从不同脂肪组织库中分离和鉴定血管内皮细胞用于后续应用

本方案将使研究人员能够分离感兴趣的动脉并获取血管细胞，以进行多种功能检测。研究人员可探究不同血管床及细胞类型，从而拓展对血管细胞生物学及其功能障碍机制的认识。该方法最适用于从事基础血管细胞生物学研究，以及在疾病动物模型中研究血管细胞功能障碍的研究人员。

应特别注意优化消化方案，尤其是当目标血管床与本文所述不同时。首先，使用解剖针固定小鼠，并用70%乙醇喷洒腹部表面。用镊子提起生殖器上方的皮肤，于皮肤上做一个约两毫米的小切口。

将剪刀尖插入切口处，从初始切口开始，沿中线向上作一个4至5厘米长的切口，直至胸骨基底部。在前肢正下方的中线外侧，作一个1厘米长的横向切口。在后肢与外生殖器之间，作一个1厘米长的斜向切口。

沿中线皮肤切口做小切口，剥离相关结缔组织，暴露皮下脂肪组织。辨认呈C形的皮下脂肪组织以及横穿腹腔的动脉或静脉。从靠近生殖器的C形底部开始，轻轻夹住脂肪组织以暴露结缔组织。

在结缔组织上做小切口，以分离皮肤下的脂肪，注意避免扰动暴露的血管系统。继续剥离结缔组织，直至皮下脂肪组织能够完整移除。小心地将暴露的动脉与周围结缔组织分离。

将分离的皮下脂肪组织置于冰上的 HEPES 缓冲液中保存。对剩余的后部皮下脂肪库重复解剖操作。为分离肠系膜脂肪库，使用格拉夫镊提起膀胱上方的薄腹膜腔壁，并用直剪刀做一小切口。

缓慢提起腹腔壁，将直型虹膜剪插入切口处。从膀胱开始沿中线向胸骨方向做一长度为4至5厘米的切口。然后使用直型虹膜剪，在中线两侧分别向后肢上方和前肢下方各做一条长约1厘米的横向切口。

使用格雷费镊子剥离腹壁肌肉组织，暴露腹膜内脏。用一把5号镊子将肠管从内脏腔中提起，以显露肠系膜脂肪组织。使用弯剪和5号镊子沿结肠分离脂肪组织，从盲肠开始，直至结肠向下消失处为止。

然后，沿小肠分离至胰腺的脂肪组织。切除小部分胰腺，以完全分离肠系膜脂肪组织。将分离得到的肠系膜脂肪组织置于冰上的 HEPES 缓冲液中保存。

为了分离动脉，首先将脂肪组织转移至含有10毫升冷HEPES缓冲液的解剖皿中。在体视显微镜下，调整皮下脂肪组织的位置以暴露动脉-静脉对；调整内脏脂肪组织的位置以暴露花椰菜样结构及其相应的动脉-静脉对。

使用55号镊子小心地从动脉上剥离实质脂肪组织。每次去除少量脂肪组织，避免损伤目标血管结构。持续操作直至动脉完全清除实质脂肪组织。

使用5号镊子将清洗后的动脉转移至含有新鲜HEPES缓冲液的新离心管中，并置于冰上保存，直至准备进行消化。首先，将各1毫克的dispase和elastase加入一个2毫升的微量离心管中。加入2毫升解离溶液，涡旋混匀，于37°C孵育至完全溶解。

使用5号镊子将清洗后的动脉转移至相应的样品管中。将样品管在37摄氏度孵育1小时，每10至15分钟轻轻翻转一次以进行温和振荡。在此期间，向新的样品管中每份样品加入1毫克I型胶原酶。

孵育后，让动脉沉降到管底，从上层转移500微升缓冲液至含有胶原酶的管中。涡旋混匀，并将此溶液返回至相应的样品管中。将样品在37摄氏度孵育15分钟。

振荡样品管后，确保动脉组织已分散成小片段。使用玻璃移液器将消化后的组织剧烈吹打10至15次，以机械方式解离细胞。将消化后的样品通过70微米细胞滤网或流式细胞仪专用滤管，以获得单细胞悬液。

将单细胞悬液离心并弃去上清液。用1毫升含5% BSA的PBS重悬细胞沉淀，孵育30分钟。加入1微升细胞活性染料，避光孵育30分钟。

将细胞悬液离心，并将细胞沉淀重悬于200 µL含1% BSA的PBS中。加入与CD31和CD45偶联的一抗，于冰箱中在摇床上孵育15分钟。通过向细胞悬液中直接加入1 mL含1% BSA的PBS洗涤细胞。

将细胞悬液离心，并将沉淀重悬于200 µL含0.1% BSA的1%甲醛溶液中。用铝箔包裹离心管，置于冰箱中保存，直至进行流式细胞术分析。通过消化皮下脂肪动脉获得的细胞样本用于利用流式细胞术鉴定内皮细胞群体。

CD31阳性CD45阴性细胞被鉴定为内皮细胞。细胞活力染色可识别出在固定前经分离和消化程序仍存活的活细胞。为了鉴定不同脂肪组织库血管中膜蛋白表达的差异及内皮细胞特征，对分离的细胞进行了脂肪酸转位酶CD36的检测。

在皮下和肠系膜脂肪组织中鉴定出 CD36 阳性的内皮细胞。对 CD36 表达以及皮下和肠系膜内皮细胞的定量分析显示，皮下内皮细胞中表达 CD36 的内皮细胞比例以及 CD36 表达强度均高于肠系膜内皮细胞。仔细分离、鉴定并清除动脉周围的组织至关重要。

最重要的是，消化方案应产生足够数量的活细胞，以满足后续应用的需求。按照本方案获得的分离细胞群体可用于多种应用，包括但不限于电生理学、分子谱型分析，以及体外药物筛选的原代细胞系的建立。