Name: 检查骨骼肌中肌内脂肪形成及其细胞起源的指南 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 学习使用PFA固定和甘油损伤技术可视化骨骼肌内脂肪形成的方法。该方案通过保留脂肪细胞形态，实现肌内脂肪的精确定量分析，为研究肌肉萎缩症和杜氏肌营养不良等疾病中的脂肪形成机制提供可靠框架。

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感谢Kopinke实验室的成员在数据收集和手稿审阅方面提供的帮助。我们还要感谢佛罗里达大学肌病研究所的成员对手稿提出的宝贵意见。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01AR079449支持。图2使用BioRender软件绘制。

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
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作者声明无竞争利益。

本方案详细阐述了一种全面且精细的方法，可实现对肌内脂肪的高效可视化和严格定量分析。通过将同一块肌肉分为两部分，分别用于免疫荧光和RT-qPCR分析，该方案具有很高的灵活性。此外，该方案还可与脂肪前体细胞（FAPs）的遗传谱系示踪技术相结合，用于研究在特定条件下FAPs向脂肪细胞的转化过程，并可高度适应于多种其他细胞类型的标记与成像。
观察肌内脂肪最常用的方法是石蜡切片后进行苏木精和伊红染色，或对冰冻切片使用亲脂性染料（如油红O（ORO））染色。然而，尽管石蜡处理的组织能提供最佳的组织学结构，但该过程会完全提取脂质，从而无法使用亲脂性染料。虽然亲脂性染色方法可用于多聚甲醛（PFA）固定或未固定的组织切片，但在盖玻片上施加压力时脂滴容易发生移位，从而导致肌内脂肪空间分布的失真。为克服这一问题，最近一项研究建立了一种严格的全组织铺片法（whole-mount）来可视化 ORO+ 脂肪细胞。在该方法中，作者对胫骨前肌（TA）进行去细胞化处理，以在整个 TA 中观察肌内脂肪的空间分布41。尽管该技术功能强大，但它也限制了其他共染色方法的使用，无法标记额外的细胞结构。本文所介绍的全组织免疫荧光方法可用于将脂肪细胞与多种标记物进行共染色，从而实现对细胞微环境的精细定位。然而，其中一个主要挑战是抗体在组织中的渗透。肌纤维保留得越多，抗体均匀渗透并结合所有可用抗原的难度就越大。因此，该方法在观察少量肌纤维群时效果最佳。与此同时，这也构成了一项局限性：当仅聚焦于小块剥离的肌纤维束时，肌内脂肪的整体解剖位置信息将会丢失。然而，随着新型组织透明化方法以及成像技术的不断发展，未来将有望实现更深层次的组织渗透与可视化42,43,44。
尽管预先固定肌肉组织可保存脂肪细胞的形态，但也会对肌纤维大小的评估造成困难，而肌纤维大小是衡量肌肉健康状况的重要指标。肌纤维大小通过测量肌纤维的横截面积来确定。我们此前曾报道，肌肉组织预先固定会导致大多数可用于勾勒肌纤维的标记物失效31。为克服这一难题，我们开发了一种新型图像分割流程，可在已固定的肌肉切片中实现肌纤维大小的测量31。因此，我们建立了一套稳健且高效的组织处理流程，结合本方案可克服肌肉组织预先固定带来的大多数不利影响。
该方法的另一个主要优势在于其多功能性。通过将胫骨前肌（TA）分为两部分，可从一块肌肉中获取的信息量达到最大化。这不仅减少了实验动物的使用数量，还通过基因表达验证组织学结果，反之亦然，从而增加了一层额外的对照。此外，除脂肪生成相关基因外，还可检测多种其他不同基因。所提取的RNA还可用于全肌肉RNA测序实验。最后，速冻保存的肌肉组织也可用于蛋白质相关研究。本方案的一个局限性在于损伤可能在TA肌肉全长范围内不一致。这可能导致两部分肌肉所含肌内脂肪量出现差异，因而此类样本可能需要从后续分析中排除。因此，不建议仅依赖RT-qPCR结果对肌内脂肪含量得出主要结论，而应将其作为组织学定量结果的辅助数据。
综上所述，本方案建立了一个稳健、高效且严谨的组织处理流程，可用于可视化和定量分析肌内脂肪，这是开发新型治疗策略以应对脂肪纤维化的第一步。同时，该方法具有良好的通用性，可适用于肌肉中多种不同类型的细胞以及其他组织中的脂肪细胞。

健康肌肉组织被脂肪性纤维化浸润是杜氏肌营养不良症（DMD）及其他神经肌肉疾病，以及肌肉减少症、肥胖症和糖尿病的显著特征1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。尽管这些疾病状态下脂肪浸润增加与肌肉功能下降密切相关，但我们对肌内脂肪形成的原因和机制仍了解有限。FAPs 是存在于大多数成体器官（包括骨骼肌）中的一类多能间充质基质细胞群体11,12。然而，随着年龄增长或在慢性疾病中，FAPs 会生成纤维化瘢痕组织并分化为脂肪细胞，这些脂肪细胞位于单个肌纤维之间，形成肌内脂肪13,14,15,16,17,18,19,20。
为了开始抑制肌内脂肪的形成，需要明确FAPs转化为脂肪细胞的机制。PDGFR&#945; 是 &#34;金标准&#34; 领域内用于鉴定多种物种肌肉中FAPs的标记物13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27因此，多个由他莫昔芬诱导的小鼠Cre品系，在特定基因启动子的调控下 Pdgfr&#945; 启动子，已成功构建，可用于对FAPs进行基因操作 体内 利用Cre-LoxP系统27,28,29例如，通过将这种可诱导的Cre品系与遗传报告基因相结合，可对FAPs进行谱系示踪，我们已成功将该策略应用于肌肉和白色脂肪组织中FAPs的命运图谱绘制20,30除了谱系示踪外，这些Cre品系还为研究成纤维脂肪前体细胞向脂肪细胞的转化提供了有价值的工具。
明确脂肪生成过程中脂肪前体细胞（FAPs）转化为肌内脂肪的机制，其主要障碍之一在于难以严格且可重复地量化在不同条件下形成的肌内脂肪含量。关键在于平衡肌肉和脂肪组织的保存，并将其与可用的染色方法相匹配，以实现对脂肪细胞的可视化。例如，骨骼肌通常在未经固定的情况下迅速冷冻，这种方法可较好地保存肌纤维，但会破坏脂肪细胞的形态结构（图1）。相比之下，固定后进行石蜡包埋虽能呈现最佳的组织学结构（包括脂肪细胞），但会完全去除脂质，从而使大多数亲脂性染料（如常用的油红O染料）无法使用。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg" /> 
图1：快速冷冻与固定肌肉组织中肌内脂肪的代表性图像。 （A）实验设置的示意图。免疫荧光图像显示了甘油损伤后21天的快速冷冻（B）和固定（C）TA组织中的脂肪细胞（黄色）、肌纤维（灰色）和细胞核（青色）。比例尺：50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本文所述方案可有效保持肌纤维和脂肪细胞的形态，实现多种细胞类型的可视化与分析。该方法基于对经多聚甲醛（PFA）固定的肌肉组织中的脂肪细胞进行免疫荧光染色，可实现多种抗体的共染。此外，该方案还可轻松适用于通过整体组织成像（whole-mount imaging）在完整组织中空间展示肌内脂肪，从而提供脂肪在肌肉内所处细胞微环境的信息。同时，本方案可与我们近期发表的方法相结合，用于测定固定肌肉组织中肌纤维的横截面积31，这是评估肌肉健康状况的重要指标。本文还概述了将该方法与遗传谱系示踪技术结合，以命运图谱方式追踪FAPs向脂肪细胞分化的过程。因此，本方案具有良好的通用性，可在组织切片和完整组织中对FAPs及其向肌内脂肪的分化进行严谨且可重复的评估。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg" /> 
图2示意图解实验方案概览。 胫骨前肌组织处理的示意图，其中三分之一的胫骨前肌被切除后立即速冻并匀浆化，用于后续RNA提取和转录分析 通过 RT-qPCR。其余三分之二的TA组织经PFA固定后，用于冷冻切片或整装肌纤维的免疫染色。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>16% PFA（12 瓶装，每瓶 10 mL）</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>用于速冻/珠磨的微量离心管</td></tr><tr><td>2-甲基丁烷（4 L）</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>异戊烷</td></tr><tr><td>无水乙醇（200 证明）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab 片段驴抗小鼠抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>小鼠抗小鼠封闭</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗鸡二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗山羊二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗兔二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloidin 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>溶于 1.5 mL 甲醇（工作液浓度约 66 &amp;micro;M）</td></tr><tr><td>BioLite 24 孔多孔培养皿</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>930186</td><td>用于 PFA 组织孵育的 24 孔板</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>PCR 仪</td></tr><tr><td>鸡抗 GFP 抗体</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>氯仿/异戊醇 24:1（v/v），分子生物学级，无 DNA 酶、RNA 酶和蛋白酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 染色液</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &amp;micro;M 工作液，溶于 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>驴血清（100 mL）</td><td>Millipore Sigma</td><td>5058837</td><td>用于封闭液</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>尖头镊子</td></tr><tr><td>直头精细剪刀，9 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>甘油，99.5%，分子生物学级（500 mL）</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗 PDGFR&amp;alpha; 抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td>用于他莫昔芬孵育</td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障 PAP 笔</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>疏水笔</td></tr><tr><td>带 Micro-Fine IV 针头（28 G）的胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>带滑动接头的胰岛素注射器，1 mL</td><td>BD</td><td>329654</td><td>无针头胰岛素注射器，用于口服灌胃</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>78938441</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 倒置显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>用于宽场免疫荧光和共聚焦成像的显微镜</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>带正电荷的显微镜载玻片</td></tr><tr><td>小鼠抗 MYOD 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41017</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 PAX7 抗体（上清液）</td><td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier+ 切片机刀片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td>切片机刀片</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>用于测定 RNA 产量的分光光度计</td></tr><tr><td>培乐多（Play-Doh）</td><td>Hasbro</td><td></td><td>模型材料</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>绿色染料 PCR 预混液</td></tr><tr><td>Puralube Vet 眼膏</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>兽用眼膏</td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex 实时 384 孔 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>qPCR 仪</td></tr><tr><td>兔抗 perilipin 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr><td>Red-Rotor 摇床</td><td>Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>用于免疫荧光染色的摇床</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Slip-Rite 盖玻片</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152460</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>包含 Mini 离心柱</td></tr><tr><td>Safe-Lock 管，1.5 mL，无色</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>样品管 RB（2 mL）</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢珠，2.8 mm</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-101.BK</td><td>小珠</td></tr><tr><td>不锈钢珠，5 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td>中等大小珠</td></tr><tr><td>不锈钢珠，7 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69990</td><td>大珠</td></tr><tr><td>不锈钢一次性手术刀</td><td>Miltex</td><td>327-4102</td><td>手术刀</td></tr><tr><td>不锈钢饲管，20 G × 38 mm，直头</td><td>Instech Laboratories</td><td>FTSS-20S-3</td><td>灌胃针</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus O.C.T. 包埋剂</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td><td>包埋介质</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>珠磨仪</td></tr><tr><td>TissueLyser LT 适配器，12 管</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 冷冻模具</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td>样本模具</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>硫氰酸胍</td></tr><tr><td>Tween20（500 mL）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR 显微载玻片 - Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin 染色缸</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Coplin 染色缸</td></tr></tbody></table>

骨骼肌内脂肪形成及其细胞来源的检测指南

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）是一类间充质基质细胞，在骨骼肌稳态维持和再生过程中发挥关键作用。FAPs 构建并维持作为肌纤维分子支架的细胞外基质。此外，FAPs 对肌纤维再生至关重要，因为它们分泌多种肌肉干细胞（MuSCs）可感知的有益因子。然而，在疾病状态下，FAPs 是肌内脂肪和纤维化瘢痕组织的细胞来源。这种脂肪性纤维化是肌少症和杜氏肌营养不良等神经肌肉疾病的标志性特征。目前确定 FAPs 为何及如何分化为肌内脂肪的一个重要障碍，是脂肪细胞的有效保存及其在冷冻组织切片中的后续可视化。传统的骨骼肌组织处理方法（例如速冻）无法充分保存单个脂肪细胞的形态，从而阻碍了准确的观察与定量分析。为克服这一难题，已建立了一种严谨的实验方案，可在骨骼肌切片中良好保存脂肪细胞形态，实现肌内脂肪的可视化、成像和定量分析。该方案还详细说明了如何对部分肌肉组织进行 RT-qPCR 处理，使研究者能够通过检测脂肪生成相关基因表达水平的差异，验证所观察到的脂肪形成变化。此外，该方案还可调整用于肌肉样本的整体免疫荧光染色以可视化脂肪细胞。最后，本方案阐述了如何对表达 Pdgfrα 的 FAPs 进行遗传谱系示踪，以研究 FAPs 的脂肪生成转化过程。该方案可稳定获得高分辨率且形态准确的脂肪细胞免疫荧光图像，并结合 RT-qPCR 进行验证，从而实现对肌内脂肪进行可靠、严谨且可重复的可视化与定量分析。综上所述，本文所述的分析流程是我们深入理解 FAPs 如何分化为肌内脂肪的第一步，也为验证预防脂肪形成的新干预手段提供了框架。

肌内脂肪的免疫荧光可视化 
按照上述步骤并参考图1A，取自甘油损伤后21天的胫骨前肌（TA）组织切片，部分样本在液氮冷却的异戊烷中快速冷冻后立即保存，另一部分则用4%多聚甲醛（PFA）固定2.5小时。经冷冻切片和染色处理后，对两个样本均在肌肉中段（即TA最大横截面区域）进行成像。未固定的TA样本中的PERILIPIN+脂肪细胞（图1B）与固定后的切片（图1C）相比，形态发生显著改变，导致其识别、观察以及后续定量分析更加困难且可能不准确。值得注意的是，首次检测到PERILIPIN+脂滴约在损伤后第5天，大多数脂肪细胞在第7天时已形成。至损伤后21天，脂肪细胞已完全成熟。
由于每块胫骨前肌（TA）中的脂肪含量与诱导损伤的严重程度密切相关，因此必须对TA造成足够严重的损伤，才能有效观察和研究肌内脂肪的形成。使用墨水在尸体TA上练习注射是提高损伤严重程度的有效方法。成功的损伤通常超过肌肉总体积的50%。需要注意的是，受损的肌肉区域表现为无肌纤维的区域，或存在至少一个细胞核位于中央的肌纤维区域，后者是再生肌纤维的典型特征。
该方案可轻松适用于三维条件下对FAP和脂肪进行染色。具体操作为，从TA肌肉经固定后小心分离出多根肌纤维，随后进行整体免疫荧光染色。关键在于需将纤维妥善固定于载玻片上，同时避免组织受到过度压迫。通过使用可塑性黏土垫脚，操作者可调节所需厚度，并将盖玻片牢固固定在载玻片上，甚至可适用于倒置显微镜观察（图4A）。该方法已成功用于标记PDGFRα+ FAPs、Phalloidin+肌纤维以及表达PERILIPIN的脂肪细胞（图4B，补充视频1和补充视频2）。在获取跨越多达150 µm厚度的多个z平面图像后，利用显微镜软件中的三维重建模块生成三维重构图像。
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg" /> 
图 4：整体免疫荧光染色。 （A）样本封片及加盖盖玻片进行整体染色的顶视图与侧视图。（B）纤维脂肪生成祖细胞（绿色；左）、脂肪细胞（红色；右）、肌纤维（灰色）和细胞核（蓝色）的代表性三维重建图像。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
肌内脂肪含量的定量分析 
获取肌内脂肪图像后，使用 ImageJ/FIJI 中的细胞计数功能手动计数 PERILIPIN 阳性细胞的数量+ 脂肪细胞（图 5A）。接下来，测定肌肉切片的总面积以及由肌纤维内中央细胞核所定义的损伤区域面积。为控制损伤严重程度的影响，将脂肪细胞的总数除以损伤区域面积，得到每1 mm²损伤区域内的脂肪细胞数量。2 受伤肌肉。通常，表现出 &#60;30% 的损伤区域被排除在定量分析之外。需要注意的是，尽管在无损伤情况下脂肪细胞极为罕见，每个横截面区域仅零到八个，但脂肪细胞总数仍按总面积进行了标准化处理。如文中高亮所示 图5B，与未受伤的TA肌肉相比，甘油损伤会导致肌肉内脂肪大量增加。或者，由于Perilipin染色效果非常清晰且信噪比较高，也可使用该方法 分析颗粒 用于确定Perilipin所占据的总面积。然而，该方法无法区分脂肪细胞较小还是数量较少。每只小鼠至少选取四只不同个体动物的三个切片进行成像和定量分析，并计算每只小鼠脂肪细胞的平均数量。
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg" /> 
图5：肌内脂肪的定量分析。（A）使用ImageJ中的Cell Counter功能计数PERILIPIN+脂肪细胞（白色）的代表性图像。比例尺：50 µm。（B）甘油注射后21天，对整个胫骨前肌（TA）脂肪细胞数量进行定量，并归一化至损伤区域每1 mm2。每个数据点代表一只小鼠的平均值。误差线表示标准误（SEM）。**** = p &#60; 0.0001。（C）匀浆后经氯仿相分离所得的RNA层用于RT-qPCR分析。（D）甘油损伤后不同时间点，早期成脂基因Pparg和Cepbα，以及两个成熟脂肪细胞标志物Plin1和Adipoq的表达水平变化倍数。每个数据点代表一只小鼠的平均值。误差线表示标准误（SEM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了独立验证肌内脂肪的含量，可检测多种脂肪生成标志物的基因表达水平。为此，可在损伤后的不同时间点，从用于免疫荧光分析的同一部分胫骨前肌（TA）肌肉组织中提取RNA（见上述步骤）。采用珠磨机结合硫氰酸胍对组织进行匀浆。加入氯仿并离心后，小心提取上层含RNA的液体，并使用小型离心柱进行RNA纯化（图5C）。该方法通常可获得高质量和高产量的RNA，适用于RT-qPCR和RNA测序等所有后续分析。在RT-qPCR中，通过ΔΔCT法38计算脂肪生成相关基因相对于看家基因的相对表达水平，并评估其变化。如图5D所示，与未损伤的TA肌肉相比，甘油损伤后3天即可诱导早期脂肪生成标志物如Pparg和Cebpα的表达。而成熟脂肪细胞标志物，如Adiponectin（Adipoq）&#160;和Perilipin（Plin1），在甘油损伤后5天即可检测到表达。 
脂肪细胞的遗传谱系示踪 
此处介绍的脂肪细胞染色方案可轻松扩展，以包含对脂肪前体细胞（FAPs）的遗传谱系示踪，从而绘制并追踪其向脂肪细胞的分化命运。例如，我们此前已证明可诱导发生重组 通过 他莫昔芬给药在 Pdgfr&#945;CreERT2；Rosa26EYFP&#160;小鼠在损伤前2周，有效移除了floxed终止密码子，从而在FAPs中永久激活EYFP表达（图6A）。我们采用本文所述的他莫昔芬给药方案实现了较高的重组效率，约75%的PDGFR&#945;+ 表达EYFP的FAPs20，这与其他实验室报道的结果相似27,39,40. 证明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源，大部分FAPs已转化为EYFP+ 甘油损伤后7天表达PERILIPIN的脂肪细胞（图6B).
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg" /> 
图6：FAPs的谱系示踪。 （A）实验设置的示意图概述。（B）代表性免疫荧光图像，显示PDGFRα+ FAPs（红色，箭头）和PERILIPIN+脂肪细胞（红色，星号）中EYFP（黄色）的成功重组与激活。比例尺：25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
多种细胞类型的检测 
本方案也可用于可视化肌源性区室。使用针对 PAX7 和 MYOD1 的抗体，可在甘油损伤后第 5 天轻松检测到肌肉干细胞（MuSCs）和成肌细胞，即使在 PFA 固定的肌肉组织切片中亦可实现（图 7）。因此，本研究所提供的方案具有良好的通用性和适应性，不仅可用于标记和成像脂肪细胞和脂肪前体细胞（FAPs），还可拓展至肌源性谱系的其他细胞类型。
<img alt="图7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg" /> 
图7：肌肉干细胞与成肌细胞的免疫荧光染色。（A）实验设置的示意图。（B）代表性免疫荧光图像，显示肌肉干细胞（MuSC）（左侧，黄色）经PAX7染色，成肌细胞（右侧，黄色）经MYOD1染色，结果均呈阳性。LAMININ标记肌纤维轮廓（白色），细胞核呈青色。比例尺：50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充视频 1：FAPs 的三维重建。损伤后 21 天，经 PHALLOIDIN（灰色）、PDGFRα（绿色）和 DAPI（蓝色）染色的肌纤维、FAPs 及细胞核的三维重建图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2：肌内脂肪的三维重建。 肌纤维束（灰色，PHALLOIDIN）和肌内脂肪（红色，PERILIPIN）的容积重建图像，显示在甘油损伤后 21 天，肌纤维已被脂肪组织取代。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

健康肌肉组织被肌内脂肪取代是多种人类疾病和病理状态的显著特征。本方案阐述了如何对肌内脂肪进行可视化、成像和定量分析，从而为深入研究肌内脂肪形成的潜在机制提供严谨的方法支持。

纤维-脂肪生成祖细胞（FAPs）是一类间充质基质细胞，在骨骼肌稳态维持和再生过程中发挥关键作用。FAPs 构建……

研究骨骼肌内脂肪（肌少症和神经肌肉疾病的标志性特征）的一个重要障碍是脂肪细胞的有效保存以及后续在冷冻组织切片中的可视化。本方案可保存脂肪细胞形态，并对齐骨骼肌组织切片，从而实现对肌内脂肪进行可靠、严谨且可重复的观察与定量分析。我们的分析流程为验证新型干预手段（例如预防杜氏肌营养不良症等疾病中脂肪形成的方法）提供了框架。演示该实验操作的是本实验室的研究技术员 Connor Johnson。首先，使用新的酒精棉片清洁待注射的腿部以进行消毒。用胰岛素注射器抽取 30 至 50 微升的 50% 甘油。轻轻向上梳理小腿部位的毛发，以暴露胫前肌（TA）的位置。确定胫前肌位置后，将针头从靠近踝关节的远端插入胫前肌。将针头完全插入肌肉中，缓慢注射甘油，同时逐渐退出针头，以确保大部分肌肉受到损伤。用70%乙醇充分喷洒小鼠需要切开的部位，以防止毛发污染解剖区域和器械。使用剪刀在靠近骨盆的大腿顶部周围剪开皮肤。从腿部上方开始，轻轻向下拉至脚踝处的皮肤。首先，使用尖头镊子去除外层结缔组织，然后再采集胫骨前肌（TA）。将镊子从肌肉底部插入TA下方，从远端肌腱处开始，轻轻向上朝膝盖方向牵拉。在肌肉末端处停止操作。不要强行越过在下膝处感受到的阻力。如果在到达下膝之前已遇到明显阻力，应停止操作并继续清除残留的结缔组织。一旦用镊子将胫前肌部分从腿部抬起，即使用解剖刀以相同动作切断胫前肌与下膝的连接。用剪刀在踝关节处剖开肌腱，以完全切除胫骨前肌（TA）。操作时仅触碰肌腱部分，避免损伤肌纤维。在远离肌腱的一端切断三分之一的TA肌肉。将其放入微量离心管中，并通过浸入液氮进行速冻。将剩余三分之二的组织浸入已标记的孔中，加入4%PFA用于组织学处理。务必记录第一块和最后一块组织放入固定液的时间。置于4°C条件下，在旋转摇床上孵育2至2.5小时。固定后，从孔中移除PFA。用冰冷的1×PBS冲洗组织2至3次，然后用冰冷的1×PBS洗涤2至3次，每次洗涤5分钟。从孔中移除PBS，并加入足量的含30%蔗糖的1×PBS，使组织能够漂浮。4°C 条件下在摇床上孵育过夜。打开显微镜并启动成像软件。将载玻片固定在载物台上。使用任意通道确定待成像区域。在成像软件中，调节每个通道的增益和曝光时间。采集每个通道下整个组织的图像，并将各个图像拼接，生成完整的TA横切面复合图像。开始之前，将无RNase水预热至45摄氏度，并配制新鲜的70%乙醇。向含有样品的每根试管中加入1000微升硫氰酸胍。必须使用经Bead Beater认证的试管。向每根试管中加入三颗中等大小的珠子，或一颗大珠子和一颗小珠子。使用珠磨机以 50 赫兹均质组织 2 至 4 分钟。根据组织类型和样品大小，可能需要长达 10 分钟。加入200微升氯仿。将样品振荡15秒。室温下孵育2至3分钟。在12,000 × g条件下离心15分钟。用移液器小心吸取350微升澄清上清液，并加入含有350微升70%乙醇的新微量离心管中。注意不要吸出下层的蛋白质和/或DNA层。将最多700微升该混合液转移至置于2毫升收集管中的微型离心柱中。按照制造商说明书继续进行RNA提取。根据预期产量，使用30至50微升无RNase的水进行洗脱。将RNA置于冰上，并使用分光光度计测定产量。将RNA保存在负80摄氏度。使用最多一微克RNA，按照试剂盒说明书，利用cDNA合成试剂盒合成cDNA。运行完成后，加入80微升无RNase的水。将样品在 -20 摄氏度下保存。采用 384 孔板格式，向每孔底部加入 1 µL 引物。引物冻干可获得更紧密的技术重复。覆盖孵育直至引物完全蒸发。设置样本反应，每个样本进行四到八个技术重复。PCR 运行结束后，将原始循环阈值（Ct）数据归一化至内参基因水平，并通过计算 ΔΔCt 法确定倍数变化。与固定后的组织切片相比，未固定的脂肪组织（TAs）中的 Perilipin 阳性脂肪细胞形态发生显著改变，导致其鉴定、观察以及后续定量分析更加困难，且可能不够准确。相比之下，PFA 固定能够保存脂肪细胞的形态，从而实现对肌内脂肪的准确检测。与未损伤的胫骨前肌（TA）相比，甘油损伤在损伤后三天即可诱导早期脂肪生成标志物（如 PPARγ 和 C/EBPα）的表达。成熟标志物（如脂联素和 perilipin）在甘油损伤后五天即可被检测到。通过遗传谱系示踪技术，大多数表达血小板源性生长因子受体α的FAPs均表达谱系标记EYFP。甘油损伤后第7天，EYFP阳性的FAPs转变为表达EYFP和脂滴包被蛋白（perilipin）的脂肪细胞，表明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源。该方案还可进行调整以可视化肌源性细胞区室。使用针对 PAX7 和 MYOD1 的抗体，可分别在甘油损伤后五天 readily 检测到肌肉干细胞和成肌细胞的标志物，即使在 PFA 固定的肌肉组织切片中亦如此。该方案还可适用于可视化和定量脂肪细胞及其他成体组织。此外，我们的组织保存技术可与多种不同的常规技术兼容。

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越来越多的证据表明，过量的脂质在骨骼肌内的积聚会导致脂毒性并引发糖尿病。本文提供了一套完整的实验方案，包括组织处理、Bodipy...

骨骼肌中脂滴含量的纤维类型与亚细胞特异性分析

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本研究描述了基于脱细胞的方法，用于通过完整的肌肉体积来可视化和量化肌内脂肪组织（IMAT）的沉积，以及量化构成IMAT的单个脂肪细胞的各项指标。...

基于脱细胞技术的骨骼肌脂肪浸润定量分析

我们研究了Bos indicus和杂交公牛的骨骼肌组织，以解释其肉质性状的差异。 Warner-Bratzler剪切力（WBSF）值介于4.7 kg至4.2...

探究背最长肌：解析其与瘤牛及杂交公牛肉质的相关性

由于人体组织获取受限，肌间脂肪组织（IMAT）的生物学特性在很大程度上尚未被探索。本文介绍了一种从冷冻的人类IMAT样本中分离细胞核并构建文库的详细方案，用于单细胞核RNA测序，以鉴定这一独特脂肪储存库的细胞组成。...

从人间质脂肪组织中分离细胞核及后续单细胞核RNA测序

本研究中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行伊文思蓝染料（EBD）分析的简便方法。该技术是表征骨骼肌完整性和建立斑马鱼肌肉营养不良模型的有力工具，也是开发新型治疗手段的重要方法。...

伊文思蓝染色法分析斑马鱼幼鱼骨骼肌完整性

斑马鱼是研究肌肉功能和疾病的理想模型。在早期胚胎发育过程中，斑马鱼开始出现规律的肌肉收缩，产生节律性游泳行为，当肌肉功能受到干扰时，该行为会发生改变。本文描述了一种触碰诱发反应和运动能力检测方法，通过评估游泳表现来反映肌肉功能。...

利用触觉诱发反应和运动能力检测评估斑马鱼肌肉功能与性能

学习使用PFA固定和甘油损伤技术可视化骨骼肌内脂肪形成的方法。该方案通过保留脂肪细胞形态，实现肌内脂肪的精确定量分析，为研究肌肉萎缩症和杜氏肌营养不良等疾病中的脂肪形成机制提供可靠框架。

骨骼肌内脂肪形成及其细胞来源的检测指南

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