通过三维细胞培养基底的紫外光图案化技术构建多线索细胞微环境

微环境因素对细胞行为的影响通常通过过度简化的体外平台进行研究，这些平台仅分离单一信号。我们的方法构建了可整合多种此类信号的细胞培养基质。该方法具有高度通用性，能够利用多种细胞培养材料、接触引导图案、细胞检测指标和蛋白质进行系统性研究。

该操作将由本实验室的两名PSE候选人CAS VAN DER PUTTEN和MIRKO D'URSO演示。首先，使用飞秒激光直写技术制备包含所有目标结构的玻璃负模。然后，将玻璃负模小心地放置在培养皿底部，并将聚二甲基硅氧烷预聚物倾倒于玻璃负模之上，使其完全覆盖。

将该培养皿放入真空干燥器中，并启动真空泵。达到真空状态后，等待5分钟，以去除模具表面与聚二甲基硅氧烷预聚物界面处存在的所有气泡。随后将PDMS预聚物在65摄氏度的烘箱中固化过夜。

固化后，使用刮刀抬起聚二甲基硅氧烷（PDMS）的边缘。将新固化的正相PDMS芯片从负相玻璃模具上取下；若正相PDMS芯片容易粘附在负相玻璃模具上，可在抬起时向印模边缘加入乙醇或水。然后，将正相聚二甲基硅氧烷芯片置于干燥器中，并在其旁放置一个装有硅烷化试剂液滴的小瓶，于真空条件下静置过夜。

将PDMS预聚物倒入PDMS负模中，制备多个厚度为5毫米的细胞培养芯片。接着，使用真空干燥器去除气泡，并在65摄氏度下固化三小时。用剃刀刀片将芯片切割至最终尺寸，并在室温下储存芯片。使用镊子进行基底钝化时，将芯片放入等离子体灰化仪的样品篮中。

然后，使用氧气等离子体活化芯片表面的羟基，并用氮气吹扫灰化室。将芯片从篮子中取出，放入一个小的聚二甲基硅氧烷容器中。接着，用巴斯德吸管向芯片表面加入500 µL的多聚-L-赖氨酸溶液，确保芯片表面完全浸没在溶液中，在室温下孵育30分钟。

然后，用移液器从细胞培养芯片中移除 450 微升的多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）。接着，用 500 微升的 0.1 摩尔 HEPES 缓冲液对芯片表面冲洗三次。为保持最终图案的质量，需在聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane）芯片上保留少量液体，以防止样品干燥。

使用前，将500微升含50毫克/毫升甲氧基聚乙二醇氰氨基戊酸酯溶液溶于0.1摩尔/升HEPES缓冲液中，用于每张细胞培养芯片，并将样品在其中孵育60分钟。使用微量移液器移除450微升甲氧基聚乙二醇氰氨基戊酸酯溶液。用PBS通过移液吹打方式洗涤芯片表面5次。

为了去除所有未结合的mPEG-SVA，将带有荧光标记物的玻片置于显微镜的光路中。切换显微镜至荧光模式，并仔细调节初次成像的焦距，确保标志和文字均清晰对焦。

单击下一步以查看校准数据和图案，完成校准程序。校准时记录载物台的Z轴位置，并在后续实验步骤中以此位置作为参考。从载物台上取下校准玻片后，将含有光引发剂液滴的载玻片放置在载物台上，然后将PDMS细胞培养基质倒置放入光引发剂液滴中。

确保细胞培养基底表面的三维结构朝向玻璃载片，并完全浸没在光引发剂中，以保证正确的图案化。分别对准凸面或凹面结构的顶部或底部，并根据文献所述，将焦点对准芯片上正确位置的区域。根据特征调整图案化参数，选择1000毫焦耳/毫升的剂量。

单击屏幕右下角的播放按钮以开始图案化。完成后，观察以绿色显示的图案。使用微量移液器，向含有 20 微克罗丹明标记纤维连接蛋白的样品瓶中加入 2 毫升 PBS，以获得 10 微克/毫升的浓度。

轻轻吹打以避免蛋白质结块，并避免光照。使用微量移液器，向细胞培养芯片中加入 200 至 500 微升的蛋白质溶液。根据所选蛋白质调整孵育时间和温度，并确保覆盖样品。

移除蛋白溶液，并用500 µL无菌PBS洗涤芯片5次。确保在细胞培养芯片所有相关区域上方反复吹打PBS多次，以去除未结合的蛋白。细胞悬液制备完成后，移除PBS，并向芯片中加入1 mL细胞悬液。

然后，在 37 摄氏度下孵育 60 分钟。在明场显微镜下观察细胞在图案化细胞培养芯片上的贴附情况。对于线状图案，观察是否出现拉长的细胞形态。

如果细胞已开始在图案化区域外黏附，可通过在基底上的细胞正上方反复吹打培养基将其移除。染色后，将染色样本倒置放置在载玻片上的一滴 PBS 液滴中。然后，根据所需的细节程度，使用合适的物镜和 Z 间距进行 Z 层扫描，以确保获得理想的图像。

使用三维成像软件对Z轴堆栈创建三维渲染图像。利用光诱导分子吸收蛋白质的方法构建出凹形凹坑，并通过最大强度投影和正交视图进行可视化观察。强度分布曲线显示图案具有高分辨率，图案区域与非图案区域之间具有明显的锐利过渡，且蛋白质信号强度一致。

采用单焦平面以及双焦平面和三焦平面方法进行图案化，均显示出图案与表面特征顶部的完美对齐。凹面半圆柱、凸面半圆柱、马鞍面和PID通过不同宽度的线条或同心圆进行图案化。使用foliden对人角膜细胞骨架内部进行染色并实现可视化。

真皮成纤维细胞在具有图案化的凹面半圆柱上进行培养并被观察。细胞感知并黏附于多信号细胞培养基底，并随时间保持活性，通过F-actin、Vinculin和细胞核染色可见。此外，细胞主要在纤连蛋白线条上形成局灶性黏附。

在存在罗丹明标记纤连蛋白的情况下，人皮肤成纤维细胞在图案化的凹面圆柱体上培养时，能够黏附于多信号基底，并根据接触引导图案表现出排列响应。在整个培养期间，细胞的排列响应和存活率均得以维持。执行本方案时最重要的事项是防止细胞培养芯片表面干燥。

使用不同的基底材料、蛋白质包被和细胞类型可能需要进一步优化。在三维环境中提供多种环境信号，可为引导复杂工程组织中的细胞有序排列开辟新的可能性。