骨骼肌内脂肪形成及其细胞来源的检测指南

研究骨骼肌内脂肪（肌少症和神经肌肉疾病的标志性特征）的一个重要障碍是脂肪细胞的有效保存以及后续在冷冻组织切片中的可视化。本方案可保存脂肪细胞形态，并对齐骨骼肌组织切片，从而实现对肌内脂肪进行可靠、严谨且可重复的观察与定量分析。我们的分析流程为验证新型干预手段（例如预防杜氏肌营养不良症等疾病中脂肪形成的方法）提供了框架。演示该实验操作的是本实验室的研究技术员 Connor Johnson。

首先，使用新的酒精棉片清洁待注射的腿部以进行消毒。用胰岛素注射器抽取 30 至 50 微升的 50% 甘油。轻轻向上梳理小腿部位的毛发，以暴露胫前肌（TA）的位置。确定胫前肌位置后，将针头从靠近踝关节的远端插入胫前肌。

将针头完全插入肌肉中，缓慢注射甘油，同时逐渐退出针头，以确保大部分肌肉受到损伤。用70%乙醇充分喷洒小鼠需要切开的部位，以防止毛发污染解剖区域和器械。使用剪刀在靠近骨盆的大腿顶部周围剪开皮肤。

从腿部上方开始，轻轻向下拉至脚踝处的皮肤。首先，使用尖头镊子去除外层结缔组织，然后再采集胫骨前肌（TA）。将镊子从肌肉底部插入TA下方，从远端肌腱处开始，轻轻向上朝膝盖方向牵拉。在肌肉末端处停止操作。

不要强行越过在下膝处感受到的阻力。如果在到达下膝之前已遇到明显阻力，应停止操作并继续清除残留的结缔组织。一旦用镊子将胫前肌部分从腿部抬起，即使用解剖刀以相同动作切断胫前肌与下膝的连接。

用剪刀在踝关节处剖开肌腱，以完全切除胫骨前肌（TA）。操作时仅触碰肌腱部分，避免损伤肌纤维。在远离肌腱的一端切断三分之一的TA肌肉。将其放入微量离心管中，并通过浸入液氮进行速冻。

将剩余三分之二的组织浸入已标记的孔中，加入4%PFA用于组织学处理。务必记录第一块和最后一块组织放入固定液的时间。置于4°C条件下，在旋转摇床上孵育2至2.5小时。

固定后，从孔中移除PFA。用冰冷的1×PBS冲洗组织2至3次，然后用冰冷的1×PBS洗涤2至3次，每次洗涤5分钟。从孔中移除PBS，并加入足量的含30%蔗糖的1×PBS，使组织能够漂浮。

4°C 条件下在摇床上孵育过夜。打开显微镜并启动成像软件。将载玻片固定在载物台上。

使用任意通道确定待成像区域。在成像软件中，调节每个通道的增益和曝光时间。采集每个通道下整个组织的图像，并将各个图像拼接，生成完整的TA横切面复合图像。

开始之前，将无RNase水预热至45摄氏度，并配制新鲜的70%乙醇。向含有样品的每根试管中加入1000微升硫氰酸胍。必须使用经Bead Beater认证的试管。

向每根试管中加入三颗中等大小的珠子，或一颗大珠子和一颗小珠子。使用珠磨机以 50 赫兹均质组织 2 至 4 分钟。根据组织类型和样品大小，可能需要长达 10 分钟。

加入200微升氯仿。将样品振荡15秒。室温下孵育2至3分钟。

在12,000 × g条件下离心15分钟。用移液器小心吸取350微升澄清上清液，并加入含有350微升70%乙醇的新微量离心管中。注意不要吸出下层的蛋白质和/或DNA层。将最多700微升该混合液转移至置于2毫升收集管中的微型离心柱中。

按照制造商说明书继续进行RNA提取。根据预期产量，使用30至50微升无RNase的水进行洗脱。将RNA置于冰上，并使用分光光度计测定产量。

将RNA保存在负80摄氏度。使用最多一微克RNA，按照试剂盒说明书，利用cDNA合成试剂盒合成cDNA。运行完成后，加入80微升无RNase的水。

将样品在 -20 摄氏度下保存。采用 384 孔板格式，向每孔底部加入 1 µL 引物。引物冻干可获得更紧密的技术重复。

覆盖孵育直至引物完全蒸发。设置样本反应，每个样本进行四到八个技术重复。PCR 运行结束后，将原始循环阈值（Ct）数据归一化至内参基因水平，并通过计算 ΔΔCt 法确定倍数变化。与固定后的组织切片相比，未固定的脂肪组织（TAs）中的 Perilipin 阳性脂肪细胞形态发生显著改变，导致其鉴定、观察以及后续定量分析更加困难，且可能不够准确。

相比之下，PFA 固定能够保存脂肪细胞的形态，从而实现对肌内脂肪的准确检测。与未损伤的胫骨前肌（TA）相比，甘油损伤在损伤后三天即可诱导早期脂肪生成标志物（如 PPARγ 和 C/EBPα）的表达。成熟标志物（如脂联素和 perilipin）在甘油损伤后五天即可被检测到。

通过遗传谱系示踪技术，大多数表达血小板源性生长因子受体α的FAPs均表达谱系标记EYFP。甘油损伤后第7天，EYFP阳性的FAPs转变为表达EYFP和脂滴包被蛋白（perilipin）的脂肪细胞，表明FAPs确实是肌内脂肪的细胞来源。该方案还可进行调整以可视化肌源性细胞区室。

使用针对 PAX7 和 MYOD1 的抗体，可分别在甘油损伤后五天 readily 检测到肌肉干细胞和成肌细胞的标志物，即使在 PFA 固定的肌肉组织切片中亦如此。该方案还可适用于可视化和定量脂肪细胞及其他成体组织。此外，我们的组织保存技术可与多种不同的常规技术兼容。