外基质蛋白（如I型胶原、明胶和纤连蛋白）均可被图案化于该基底上。尽管本实验方案使用PDMS材料制成的细胞培养芯片进行操作，但该方法原理可推广至其他任意感兴趣的材料46。

<table><tbody><tr><td>抗连环蛋白抗体，小鼠单克隆 IgG1</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>稀释比例：1/600</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMi8 正置荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Biosolve</td><td>0005250210BS</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Serana</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ，版本 v1.53k</td><td>www.imageJ.nih.gov</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光标记笔</td><td>Stabilo</td><td>4006381333627</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记明胶</td><td>Invitrogen</td><td>G13187</td><td>浓度：0.01%</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Merck</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片 24 x 60 mm，#1</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，&amp;oslash; = 32 mm，#1</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL fluotar L 20X/0.40na 显微镜物镜</td><td>Leica</td><td>11506242</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>人皮肤成纤维细胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>人原代角质形成细胞</td><td>MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator，版本 26.0.1</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>Carbolite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸镁盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X 软件，版本 3.5.7.23225</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leonardo 软件，版本 4.16</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-manager，版本 1.4.23</td><td>Open imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>封片剂</td></tr><tr><td>mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，分子量 5,000 Da</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td>浓度：50 mg/mL</td></tr><tr><td>负型玻璃模具</td><td>FEMTOprint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes 试剂（Hoechst 33342）</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>2 滴/mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（&amp;oslash;=100 mm）</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽 Atto 647N</td><td>Sigma</td><td>65906</td><td>稀释比例：1/250</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>等离子体刻蚀仪</td><td>Emitech</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PLPP（光引发剂）</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸，无菌过滤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td>浓度：0.01%</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alv&amp;eacute;ole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记纤连蛋白</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>FNR01</td><td>浓度：10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Alexa 488 标记二抗，山羊抗小鼠 IgG1 (H)</td><td>Molecular Probes</td><td>A21121</td><td>稀释比例：1/300</td></tr><tr><td>Alexa 555 标记二抗，山羊抗小鼠 IgG1 (H)</td><td>Molecular Probes</td><td>A21127</td><td>稀释比例：1/300</td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Leurell Technologies Corporation</td><td>型号 WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>DOW</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP8X 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>十三氟-（1,1,2,2-四氢辛基）三氯硅烷</td><td>ABCR</td><td>AB111444</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶（1x），无酚红</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

细胞外基质是调控细胞功能的重要因素。越来越多的研究表明，细胞微环境中存在的环境信号，如配体分布和组织几何结构，在调控细胞表型和行为方面发挥着关键作用。然而，这些环境信号及其对细胞的影响通常被分别研究，使用 体外 分离单一线索的平台，这种策略极大地简化了复杂的 体内 多种线索并存的情况。工程学方法在弥合这一差距方面可能特别有用，可通过开发能够捕捉复杂性的实验装置来实现 体内 微环境，同时保持其精确性和可操控性 体外 系统。
本研究介绍了一种结合紫外光（UV）介导的蛋白质图案化与基于光刻的基底微加工技术的方法，可实现对多信号环境中细胞行为的高通量研究。通过无掩模紫外光图案化技术，可在包含多种明确定义几何信号的芯片三维（3D）细胞培养基底上，构建复杂的黏附性蛋白质分布。该方法适用于由不同聚合物材料制成的培养基底，并可与多种蛋白质的图案化黏附区域相结合。利用该技术，单个细胞以及细胞单层均可同时响应由图案化基底提供的几何信号与接触导向信号。通过系统性地组合芯片材料、蛋白质图案和细胞类型进行研究，可深入揭示细胞对多信号环境的响应机制。

通过所述方案，可对三维PDMS细胞培养基质进行紫外光图案化，以创建精确且高通量的黏附区域，适用于细胞附着。由此，细胞可同时受到特定基质几何形貌和黏附配体图案的共同作用。细胞的取向、细胞面积以及黏着斑数量等特性可被便捷地监测，并用于深入理解细胞在复杂环境中的行为， 体内类环境。
为验证3D PDMS基底上的图案化过程，已采用X射线光电子能谱（XPS）检测实验流程各阶段材料的原子表面组成。48总之，XPS 测量显示，钝化样品上存在 PEG 链，其碳信号增强，光刻图案化后该信号减弱。与纤连蛋白孵育后，碳信号再次增加，表明细胞培养芯片表面成功实现了蛋白质黏附。接下来，在多种圆形图案化的凹坑（ĸ = 1/250 µm-1，ĸ = 1/1,000 µm-1，且 ĸ = 1/3,750 µm-1，参见 图6）。从最大强度投影图可以看出，蛋白质图案已成功地在所有三种三维结构上形成。强度分布曲线表明 图6A 图案分辨率高，图案区域与非图案区域之间的过渡清晰。此外，微孔内整个图案的蛋白质信号强度均匀一致。
使用单焦平面法（一种图案）制备曲率κ = 1/250 µm-1的凹形凹坑，而κ = 1/1,000 µm-1和κ = 1/3,750 µm-1的凹坑则分别使用两个和三个焦平面（图案）制备。从图6中的最大强度投影可以看出，两种方法均实现了图案在特征顶部的完美对齐。在两个不同焦平面和图案之间未观察到错位的过渡。
利用所述方案，可将多种蛋白质图案设计应用于不同几何形状的表面（见图7和视频1）。为展示该方法的多功能性，使用不同宽度的直线和圆形图案在半圆柱面（凸面和凹面）、马鞍面以及凹坑表面进行了图案化。光图案化材料随后可用于细胞培养（见图7、图8、视频2、视频3和视频4）。在图案化凹面半圆柱上培养真皮成纤维细胞的示例如图所示，该表面具有纤维连接蛋白线条（红色，宽5 µm，间隔5 µm），结果见图8、图9和视频4。实验过程中，细胞可感知并黏附于多信号细胞培养基底，并在长时间内保持活性。由图8中的免疫荧光染色结果可见，细胞主要在纤维连接蛋白线条上形成黏着斑（vinculin 聚集体）。
我们课题组最近发表了一项利用这些细胞培养材料的示例研究48。在该研究中，人源肌成纤维细胞和内皮细胞被置于同时包含接触引导信号和几何形貌特征的环境中。体内，这两类细胞在天然组织（如人体血管系统）中均会受到曲率和接触引导信号的影响。通过在体外为细胞提供同时具备这两种环境信号的条件，可模拟体内微环境，从而更深入地理解微环境对细胞行为的调控作用。研究显示，人源肌成纤维细胞在凹面圆柱形基底上会沿接触引导信号（平行排列的纤连蛋白线条）排列48。然而，在曲率逐渐增大的凸面结构上，几何形貌信号会主导于生化信号，表明肌成纤维细胞能够感知曲率的程度和正负性。有趣的是，内皮细胞仅能黏附于凹面多信号基底，而无法在凸面PDMS基底上黏附。在凹面且具有蛋白图案化的基底上，内皮细胞的排列方向与接触引导信号一致。这一基础性的体外研究成果在血管组织工程领域具有重要的生理学意义，并有望最终推动智能型组织工程构建物的设计。
<img alt="三维细胞培养制备流程图；步骤：PDMS芯片制备、紫外光刻图案化和染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1应用接触引导信号于三维细胞培养基质的实验时间线。 首先，使用含有多种几何形状的负相PDMS模具制备正相细胞培养芯片。将未固化的PDMS倒入模具中，在80 °C下加热固化3 h。 65 °C随后，将PDMS用O₂处理2-血浆并孵育PLL和mPEG-SVA（蓝色，已标记），以钝化细胞培养基底表面。洗涤后，将基底倒置放入光引发剂（PLPP，绿色，已标记）液滴中，并采用LIMAP方法进行紫外光图案化。在此过程中，使用带有用户自定义图案的数字掩膜，在特定位置切割钝化层。随后孵育蛋白质溶液（红色，已标记），该溶液仅吸附于钝化层被去除的区域。接种在基底上的细胞同时受到几何形状和蛋白质图案的影响，从而可开展复杂环境下细胞行为的研究， 体内-模拟环境。缩写：PDMS = 聚二甲基硅氧烷；mPEG-SVA = 甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基戊酸酯；PLPP = 4-苯甲酰基苄基-三甲基氯化铵；LIMAP = 蛋白质光诱导分子吸附。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微加工工艺示意图；玻璃模具、PDMS芯片、用于实验室的细胞培养芯片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：三维细胞培养基底在制备与钝化过程中的不同阶段。 负型玻璃模具（#1）通过计算机辅助设计软件设计，并采用飞秒激光直写技术制备。该模具用于制备中间正型PDMS芯片（#2）和负型PDMS模具（#3），随后用于制备最终的细胞培养芯片（#4）。缩写：PDMS = 聚二甲基硅氧烷。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="紫外光刻图案示意图：基底、紫外激光、焦平面、图案结果、三维结构生成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：两种图案化方法的示意图。 左侧：在较小特征（约一个DMD大小）上使用单一焦平面和图案进行紫外光刻图案化，从而一次性完成整个特征的图案化。右侧：当使用较大特征（大于一个DMD）时，图案化过程被分配到多个焦平面和图案上进行。缩写：DMD = digital mirror device。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的同心圆模式分析；正常状态与干燥状态的比较；XY、XZ视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：正常与干燥蛋白孵育基底的典型示例。 正常及干燥蛋白孵育基底的最大强度投影（XY）和正交视图（XZ）。在用蛋白溶液孵育后清洗图案化细胞培养基底时，必须始终确保样品保持湿润。尽管所有图像中的图案特征相同（ĸ = 1/1,000 µm-1），但当样品干燥数秒后，明胶-荧光素（绿色）发生聚集，形成明显团块。若样品始终保持湿润，则可观察到正确的蛋白图案。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控通道示意图；箭头表示在偏红的显微镜图像中分析的流体流动模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：接种后的明场图像。 原代角膜细胞（左）和真皮成纤维细胞（右）在三维几何结构上接种4小时后的形态（凹坑曲率κ = 1/1,000 µm-1，半圆柱曲率κ = 1/500、1/375、1/250、1/175 和 1/125 µm-1）。左上角插图为用于构建这些几何结构的线性图案。白色箭头指示已开始铺展并呈现定向排列的细胞。比例尺 = 250 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜下的同心环图案；强度图；κ 值：1/250, 1/1,000, 1/3,750 μm⁻¹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：凹面微坑上圆形图案的表征。（A）使用LIMAP技术在凹面微坑（ĸ = 1/250 µm-1）上制备的图案（线宽：20 µm，间隙宽度：20 µm），经明胶-荧光素（绿色）孵育后，其最大强度投影（XY）和正交视图（XZ）。沿白色直线的强度分布随距离绘制，显示图案质量和分辨率的一致性。（B）在具有不同曲率的凹面微坑上进一步进行图案化，其中ĸ = 1/1,000 µm-1 和 ĸ = 1/3750 µm-1，表明该方法在可用于图案化的几何特征方面具有灵活性。同样展示了最大强度投影（XY）和正交视图（XZ）。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于结构分析的细胞外基质中纤连蛋白和F-肌动蛋白的三维荧光显微成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：图案化结构的三维显微成像数据。 经光刻图案化与细胞培养后，典型的三维图案化细胞培养材料示例，通过三维渲染软件可视化呈现。（A）凸半圆柱形结构，以10 µm宽的线条（罗丹明标记的纤连蛋白，红色）和10 µm宽的间隙进行图案化。比例尺 = 5 µm。（B）真皮成纤维细胞在凹半圆柱形结构上培养，该结构具有20 µm宽的线条（罗丹明标记的纤连蛋白，红色）和20 µm宽的间隙，F-肌动蛋白染色呈绿色。比例尺 = 5 µm。（C）马鞍形表面，以20 µm宽的线条（罗丹明标记的纤连蛋白，红色）和20 µm宽的间隙进行图案化。比例尺 = 5 µm。（D）凹坑结构，以20 µm宽的同心圆线条（荧光素标记的明胶，绿色）和20 µm宽的间隙进行图案化。人角膜细胞的F-肌动蛋白细胞骨架经鬼笔环肽染色后呈红色。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纤连蛋白上细胞黏附的共聚焦显微镜图像；合并图、F-肌动蛋白、细胞核、连环蛋白通道。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：人皮肤成纤维细胞在光图案化凹面半圆柱体上的免疫荧光染色。（A）人皮肤成纤维细胞在图案化（纤连蛋白线条，红色，宽5 µm，间隔5 µm）凹面半圆柱体上培养24小时后的最大强度投影（XY）及正交截面（XZ和YZ）。细胞经F-肌动蛋白（品红色）、连环蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）染色。比例尺 = 100 µm。（B）细胞在多线索环境中的黏附局部放大图。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示生物膜中细胞迁移的延时显微图像，历时3180分钟，显微照片系列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 9"> 
图9：人真皮成纤维细胞在具有图案化结构的凹面圆柱体上的明场延时图像。 该凹面半圆柱体（ĸ = 1/250 µm-1）表面具有平行线条图案（线宽5 µm，间隙5 µm），并在接种细胞前用罗丹明标记的纤连蛋白进行孵育。延时成像始于细胞接种后1小时（左图，0分钟），此时细胞仍呈圆形且未贴壁（箭头所示）。约24小时后（中图，1,420分钟），细胞已贴附于多线索基底，并沿接触引导图案呈现定向排列。在整个培养期间（右图，3,180分钟），细胞的定向排列行为和活力均得以维持。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：三维圆柱形基底上的图案示例。 用罗丹明-纤维连接蛋白（红色）在凸圆柱体上进行图案化的三维示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：在具有图案结构的三维圆柱形基底（ĸ = 1/500 µm-1）上培养的真皮成纤维细胞的三维表征。 真皮成纤维细胞在具有图案结构（纤连蛋白线条，红色，宽 10 µm，间隔 10 µm）的凸面半圆柱体上培养 24 小时。细胞经染色显示 F-肌动蛋白（品红色）、纽蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 3：在图案化三维凹坑（ĸ = 1/3,750 µm-1）上培养的人角膜细胞的三维图像。 人角膜细胞在凹面图案化凹坑（明胶圆环，绿色，宽 20 µm，间隔 20 µm）中培养 24 小时后的三维图像。细胞经 F-actin 染色（红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%203.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 4：在具有图案化的凹面圆柱体上的人类皮肤成纤维细胞的明场延时成像。 该凹面半圆柱体（ĸ = 1/250 µm-1）上制备了平行线条图案（线宽 5 µm，间隙 5 µm），并在接种细胞前用罗丹明标记的纤连蛋白孵育。延时成像始于细胞接种后 1 小时，此时细胞已初步黏附于多线索环境中。在整个延时成像过程中，细胞主要沿接触引导线索定向排列，同时保持良好的细胞活力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%204.zip" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

传统上，细胞培养是在平面基底上进行的，而这种基底无法很好地模拟细胞的天然微环境 体内在此，我们描述了一种制备具有生理相关曲率几何形状及微图案化细胞外蛋白的细胞培养基底的方法，可实现对细胞感知这些细胞外信号的系统性研究。

细胞外基质是细胞功能的重要调控因子。细胞微环境中存在的环境信号，例如配体……

微环境因素对细胞行为的影响通常通过过度简化的体外平台进行研究，这些平台仅分离单一信号。我们的方法构建了可整合多种此类信号的细胞培养基质。该方法具有高度通用性，能够利用多种细胞培养材料、接触引导图案、细胞检测指标和蛋白质进行系统性研究。该操作将由本实验室的两名PSE候选人CAS VAN DER PUTTEN和MIRKO D'URSO演示。首先，使用飞秒激光直写技术制备包含所有目标结构的玻璃负模。然后，将玻璃负模小心地放置在培养皿底部，并将聚二甲基硅氧烷预聚物倾倒于玻璃负模之上，使其完全覆盖。将该培养皿放入真空干燥器中，并启动真空泵。达到真空状态后，等待5分钟，以去除模具表面与聚二甲基硅氧烷预聚物界面处存在的所有气泡。随后将PDMS预聚物在65摄氏度的烘箱中固化过夜。固化后，使用刮刀抬起聚二甲基硅氧烷（PDMS）的边缘。将新固化的正相PDMS芯片从负相玻璃模具上取下；若正相PDMS芯片容易粘附在负相玻璃模具上，可在抬起时向印模边缘加入乙醇或水。然后，将正相聚二甲基硅氧烷芯片置于干燥器中，并在其旁放置一个装有硅烷化试剂液滴的小瓶，于真空条件下静置过夜。将PDMS预聚物倒入PDMS负模中，制备多个厚度为5毫米的细胞培养芯片。接着，使用真空干燥器去除气泡，并在65摄氏度下固化三小时。用剃刀刀片将芯片切割至最终尺寸，并在室温下储存芯片。使用镊子进行基底钝化时，将芯片放入等离子体灰化仪的样品篮中。然后，使用氧气等离子体活化芯片表面的羟基，并用氮气吹扫灰化室。将芯片从篮子中取出，放入一个小的聚二甲基硅氧烷容器中。接着，用巴斯德吸管向芯片表面加入500 µL的多聚-L-赖氨酸溶液，确保芯片表面完全浸没在溶液中，在室温下孵育30分钟。然后，用移液器从细胞培养芯片中移除 450 微升的多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）。接着，用 500 微升的 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液对芯片表面冲洗三次。为保持最终图案的质量，需在聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane）芯片上保留少量液体，以防止样品干燥。使用前，将500微升含50毫克/毫升甲氧基聚乙二醇氰氨基戊酸酯溶液溶于0.1摩尔/升HEPES缓冲液中，用于每张细胞培养芯片，并将样品在其中孵育60分钟。使用微量移液器移除450微升甲氧基聚乙二醇氰氨基戊酸酯溶液。用PBS通过移液吹打方式洗涤芯片表面5次。为了去除所有未结合的mPEG-SVA，将带有荧光标记物的玻片置于显微镜的光路中。切换显微镜至荧光模式，并仔细调节初次成像的焦距，确保标志和文字均清晰对焦。单击下一步以查看校准数据和图案，完成校准程序。校准时记录载物台的Z轴位置，并在后续实验步骤中以此位置作为参考。从载物台上取下校准玻片后，将含有光引发剂液滴的载玻片放置在载物台上，然后将PDMS细胞培养基质倒置放入光引发剂液滴中。确保细胞培养基底表面的三维结构朝向玻璃载片，并完全浸没在光引发剂中，以保证正确的图案化。分别对准凸面或凹面结构的顶部或底部，并根据文献所述，将焦点对准芯片上正确位置的区域。根据特征调整图案化参数，选择1000毫焦耳/毫升的剂量。单击屏幕右下角的播放按钮以开始图案化。完成后，观察以绿色显示的图案。使用微量移液器，向含有 20 微克罗丹明标记纤维连接蛋白的样品瓶中加入 2 毫升 PBS，以获得 10 微克/毫升的浓度。轻轻吹打以避免蛋白质结块，并避免光照。使用微量移液器，向细胞培养芯片中加入 200 至 500 微升的蛋白质溶液。根据所选蛋白质调整孵育时间和温度，并确保覆盖样品。移除蛋白溶液，并用500 µL无菌PBS洗涤芯片5次。确保在细胞培养芯片所有相关区域上方反复吹打PBS多次，以去除未结合的蛋白。细胞悬液制备完成后，移除PBS，并向芯片中加入1 mL细胞悬液。然后，在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。在明场显微镜下观察细胞在图案化细胞培养芯片上的贴附情况。对于线状图案，观察是否出现拉长的细胞形态。如果细胞已开始在图案化区域外黏附，可通过在基底上的细胞正上方反复吹打培养基将其移除。染色后，将染色样本倒置放置在载玻片上的一滴 PBS 液滴中。然后，根据所需的细节程度，使用合适的物镜和 Z 间距进行 Z 层扫描，以确保获得理想的图像。使用三维成像软件对Z轴堆栈创建三维渲染图像。利用光诱导分子吸收蛋白质的方法构建出凹形凹坑，并通过最大强度投影和正交视图进行可视化观察。强度分布曲线显示图案具有高分辨率，图案区域与非图案区域之间具有明显的锐利过渡，且蛋白质信号强度一致。采用单焦平面以及双焦平面和三焦平面方法进行图案化，均显示出图案与表面特征顶部的完美对齐。凹面半圆柱、凸面半圆柱、马鞍面和PID通过不同宽度的线条或同心圆进行图案化。使用foliden对人角膜细胞骨架内部进行染色并实现可视化。真皮成纤维细胞在具有图案化的凹面半圆柱上进行培养并被观察。细胞感知并黏附于多信号细胞培养基底，并随时间保持活性，通过F-actin、Vinculin和细胞核染色可见。此外，细胞主要在纤连蛋白线条上形成局灶性黏附。在存在罗丹明标记纤连蛋白的情况下，人皮肤成纤维细胞在图案化的凹面圆柱体上培养时，能够黏附于多信号基底，并根据接触引导图案表现出排列响应。在整个培养期间，细胞的排列响应和存活率均得以维持。执行本方案时最重要的事项是防止细胞培养芯片表面干燥。使用不同的基底材料、蛋白质包被和细胞类型可能需要进一步优化。在三维环境中提供多种环境信号，可为引导复杂工程组织中的细胞有序排列开辟新的可能性。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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利用水相双相系统同时对多种细胞群体进行图案化。这种快速且简便的细胞图案化方法利用了葡聚糖和聚乙二醇水溶液之间的相分离特性以及两种聚合物溶液之间的界面张力。...

使用水相两相系统进行细胞共培养图案化

我们描述了一种在水相环境中改性支架表面细胞亲和力的方案。该方法利用二氧化钛的光催化作用，分解光照区域的有机薄膜。我们证明，该方法可用于在体外（ex situ）和原位（in...

使用 TiO2 光催化在水相环境中对蛋白质和细胞进行光图案化

以下方案描述了用于构建三明治样培养物的步骤，该培养物可作为二维（2D）与三维（3D）细胞环境之间的中间阶段。这种人工构建的系统可应用于显微镜观察、生物力学、生物化学以及细胞生物学检测。...

三明治样微环境用于调控细胞/材料相互作用

人类多能干细胞（hPSCs）具有分化并自组织形成特定组织结构的内在能力；然而这一过程需要空间环境梯度的引导。本文介绍了一种简单且可靠的模板微图形化技术，可用于构建生化和力学梯度，从而调控hPSCs的分化模式。...

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本文介绍的实验方案可实现微图案的自动化制备，从而标准化哺乳动物细胞的细胞形态，用于研究细胞内的细胞骨架结构。该技术操作简便，可使用市售的成像系统进行搭建，无需标准细胞生物学实验室难以获得的专用设备。...

通过红外激光辅助微图形化技术控制细胞几何形态

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通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

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