Name: 通过侧向柔光照明促进脑类器官培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解侧向柔光照明技术如何优化脑类器官培养流程，提升类器官可见性与操作便捷性。该方法改进了换液和转移步骤，适用于神经科学研究与疾病建模。

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本研究由广东省自然科学基金（项目编号：2020A0505100062）、广州市科技计划重点专题项目（项目编号：201904020025）、国家自然科学基金（项目编号：31872800、32070582、82101937）以及广州市博士后科研资助项目（资助对象：Bangzhu Chen）提供支持。

本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行。实验方案已获得广州医科大学附属第三医院伦理委员会的批准（医学伦理审查[2021]第022号）。实验前，每种培养基均按照Juergen A. Knoblich的配方12（补充表1-4）配制，或使用市售的脑类器官试剂盒（见材料表）。本研究使用的iPSCs由本实验室先前建立，并已获得知情豁免。SCA3-iPSCs来源于一名31岁女性脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）患者，其ATXN3基因经基因分型确认含有26/78次CAG重复序列13（补充图1A）。此前文献中提到的正常人iPSCs被选为对照iPSCs（NC-iPSCs）14，其ATXN3基因被鉴定为含有14/14次CAG重复序列（补充图1B）。
1. 诱导性多能干细胞（iPSCs）的制备
<ol>
	<li>在志愿者和患者知情同意的情况下，通过静脉穿刺采集 3 mL 外周血。</li>
	<li>根据 Ficoll-Paque 法分离外周血单个核细胞15。</li>
	<li>按照仙台病毒重编程试剂盒的方案建立诱导多能干细胞（iPSCs）（参见材料表）。
	<ol>
		<li>将iPSCs接种于包被有Matrigel（基底膜基质，参见材料表）的35 mm培养皿中，并使用mTeSR1培养基进行培养。每日更换培养基。iPSCs的生长密度不得超过75%。</li>
		<li>使用PSC解离溶液（参见材料表）消化细胞，并每3-5天以1:5的比例进行传代。 
		注意：本步骤使用仙台病毒。操作必须在生物安全柜中进行，并采取必要的个人防护措施。应明确了解在当地国家是否允许合法使用该病毒，并严格遵守当地的生物安全法律法规。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胚胎体（EB）制备（第0-1天）
<ol>
	<li>用移液器吸去iPSCs中的mTeSR1培养基，并用1 mL 1× PBS洗涤2次。</li>
	<li>用移液器吸去PBS，加入300 µL细胞解离溶液（见材料表），在37 °C下消化iPSCs为单细胞，持续3–4分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于2 mL EB形成培养基中（补充表1），然后在300 × g下离心5分钟（室温）。</li>
	<li>用抗黏附冲洗液（500 µL/孔）预处理专用24孔板，处理5分钟（见材料表）。 
	注意：抗黏附冲洗液对于EB和类球体的最佳形成至关重要。</li>
	<li>将细胞重悬于含有Y-27632（终浓度10 µM，见材料表）的EB形成培养基中，细胞密度为1.5 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>吸去抗黏附冲洗液，每孔用2 mL EB形成培养基冲洗一次。</li>
	<li>以3 × 106 个细胞/孔的密度将细胞加入专用24孔板中（图1A，左图）。 
	注意：通常每个孔可制备约300个EB。该方法可制备大量大小均一的EB。</li>
	<li>将培养板在室温下以100 × g离心2分钟，使细胞均匀分布在每个孔的底部（图1A，右图）。 
	注意：若无合适的离心机，也可直接将培养板放入培养箱中进行静态培养，但EB球体的形成时间将比正常离心条件下延迟数小时。</li>
	<li>将样品在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。若前一步未进行离心，则培养36小时。在此期间保持样品稳定，不得将其从培养箱中取出。</li>
</ol>
3. 柔性光源灯的制备（第1天）
<ol>
	<li>使用厚度为 0.3–0.5 cm、大小为 A5 纸张的透明亚克力板。在亚克力板的正反两面粘贴白色垫片。
	<ol>
		<li>在板的边缘安装一排白色 LED 灯，使光线从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（补充图 2A–F，图 1B）。 
		注意：由于早期类胚体（EBs）的直径约为 200 µm 至 300 µm，在超净台的荧光灯下肉眼难以清晰观察。相比之下，由于漫反射增强，使用侧向照射的柔光可清晰检测到 EBs（图 1B，C）。后续实验中建议使用 6 孔板进行 EB 培养。但为了更好地展示柔光的视觉效果，本研究中有时采用培养皿而非培养板来拍摄图片和视频，请勿误解。侧向照射的柔光灯同样适用于 6 孔板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胚胎团转移与培养基更换（第2-5天）
<ol>
	<li>准备一个新的6孔低黏附培养板，每孔加入2 mL EB形成培养基。</li>
	<li>使用1000 µL宽口吸头（见材料表）将EB连同培养基一同吸出，转移至6孔低黏附培养板中（约100个EB/孔）。 
	注意：操作过程中采用柔光灯（见步骤3）以更清晰地观察EB。关闭其他室内光源，以获得更佳的柔光视觉效果。</li>
	<li>每天更换等体积的新鲜EB形成培养基。利用二次流将EB聚集至孔中央，然后更换培养基。
	<ol>
		<li>用移液器缓慢吸取旧培养基至孔边缘，避免用力过猛，否则会同时吸走EB。随后加入新鲜培养基重悬EB。 
		注意：二次流原理（图1D）。通过沿圆形轨道旋转培养皿诱导涡旋流，由于涡旋流的作用，产生指向中心的二次流。EB或类器官在旋转产生的二次流作用下向孔中央聚集，之后可方便地进行换液或胚胎体转移操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过多能性标志物OCT4标记检测多能性（第4天）
注意：当拟胚体（EBs）的直径大于 300 µm 时，取若干拟胚体进行OCT4标志物免疫荧光染色，以检测其多能性。
<ol>
	<li>将拟胚体（EBs）置于4%多聚甲醛中，4 °C固定30分钟，随后用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>将拟胚体（EBs）转移至含0.3% Triton X-100和3% BSA的室温PBS溶液中，孵育2小时，随后用PBS洗涤3次，每次10分钟。 
	注意：经Triton X-100处理后，拟胚体（EBs）会漂浮于液面，在清洗过程中容易随液体被吸走。建议在体视显微镜下操作。</li>
	<li>将OCT4一抗（见材料表）用含1% BSA的1 mL 1×PBS按1:200比例稀释后加入拟胚体（EBs）中，4 °C孵育过夜，然后用PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>将相应的二抗（见材料表）用1×PBS按1:500比例稀释，并加入1 mL至拟胚体（EBs）中。</li>
	<li>室温孵育2小时后，用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>吸除PBS，加入含1 µg/mL DAPI的2 mL 1×PBS溶液，室温孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>将含有少量液体的拟胚体（EBs）转移至载玻片上，用边缘涂有市售凡士林的盖玻片封片（见材料表），随后在荧光共聚焦显微镜下观察并采集图像。 
	注意：OCT4表达代表拟胚体（EBs）的多能性12。当OCT4表达率低于90%时，应弃用该批拟胚体（EBs），并重新制备。</li>
</ol>
6. 神经诱导（第5-7天）
<ol>
	<li>准备一个新的低黏附6孔板，并向每孔加入3 mL神经诱导培养基（补充表2）。</li>
	<li>打开侧方柔光灯（见步骤3），并关闭其他室内光源。</li>
	<li>将拟胚体转移至已加入神经诱导培养基的6孔板中（约100个拟胚体/孔）。尽量减少将原始培养基带入新孔中。 
	注意：介绍拟胚体转移的基本操作技巧。由于重力作用以及拟胚体密度相对培养基较高，在实施图1E所示操作时，重悬的拟胚体会逐渐沉降，从而可方便地完成转移。由于游离细胞和死亡细胞碎片的沉降速度较拟胚体更慢，因此通过此沉降方法可去除大部分游离细胞和死亡细胞碎片（图1F）。</li>
	<li>将样品置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。 
	注意：在显微镜下观察，拟胚体直径约为500 µm，边缘呈半透明状，提示已形成神经上皮层。</li>
	<li>进入下一步操作。</li>
</ol>
7. 在基底膜基质中包埋（第7&#8203;–10天）
<ol>
	<li>提前将基质膜置于 4 °C 冰箱中溶解 60 分钟。预先计算所需基质膜的用量。大约 100 个 EB 被包埋于 1.5 mL 基质膜中。</li>
	<li>打开侧向柔光灯，关闭控制台顶部的光源。</li>
	<li>将基质膜置于冰上，防止其凝固。</li>
	<li>每次将少量 EB 转移至含有新鲜扩增培养基（补充表 3）的 60 mm 培养皿中。减少 EB 数量，以便更容易挑取单个 EB。</li>
	<li>然后使用新的 6 孔低黏附培养板。每次用 200 µL 宽口移液枪头（见 材料表）吸取单个 EB（含约 10 µL 培养基），然后将其加入 6 孔板底部形成液滴。每孔使用五个液滴。 
	注意：关键是将移液器调节至 50 µL 范围，吸取一个 EB，然后参照 图 1E 的操作。当 EB 沉降至移液枪头孔口时，迅速使枪头轻触孔底，并推出约 10 µL 液体以形成液滴。</li>
	<li>向每个含有 EB 的液滴中加入 15 µL 基质膜，并迅速混匀。将 EB 球体包埋于液滴中央。 
	注意：切勿使用标准移液枪头吸取 EB，以免损伤 EB。必须使用 200 µL 宽口移液枪头。</li>
	<li>将 6 孔板放入 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟，使含有 EB 的基质膜液滴凝固。</li>
	<li>向每孔加入 3 mL 扩增培养基，轻轻吹打使基质膜包埋的 EB 悬浮。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养 3 天。 
	&#8203;注意：若观察到 EB 表面出现芽状结构，则表明已形成扩增的神经上皮16。</li>
</ol>
8. 类器官成熟（第10-40天）
<ol>
	<li>轻轻吸去原始培养基，每孔加入 3 mL 成熟培养基（补充表 4）。</li>
	<li>将类器官培养板置于 37 °C 培养箱内的水平摇床上。</li>
	<li>继续水平旋转培养，将摇床调至适当转速。 
	注意：根据水平摇床制造商的建议（见材料表），在 6 孔板上培养脑类器官时，相对离心力（RCF）为 0.11808 × g 更为合适。根据相对离心力与转速之间的换算关系17,18，RCF = 1.118 × 10−5 × R × rpm2，其中 RCF 为相对离心力（g），rpm 为每分钟转数（r/min），R 为旋转半径（cm），也称为摇动行程。不同摇床的摇动行程参数可能不同，因此可估算转速为 rpm = 299 × (RCF/R)1/2。</li>
	<li>每 2–3 天更换一次新鲜的成熟培养基。</li>
	<li>培养 20–30 天后，逐步将脑类器官培养至成熟。 
	&#8203;注意：在此期间，类器官可用于实验和检测，例如神经标志物检测和转录组测序19,20,21。</li>
</ol>
9. 脑类器官的冰冻切片与免疫荧光染色
<ol>
	<li>将类器官置于4%多聚甲醛中，4 °C固定16小时，然后用1× PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>吸除PBS，将类器官浸入30%蔗糖溶液中，4 °C过夜。</li>
	<li>将类器官在37 °C下用10%/7.5%明胶/蔗糖溶液包埋1小时，随后迅速转移至包埋模具中。</li>
	<li>将干冰加入100%乙醇中制备干冰-乙醇混合物，将类器官样品放入其中进行快速冷冻。</li>
	<li>将冷冻样品储存于−80 °C冰箱中。使用时，切取厚度为20 µm的冷冻切片。</li>
	<li>参照步骤5.3–5.5进行免疫荧光染色。使用PAX6抗体标记顶端前体细胞，TUJ1抗体（见材料表）标记神经元细胞22,23,24，DAPI用于细胞核DNA染色。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

类脑器官为医学研究开辟了新的途径。该技术的许多有用应用才刚刚开始被探索28。本研究发现，遗传病类脑器官与正常类脑器官的转录组测序结果能够反映疾病与健康状态之间的差异。例如，RNA-seq数据分析结果（图3B）与多项已报道的脊髓小脑性共济失调3型（SCA3）疾病研究结果一致29,30,31,32。培养类脑器官过程中的实验操作，如换液、拟胚体（EB）转移和包埋等，对于能否制备出均一性良好的类脑器官至关重要33,34。本研究介绍了一种便于换液和类脑器官转移的类脑器官培养方案。使用侧向柔光灯可极大辅助类脑器官培养操作，但若无法获取，也可通过LED绘画灯板并进行简单加工来...

与二维（2D）培养系统相比，三维（3D）培养系统具有多项优势，包括能够真实地复制并高效地再现某些器官的复杂结构1。因此，脑类器官已成为研究人类大脑发育与疾病2、药物筛选以及细胞治疗等领域的重要辅助方法。
采用旋转悬浮法培养脑类器官有助于其发育和成熟3。尽管脑类器官培养系统已取得显著成功，但仍面临一些关键挑战，限制了其广泛应用。例如，人工培养涉及复杂的操作步骤，阻碍了大规模应用的实现。此外，在脑类器官培养的各个发育阶段，需要更换不同的培养基和细胞因子4。然而，在早期阶段，类器官或拟胚体（EBs）体积微小（约200 µm至300 µm），若无适当设备几乎无法肉眼观察。不可避免的是，在更换培养基时会冲走一定量珍贵的类器官样本。为克服这一问题，已有多种技术在其他类型的类器官培养中被探索，例如将整个类器官芯片浸入培养基中连续培养3天而不进行干预5；利用吸水纸吸除旧培养基后，通过盖玻片添加新鲜培养基5；或采用复杂的微流控管道系统进行液体交换6,7,8。类器官培养早期阶段遇到的另一个障碍是难以通过肉眼直接观察，这可能导致操作不当，进而在类器官转移过程中造成损伤或丢失。因此，有必要建立一种更为可行的方案，以促进培养基更换和类器官转移，从而高效生成类器官。
基于工程学原理，提出了一种相应的优化操作，以克服上述问题，显著且便捷地促进了多种类器官操作的进行。自然界中，当阳光通过窗户缝隙照进屋内时，肉眼可见灰尘在光束中飞舞。这是由于阳光在灰尘上的漫反射，部分光线折射入眼球从而形成视觉图像。受此现象原理的启发9,10，本研究设计了一盏柔光灯，并从侧向照射胚胎体（EBs）。结果发现，EBs在不影響觀察範圍的情況下可視性明顯提高。由于涡流效应11，在旋转培养板时液体中会产生指向中心的二次流，原本分散的EBs会向培养板中心聚集。基于这一现象，并结合类器官沉降速度大于单个细胞的特性，本文提出了一种无需离心即可更换培养基和转移类器官的简便操作方法。通过该转移操作，可有效将培养基中的类器官与游离细胞及死亡细胞碎片分离。
本文提出了一种易于操作的方案，用于从人多能干细胞生成脑类器官。通过应用工程学原理优化了操作技术，使三维培养中的操作与二维培养一样简单可行。改进的液体更换方法和类器官转移操作也有助于其他类型的类器官培养以及自动培养设备的设计。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m 滤膜</td><td>NEST Biotechnology, 中国</td><td>331001</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L 宽口移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>9405163</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 宽口移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>9405020</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Merck, 德国</td><td>8057400005</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Servicebio, 中国</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>6孔低吸附培养板</td><td>NEST Biotechnology, 中国</td><td>703011</td><td>用于拟胚体（EBs）悬浮培养</td></tr><tr><td>Acute 细胞解离溶液</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>07920</td><td>用于将诱导多能干细胞（iPSC）消化为单细胞</td></tr><tr><td>AggreWell800 24孔板</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>34811</td><td>用于拟胚体制备的微孔培养板</td></tr><tr><td>防粘附冲洗液</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>07010</td><td>用于冲洗培养器皿以防止细胞贴壁</td></tr><tr><td>B27-维生素A补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech, 美国</td><td>GMP100-18B</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>碧云天生物技术, 中国</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf, 德国</td><td>5810 R</td><td>可用于各种离心管、试剂瓶和工作板的离心</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>实泰实验设备, 中国</td><td>10212020C</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>碧云天生物技术, 中国</td><td>C1002</td><td>用于细胞核染色。DAPI与双链DNA结合后，最大激发波长为364 nm，最大发射波长为454 nm</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>胚胎干细胞级胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque</td><td>通用电气公司, 美国</td><td>17-5442-02</td><td>根据Ficoll-Paque法分离外周血单个核细胞</td></tr><tr><td>明胶</td><td>生工生物, 中国</td><td>A609764</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗鸡IgY&amp;nbsp;二抗</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab150171</td><td>山羊抗鸡IgG。偶联物：Alexa Fluor 647。激发波长：652 nm，发射波长：668 nm。使用稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG二抗</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab150120</td><td>山羊抗小鼠IgG。偶联物：Alexa Fluor 594。激发波长：590 nm，发射波长：617 nm。使用稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG二抗</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab150077</td><td>山羊抗兔IgG。偶联物：Alexa Fluor 488。激发波长：495 nm，发射波长：519 nm。使用稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Merck, 德国</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>水平摇床</td><td>Servicebio, 中国</td><td>DS-H200</td><td>根据制造商INFORS HT（瑞士）建议，相对离心力（RCF）为0.11808 × g较为合适</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Merck, 德国</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, 美国</td><td>354277</td><td>Matrigel在高于4 &amp;deg;C的环境中会凝固，因此应在低温下分装保存</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>85850</td><td>iPSC培养基</td></tr><tr><td>N2补充剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>OCT4一抗</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab19857</td><td>宿主：兔。用500 &amp;mu;L PBS溶解。使用稀释比例为1:200</td></tr><tr><td>病理冷冻切片机</td><td>Leica, 德国</td><td>Leica CM1860</td><td></td></tr><tr><td>PAX6一抗</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab78545</td><td>宿主：小鼠。使用稀释比例为1:100</td></tr><tr><td>PBS</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>37350</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PSC解离溶液</td><td>北京赛贝生物技术, 中国</td><td>CA3001500</td><td>无酶解离溶液，可用于iPSC的消化与传代</td></tr><tr><td>仙台病毒重编程试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific, 美国</td><td>A16518</td><td>根据仙台病毒重编程试剂盒的操作流程建立iPSC</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>实泰实验设备, 中国</td><td>188105W</td><td></td></tr><tr><td>柔光灯</td><td>NUT</td><td>NUT</td><td>一种简易自制装置，制备方法参见补充图2</td></tr><tr><td>STEMdiff 脑类器官试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>8570</td><td>包含：1. 拟胚体形成培养基；2. 诱导培养基；3. 扩增培养基；4. 成熟培养基</td></tr><tr><td>STEMdiff 脑类器官成熟试剂盒</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>8571</td><td>成熟培养基</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>生工生物, 中国</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Merck, 德国</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1一抗</td><td>Abcam, 英国</td><td>ab41489</td><td>宿主：鸡。使用稀释比例为1:1000</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>生工生物, 中国</td><td>A510146</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies, 加拿大</td><td>72302</td><td>用PBS配制5 mM储存液，将1 mg溶于624 &amp;micro;L PBS中</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;网址链接&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>原始测序数据</td><td>国家基因组科学数据中心（Genomics, Proteomics &amp; Bioinformatics 2021）的基因组序列归档库（Genome Sequence Archive, Nucleic Acids Res 2022），中国生物信息中心/中国科学院北京基因组研究所</td><td>GSA-人类：HRA002430</td><td>https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/</td></tr></tbody></table>

促进脑类器官培养 通过 侧向柔光照明

Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination

目前，脑类器官培养技术操作仍较为复杂，难以大规模推广应用，因此有必要寻找一种简便且实用的解决方案。本研究提出了一种更为可行的脑类器官培养方案。为解决早期换液和类器官转移过程中不可避免的操作不便问题，本研究通过应用工程学原理对操作技术进行了优化。采用软光灯对拟胚体（EB）样本进行侧向 illumination，利用增强的漫反射效应，使EB能够通过肉眼直接观察。利用旋转产生的二次流原理，使类器官向孔板中央聚集，从而便于换液或类器官转移操作。与分散的单细胞相比，拟胚体在移液管中沉降速度更快。利用这一现象，可通过简单方式有效去除大部分游离细胞和死亡细胞碎片，避免EB因离心而受到损伤。本研究简化了脑类器官培养的操作流程，有助于推动脑类器官技术的广泛应用。

本研究将诱导性多能干细胞（iPSCs）（图2B）诱导为脑类器官（图2C）。早期培养的拟胚体（EBs）表达OCT4标志物（图2A），表明其具有良好的多能性。在后期阶段，拟胚体发育为成熟的脑类器官（图2D）。研究将来自正常健康个体和脊髓小脑共济失调3型（SCA3）患者的iPSCs培养为脑类器官（图3A）。SCA3又称马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease, MJD），是一种由ATXN3基因中多聚谷氨酰胺扩展引起的神经退行性疾病25。RNA测序数据（已上传至公共数据库，参见材料表）显示，在神经递质转运、突触形成及调控等通路中，正常脑类器官组与SCA3脑类器官组之间的基因表达谱存在显著差异（图3B</st...

类脑器官为研究器官发育和人类疾病病理提供了前所未有的机会。尽管类脑器官培养系统已取得显著成功，但该技术的应用仍存在操作上的困难。本方案描述了一种类脑器官培养流程，可方便培养基更换和类脑器官转移。

目前，脑类器官培养技术操作仍然复杂，难以大规模应用。有必要寻找一种简单……

该方案有助于脑类器官培养的操作，并推动脑类器官的应用。通过使用侧向柔光灯，可直接用肉眼观察早期阶段的类器官，便于进行多种操作。改进的换液方法和类器官转移操作也有助于其他类型类器官培养以及自动化培养设备的设计。首先，将iPSCs接种于经Matrigel包被的35毫米培养皿中，使用mTeSR1培养基进行培养，并每天更换培养基。iPSCs的生长密度不得超过75%。随后，吸除iPSCs中的mTeSR1培养基，用1毫升PBS洗涤两次。吸除PBS后，加入300微升细胞解离溶液，在37摄氏度条件下消化3至4分钟，使iPSCs解离为单细胞。随后，将细胞重悬于2 mm的EB形成培养基中，以300 × g离心5分钟。用抗黏附冲洗液每孔500 µL处理特制的24孔板，孵育5分钟。接着，将细胞重悬于含有Rho激酶抑制剂Y27632的EB形成培养基中。去除抗黏附冲洗液后，用两毫升 EB 形成培养基冲洗每个孔。接着，将细胞以每孔 3 × 10⁶ 个细胞的密度加入特制的 24 孔板中，并在室温下以 100 × g 离心 2 分钟。使细胞均匀分布在板底每个腔室中。将样品在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育24小时。如果前一步未使用离心处理，则孵育36小时，并保持样品静置。使用厚度为0.3至0.5厘米、尺寸为A5纸大小的透明亚克力板，并在亚克力板的前后两面贴上白色垫片。接下来，在培养板边缘安装一排LED白光灯，使光线从亚克力板侧面进入，然后平行射出。现在，准备一个新的六孔低吸附培养板，向每孔加入2毫升EB形成培养基。使用1000微升宽口吸头将EBs连同培养基一起吸出后，将每孔约100个EBs转移至六孔低吸附培养板中。每天更换等体积的新鲜EB形成培养基时，通过使培养皿沿圆形轨道旋转以诱导产生涡流。由于旋转产生的次级流，EB或类器官会向孔板中央聚集。用移液器缓慢吸取孔板边缘的旧培养基以去除。不要用力过猛，否则会将EBs一并吸走。然后加入新鲜培养基重悬EBs。进行神经诱导时，准备新的六孔低黏附板，每孔加入三毫升神经诱导培养基。打开侧边柔光灯并关闭其他室内光源。使用宽口移液枪头吸取拟胚体（EBs）及培养基，将其转移至已加入神经诱导培养基的六孔板中。随后，将移液枪垂直放置。胚胎小体（EBs）将在重力作用下逐渐下沉，并向移液器吸头的开口处聚集。当移液器吸头开口再次接触液面时，由于液体表面张力的作用，EBs会迅速沉入培养基中。将样品置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。将膜基质置于4°C冰箱中60分钟以溶解。打开侧面柔光灯后，关闭控制台顶部的光源，并将膜基质保持在冰上，以防止其凝固。转移少量拟胚体（EBs）至含有新鲜扩增培养基的60毫米培养皿中，以便于挑取单个拟胚体。使用200微升宽口吸头，每次吸取一个含有约10微升培养基的单个拟胚体，然后将其滴加至6孔板底部形成液滴。每个孔使用五滴。向每个含有

facilitating-cerebral-organoid-culture-via-lateral-soft-light

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

通过侧向柔光照明促进脑类器官培养

来源： Ibanez-Rios, M.I., 等一种人脑类器官神经细胞移植模型。 J. Vis. Exp.

将荧光标记的神经前体细胞注射至人脑类器官以建立移植模型

本视频演示了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成脑类器官的实验方法。将人iPSCs诱导形成拟胚体（EBs）。在诱导培养基中，将EBs培养于聚合物支架上，促进其分化为神经干细胞、前体细胞以及未成熟神经元。最后，将EBs包埋于基质中，并转移至维持培养基中以形成脑类器官。...

生成诱导多能干细胞来源的脑类器官

本视频介绍了由单细胞悬液制备和培养脑肿瘤类器官的方法。利用富含层粘连蛋白的细胞外基质作为支架，并配合培养基提供营养，促进细胞在类器官内增殖并自我组织。因此， 离体...

从脑肿瘤细胞悬液中生成类器官培养物

本视频概述了利用人诱导性多能干细胞（iPSCs）生成前脑类器官的过程，展示了从干细胞聚集体发育为模拟大脑皮层的复杂结构，并进一步分化为多种神经元类型的全过程。...

利用人诱导性多能干细胞生成前脑型脑类器官

本视频展示了利用侧向柔光照明技术增强类胚体的肉眼可视性，从而促进其在脑类器官培养过程中的操作与转移。视频详细说明了柔光照明系统的搭建、培养基更换和类胚体转移的方法，以及诱导类胚体神经分化的步骤，以实现脑类器官的发育。...

利用侧向柔光照射优化脑类器官培养的技术

我们设计了一种用于光遗传学系统的连续培养装置，可对微生物培养物进行光照，并利用倒置显微镜定期对流出液中的细胞进行成像。该装置实现了培养、取样、成像及图像分析的全程自动化，从而可在数天内连续测量细胞对光照的动态响应。...

用于微生物光遗传学应用的自动化光照、培养与取样系统的设计与实现

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本文介绍了一种新型培养基底的制备方案，该基底每平方毫米含有数百个微容器2，其中可培养类器官并利用高分辨率显微镜进行观察。还详细描述了细胞接种和免疫染色方案。...

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

本方案提供了由人诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的脑类器官可重复生成、维持及老化过程的逐步操作流程。该方法能够长期培养和成熟脑类器官，从而有助于模拟与脑老化及年龄相关疾病发生机制有关的生物学过程。...

用于衰老研究的iPSC衍生脑类器官长期培养的稳健组织制备技术

我们描述了应用于两种报告策略的共聚焦成像与追踪流程：用于解析单个细胞行为和命运的嵌合类器官，以及用于监测人和小鼠肠道类器官中细胞类型转变的命运报告类器官。...

活细胞成像与单细胞追踪用于监测人和小鼠肠道类器官中的克隆动态与命运转变

了解侧向柔光照明技术如何优化脑类器官培养流程，提升类器官可见性与操作便捷性。该方法改进了换液和转移步骤，适用于神经科学研究与疾病建模。

促进脑类器官培养通过侧向柔光照明

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