Name: 体外 坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 了解顶端朝外肠样模型用于坏死性小肠结肠炎的体外研究方法。该技术通过反转极性实现顶端表面暴露，支持口服药物测试，为肠道炎症研究提供新型平台。

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本内容完全由作者负责，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。HC 获得美国国立卫生研究院资助项目 P20GM134973 的支持。KB 获得儿童医院基金会（CHF）和长老会健康基金会（PHF）资助项目的支持。我们感谢俄克拉荷马大学健康科学中心分子生物学与细胞计量学研究实验室提供核心设施，用于共聚焦成像。

本研究中的所有动物实验均经俄克拉荷马大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会批准。早产非人灵长类动物（NHP，妊娠90%，橄榄狒狒，Papio anubis）的小肠便利样本是在另一项研究实施安乐死后获得的（方案编号 #101523-16-039-I）。
1. 建立顶膜朝外的肠类器官“肠坏死体外模型”
<ol>
	<li>培养基制备与类器官处理 
	注意：按照标准无菌技术制备后，培养基可在 4 °C 下保存最多 1 周。
	<ol>
		<li>通过将 50 mL 人源类器官生长培养基与 50 mL 类器官补充剂混合，制备无抗生素培养基（AFM）（参见材料表）。通过将 100 µL 的 0.5 M EDTA 加入 9,900 µL 的 PBS 中，制备 5 mM 乙二胺四乙酸/1×磷酸盐缓冲液（EDTA/PBS）。</li>
		<li>将杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆 F12 营养混合物 + 15 mM HEPES 缓冲液（DMEM/F12）冷却至 2–8 °C。</li>
		<li>通过将 100 µg TNF-α 粉末悬浮于 1 mL 1×PBS 中，制备 TNF-α 储存液。使用 AFM 作为溶剂，进一步将 TNF-α 储存液稀释至 20 ng/mL 和 50 ng/mL 浓度。通过将 2 mg LPS 悬浮于 1 mL 1×PBS 中，制备 LPS 储存液。使用 AFM 作为溶剂，进一步将 LPS 储存液稀释至 100 µg/mL 和 200 µg/mL 浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3D 肠道类器官极性翻转 
	注意：以下操作旨在将一个 24 孔平底组织培养板中的类器官转移至两个 24 孔超低吸附组织培养板中。组织培养板在使用前应预热至 37 °C 至少 30 分钟。基底侧朝外的 3D 肠道类器官的构建方法此前已被多个研究组描述过35,36，本实验仅对培养基部分进行了轻微修改（详见上文）。类器官构建的一般流程与人类来源类器官无异。简而言之，切除的组织经清洗、切割成小片段后，在细胞解离缓冲液中孵育。细胞悬液随后通过 70 µm 细胞筛，获得隐窝结构，并以高密度接种。
	<ol>
		<li>吸除已建立的 3D 基底侧朝外肠道类器官 24 孔板中每孔的培养基。</li>
		<li>向 24 孔板每孔加入 500 µL 冰冷的 5 mM EDTA/PBS，并使用 p200 移液器上下吹打至少 5–6 次，轻柔地机械破坏基底膜提取物/细胞外基质（ECM）穹顶结构。</li>
		<li>将四个孔的内容物转移至一个 15 mL 圆锥形离心管中，并向该管中加入 8 mL 冰冷的 EDTA/PBS。以相同方式转移其余 20 个孔的内容物。</li>
		<li>将 15 mL 圆锥形离心管置于 4 °C 下，在旋转平台或摇床上以 330 rpm 转速孵育 1 小时。孵育结束后，在 4 °C 下以 300 × g 离心 3 分钟。弃去每管中的上清液。</li>
		<li>合并细胞沉淀，用 5 mL DMEM/F12 洗涤，并将细胞悬液分装至两个 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 3 分钟使细胞成团，弃去上清液，每管加入 12 mL AFM，确保充分重悬细胞沉淀。</li>
		<li>将 500 µL 类器官悬液移入两个 24 孔超低吸附板的每孔中。</li>
		<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–5 天，或直至类器官完成极性翻转。</li>
		<li>为检测类器官极性翻转情况，首先通过免疫荧光染色确认翻转结果并确定平均翻转时间（约 3 天），然后使用普通光学显微镜观察确认极性变化。顶端朝外的类器官外观细胞密集，而基底侧朝外的类器官通常表现为具有一个较大的中央腔或出芽结构（参见补充图 1）。 
		注意：一旦操作流程标准化，翻转为顶端朝外的转化率通常超过 95%。顶端朝外类器官适用于终末实验；尽管理论上可将顶端朝外类器官传代为少量基底侧朝外类器官，但不推荐常规操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>顶端朝外的“类坏死性小肠结肠炎（NEC）体外模型” 
	注意：一旦类器官完成极性翻转，应尽快用于后续实验，因为其在顶端朝外构型下的长期存活能力尚未被证实超过 3–4 天。在以下 NEC 体外模型中，类器官经 24 小时处理后立即收集，并保存用于下游实验。
	<ol>
		<li>当类器官在显微镜下观察显示极性翻转效率达到至少 95% 时，从培养箱中取出培养板，将 24 孔板中的八个孔内容物收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中。由于顶端朝外类器官处于悬浮状态，可直接用移液器吸取类器官/培养基混合液。在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>细胞成团后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 4 mL AFM 中，其中加入所需体积的 1×PBS（对照组，此处为 10 µL，以匹配最高处理组添加体积）。</li>
		<li>将 500 µL 类器官/PBS/AFM 悬液移入 24 孔超低吸附板的八个孔中，并将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。</li>
		<li>在常氧条件下，对 TNF-α（20 ng/mL 和 50 ng/mL）和 LPS（100 µg/mL 和 200 µg/mL）处理重复步骤 1.3.1–1.3.3。对于所有低氧处理，重复步骤 1.3.1–1.3.3，但将培养板置于另一培养箱中，在 37 °C、5% CO2、1% O2 条件下孵育 24 小时。 
		注意：步骤 1.3.4 可与步骤 1.3.1–1.3.3 同时进行，但为清晰起见，上述&#160;操作按处理方式分开描述，以降低复杂性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫荧光染色与共聚焦显微镜观察
<ol>
	<li>染色溶液的配制
	<ol>
		<li>通过将7 µL Triton X-100加入1x PBS中，定容至7 mL，配制0.1% Triton X-100。通过将30 µL Tween-20加入1x PBS中，定容至30 mL，配制PBST（PBS-Tween）。</li>
		<li>通过将700 µL正常驴血清（NDS）加入6.3 mL PBST中，配制10%正常驴血清（NDS）/PBST溶液。通过将70 µL NDS加入PBST中至终体积为7 mL，配制1% NDS/PBST溶液。 
		注意：驴血清&#160;此处用于与二抗宿主相关联。然而，封闭血清的物种应与二抗的物种一致，以有效阻断非特异性结合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色（第1天）
	<ol>
		<li>将24孔板中四个孔的内容物转移至1.5 mL微量离心管中。对所有需要的孔/处理组重复此操作，每种处理组分别置于不同的离心管中。将离心管在300 x g 4 °C 下离心 4 分钟。待类肠体沉淀后，移除上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 300 µL 4% 多聚甲醛固定液中，室温（RT）孵育 30 分钟。30 分钟后，于 300 x g 4 °C 下离心 4 分钟，弃上清，用 500 µL 无菌、室温 1x PBS 重悬沉淀。</li>
		<li>将离心管在 300 x g 4 °C下离心4分钟。弃上清，加入500 µL 0.1% Triton X-100，室温孵育1小时。</li>
		<li>孵育1小时后，以300 x g离心试管 g 4 °C 下离心 4 分钟，弃上清液。加入 500 µL 1×PBS 重悬，将离心管置于旋转仪或摇床上，2-8 °C、200 rpm 振荡孵育 15 分钟。重复此步骤共 4 次。</li>
		<li>将离心管在300 x g 4 °C下离心4分钟，弃上清液。加入500 µL 10% NDS/PBST，室温孵育45分钟。孵育期间，为24孔板的8个孔配制一抗溶液：将20 µL重组抗villin抗体、10 µL E-cadherin抗体与1970 µL 1% NDS/PBST混合。</li>
		<li>孵育45分钟后，以300 x g离心试管 g 4 °C 下离心 4 分钟。将离心管置于冰上。弃去上清液，加入 250 µL 一抗溶液。2–8 °C 条件下孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色（第2天）
	<ol>
		<li>将离心管在 300 x g 4 °C 下离心 4 分钟，弃上清液。根据沉淀物的大小，向每管中加入 250–500 µL PBST，于 2–8 °C、200 rpm 条件下在旋转仪或摇床上孵育 1 小时。重复 PBST 洗涤 4 次。</li>
		<li>将52 µL Cy3标记的驴抗兔IgG（H+L）加入50%甘油中，并将5.2 µL驴抗小鼠荧光绿488二抗加入5142.8 µL 1% NDS/PBST中，配制二抗溶液。</li>
		<li>最后一次PBST洗涤和离心后，从各管中移除上清液。每管加入200 µL二抗溶液，于2–8 °C避光孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色后顶膜朝外的类肠体包埋（第1天）
	<ol>
		<li>将含蓝色核染料的甘油基封片剂在1小时内恢复至室温。</li>
		<li>将离心管在300 x g 4 °C下离心4分钟。移除100 µL上清液，用剩余的约100 µL上清液重悬细胞。将细胞悬液转移至0.5 mL离心管中。</li>
		<li>在微型离心机中离心试管20秒，使细胞沉淀。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于100 µL远红外核酸染料中。室温孵育10分钟。</li>
		<li>在微型离心机中离心试管20秒，使细胞沉淀。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于100 µL 1x PBS中。重复进行第二次洗涤。</li>
		<li>在微型离心机中离心试管20秒，使细胞沉淀，吸除70 µL上清液。用剩余的PBS重悬细胞，将悬液转移至标记的盖玻片（24 mm × 60 mm）上。</li>
		<li>将75 µL封片剂直接滴加到样本上，并用移液器吸头去除气泡。将盖玻片置于室温避光条件下过夜（18–24 h）固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色后顶膜朝外的类肠体封片（第2天）
	<ol>
		<li>过夜固化后，在盖玻片上加入一层薄薄的甘油（约15 µL）。将盖玻片置于载玻片上，轻轻按压使其固定。轻敲以去除盖玻片与载玻片之间的气泡。</li>
		<li>让盖玻片在避光条件下于室温静置至少2小时，随后使用共聚焦显微镜以20倍放大倍数进行成像。如需采用不同共聚焦采集方法对类肠体进行显微观察，请参考Lallemant等人的研究。37.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光定量 
	注意：本方法通过 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）去除背景信号，从而计算校正后的总荧光强度。
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中打开共聚焦图像，并使用感兴趣区域（ROI）工具勾画目标区域。</li>
		<li>通过导航至设置用户自定义参数 分析 &#62; 设置测量参数选择 面积 &#62; 积分密度 &#62; 平均灰度值 在“设置”选项卡下。</li>
		<li>导航至 分析 &#62; 测量将出现一个包含测量结果的弹出窗口。复制这些测量结果并粘贴到电子表格中。</li>
		<li>为减去背景信号，选择图像中一个较小的非荧光区域。导航至 分析 &#62; 测量 该区域的测量结果将显示在弹出窗口中。将输出结果复制并粘贴到电子表格中。</li>
		<li>将所选细胞的面积乘以背景荧光读数的平均值，再从积分密度中减去该乘积，以计算校正后的细胞总荧光强度（CTCF）。对所有目标图像重复上述步骤，并在电子表格或统计软件中保留记录（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 顶端朝外的类肠隐窝器官芯片细胞活力检测
<ol>
	<li>类器官处理
	<ol>
		<li>建立顶端朝外的类肠隐窝体外模型，培养24小时，步骤同第1步。</li>
		<li>将细胞活力检测试剂在 4 °C 过夜解冻。实验当天，使用前将试剂置于室温平衡 30 分钟。轻轻颠倒混匀试剂。</li>
		<li>进行检测前，从每个孔中移除100 µL培养基，保留剩余的400 µL。向每孔中加入400 µL细胞活力检测试剂。</li>
		<li>在室温下，将平板置于摇床上，以200 rpm剧烈振荡5分钟，充分混匀内容物以诱导细胞裂解。振荡结束后，于室温继续孵育平板25分钟。</li>
		<li>孵育25分钟后，用移液器混匀一个孔中的内容物，将800 µL中的200 µL转移至一块96孔不透明聚苯乙烯透明底板的一个孔中。对剩余的600 µL重复此操作，每个孔生成四个技术重复。以这种方式将24孔板中每孔的剩余内容物全部转移至96孔板中。</li>
		<li>使用能够检测发光的酶标仪，以0.25毫秒积分时间记录数值，并比较不同处理组之间的相对值。或者，将处理组的发光值与三磷酸腺苷（ATP）标准品进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

最近由肠上皮隐窝衍生的肠类器官模型的发展，使得研究更加符合生理相关性 体外 用于研究坏死性小肠结肠炎发病机制的组织。尽管三维肠类器官包含了肠上皮中所有主要的分化细胞类型，但仍存在若干重要局限性。传统的基底侧朝外的三维肠类器官悬浮于三维细胞外基质水凝胶滴中，其成分和密度可能限制组织培养环境中的正常扩散39重要的是，这些肠类器官对细胞的顶面提供的接触机会有限，而顶面正是 体内与管腔内细菌及抗原相互作用，例如肠上皮细胞TLR4与LPS的结合。
尽管坏死性小肠结肠炎（NEC）的病理生理机制尚不明确，但早产儿肠上皮顶端 Toll 样受体 4（TLR4）的表达增加及其活化被认为在其中发挥重要作用40TLR4激活的下游效应包括肠道通透性增加、上皮修复能力下降以及细菌移位，导致肠道屏障功能障碍，进而引起肠道坏死2这一炎症循环被认为起源于早产儿远端肠道的肠腔内，始于肠上皮细胞的顶膜表面。因此，在涉及肠道上皮细菌易位机制研究...

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种发生于高达10%早产儿的小肠严重炎症性疾病，常伴随较高的发病率和死亡率1,2。在极低出生体重（&#60;1500 g）且需外科干预的婴儿中，死亡率接近50%的情况并不少见3。尽管目前尚不完全清楚NEC的确切病因，但已知诸如配方奶喂养等危险因素可能与生理异常（如菌群失调、肠上皮发育不成熟以及肠屏障功能障碍）共同作用，促进疾病的发生2,4。尽管已付出大量努力，过去十年间在NEC的预防和治疗方面进展甚微5。为了深入理解该疾病的发病机制，亟需建立一种研究NEC及相关肠上皮屏障功能障碍的新型体外（in vitro）方法，因为来自动物模型的研究结果迄今未能有效转化为临床应用6。
若干 体外 已利用模型研究坏死性小肠结肠炎（NEC）发生过程中的机制。人肠上皮细胞系 Caco-2 是最常使用的模型之一 体外 坏死性小肠结肠炎模型7,8Caco-2 细胞能够模拟小肠刷状缘的形态特征，但作为一种细胞系，无法分化为多种多样的 体内 细胞类型，包括产生黏液的杯状细胞，这对于构建高可转化性模型至关重要。HT-29-MTX 是人结肠腺癌细胞，具有混合的肠上皮细胞和杯状细胞表型，但仍缺乏基于隐窝的肠上皮细胞类型。9IEC-6 和 IEC-18 是非转化细胞系，具有未成熟的回肠隐窝样形态，但并非来源于人类组织，因此其转化应用能力有限。FHs 74-Int 和 H4 肠道细胞系来源于人胎儿组织，但无法形成紧密连接或极化单层细胞。10,11，因此与即使是早产程度最严重的易感早产儿相比仍属不成熟。通常情况下，NEC 体外 模型利用脂多糖（LPS）处理诱导Toll样受体4（TLR4），后者是坏死性小肠结肠炎（NEC）中启动肠道炎症的主要受体12通过活性氧（ROS）处理（通常使用过氧化氢）介导的损伤常被用于诱导类似坏死性小肠结肠炎的氧化损伤和细胞凋亡13,14作为肠道炎症的主要驱动因子，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症性 TLR4 信号通路的下游组分，也常被用于这些研究中 体外 模型以模拟 在体 发病机制15.
由诱导性多能干细胞（iPSCs）生成的类器官，近年来作为一种 体外 由于其能够重现肠道的复杂性，可作为肠道模型 体内 组织来源的结构与细胞类型组成16,17相关的 体外 类器官系统，肠类器官（enteroids），是由切除的肠隐窝衍生而来的类器官，相较于诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的类器官，其建立和维持更为简便。肠类器官通常在三维（3D）细胞外基质（ECM）中培养，实验操作仅能接触细胞的基底外侧表面。诸如显微注射等方法18,19，已开发出用于克服向顶膜递送的屏障，但管腔内脱落的细胞碎片和黏液的积聚使得显微注射在技术上困难且结果不稳定。由于定制的机器人显微注射平台尚未广泛普及20，实验室之间在技术能力和常规操作上的差异成为显微注射方案中需要克服的重要变量。由解离的三维肠类器官衍生而来的二维（2D）单层细胞，仍包含肠上皮所有主要细胞类型，可暴露顶膜表面，但传统上若无间充质肌成纤维细胞作为饲养层则难以维持培养21尽管可以使用允许细胞培养的通透性支持物来接触类肠体单层的顶膜和基底膜外侧，而无需依赖底层的肌成纤维细胞，但这些插入式培养装置在使用共聚焦显微镜等传统显微技术前，需要对膜进行切割和固定，导致操作过程在技术上更为复杂且困难22已建立NEC模型 体外 使用传统的三维类肠器官23,24,25 和可渗透支持物26,27，最近已利用肠道芯片模型成功复制了肠道炎症28,29尽管整合了微流控技术的“芯片上肠道”模型目前是最先进且最具转化潜力的模型，但该技术成本高昂、操作复杂，大多数研究人员难以获取。30.
近年来，外翻类肠体技术的进步使得更便捷地接触三维类肠体的顶膜表面成为可能，同时避免了对其结构完整性的损害 体外 上皮31,32,33. 顶端朝外的类肠体具有与肠道相似的细胞类型组成和屏障功能 体内 肠上皮，但与典型的三维类肠体不同，这些细胞的顶面朝向培养基，从而更有利于开展与营养吸收、微生物感染及管腔分泌等生理过程相关的研究31顶点朝外型肠类器官的另一个优势是&#160;能够将实验试剂均匀地分布到类肠体中。与显微注射不同，该方法无需根据类肠体大小调整加样体积，且类肠体可在悬浮培养中维持，从而避免了细胞外基质对实验试剂扩散的干扰32.
坏死性小肠结肠炎是一种多因素疾病，涉及多种肠上皮细胞类型以及多种环境和病理生理因素34肠道类器官具有多样化的细胞组成，相较于单层细胞培养，在模拟坏死性小肠结肠炎等复杂疾病方面具有明显优势。有趣的是，单次炎症刺激通常已足以诱导损伤发生 体外 单培养，肠类器官，与小鼠模型相同23，似乎需要至少两种炎症成分才能诱导出类似坏死性小肠结肠炎的损伤6在此，我们介绍一种采用顶膜朝外的肠类器官结合缺氧条件（坏死性小肠结肠炎的重要临床特征）构建的顶膜朝外的坏死性小肠结肠炎（NEC）体外模型6）以及LPS或TNF-α，作为一种改进且更具生理相关性的方法 体外 用于研究上皮细胞对类似坏死性小肠结肠炎（NEC）炎症的反应，并可能识别潜在治疗靶点。我们描述了一种逆转小肠三维类肠体极性的实验方案，以及一种免疫荧光染色方案，用于检测上皮屏障破坏和连接蛋白表达的变化。最后，我们进一步展示了一种简单的类肠体活力检测方法，以评估我们建立的“双打击、顶膜外翻”类肠体NEC体外模型的影响。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形管</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低吸附24孔细胞培养板</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 mm x 60 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔IgG抗体，Cy3偶联物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>含15 mM HEPES缓冲液的杜尔贝科改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养混合物（DMEM-F12）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>E-cadherin 抗体 (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液，缓冲，pH 6.9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult 类器官生长培养基（人源）</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌O111:B4脂多糖，经凝胶过滤色谱法纯化</td><td>默克生命科学</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96孔，Nunclon Delta表面处理，平底微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲盐水），1×，无钙、无镁，pH 7.4</td><td>康宁</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>含NucBlue的长效玻璃抗荧光淬灭封片剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>重组抗Villin抗体[SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>重组人TNF-&amp;alpha; 蛋白 100 &amp;micro;g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma II 系列水套式三气培养箱，184 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>碘化TO-PRO-3（642/661）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL平盖管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种影响早产儿的严重疾病，其特征为肠道炎症和坏死。近年来，肠类器官（enteroids）已成为模拟胃肠道病理过程的有前景体系。然而，目前常用的肠类器官操作方法，或无法接触上皮顶端表面（三维[3D]培养），或耗时且资源消耗大（二维[2D]单层培养）。这些方法通常还需额外步骤（如显微注射），才能使模型具备生理可转化性。本文介绍一种生理相关性强且成本低廉的研究NEC的方案 体外 通过逆转类肠体的极性，使其顶膜朝外（顶膜外翻）。本文还提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测在常氧或低氧条件下暴露于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或脂多糖（LPS）后类肠体屏障完整性和连接蛋白的表达情况。同时评估了三维顶膜外翻类肠体在常氧或低氧条件下经LPS或TNF-α处理24小时后的细胞活力。结果显示，无论暴露于LPS或TNF-α，并联合低氧处理的类肠体均表现出上皮结构破坏、黏附连接蛋白表达减少以及细胞活力下降。本方案描述了一种新型的“体外坏死性小肠结肠炎（NEC）模型”——顶膜外翻类肠体模型，该模型提供了一个生理相关性强且成本较低的平台，可用于识别NEC治疗中潜在的上皮靶点，并研究早产肠道对治疗药物的反应。

利用类肠体建模肠道炎症，即使在坏死性小肠结肠炎背景下，现已成为常见做法。然而，目前大多数常用方法要么无法接触类肠体的顶膜表面，从而削弱了旨在最终作为口服治疗药物使用的化合物的生理相关性；要么在技术上较为困难且耗时，例如类肠体衍生的单层细胞模型。为提高现有方法的实用性 体外 NEC类肠类器官模型中，我们逆转了肠类器官的极性，并结合24小时低氧及LPS或TNF-α处理，构建了一种顶膜朝外的“类器官内NEC”模型。免疫荧光染色证实细胞核（蓝色）朝向腔侧顶膜定位，并检测到villin的表达32 （红色，顶端标记物）位于上皮组织的外边缘（图1A）。暴露于 200 µg/mL LPS、50 ng/mL TNF-α 或单独缺氧均未引起细胞整体形态或E-cadherin的明显变化38 （绿色），或与对照组相比的villin定位或荧光强度图1A-D;<str...

本方案描述了一种利用极性反转的小肠类器官构建的“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎（NEC）”模型，该模型为顶膜外翻型，可直接接触顶膜表面。我们提供了一种免疫荧光染色方案，用于检测与坏死性小肠结肠炎相关的上皮结构破坏，并介绍了一种评估在“类器官培养皿中的坏死性小肠结肠炎”模型处理后顶膜外翻类器官存活率的方法。

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种影响早产儿的严重疾病，其特征为肠道炎症和坏死。类肠器官（enteroids）已……

本方案描述了首个在培养皿中构建的顶膜朝外的类肠模型，相较于传统的基底侧朝外的类肠模型，在建立用于口服药物潜在治疗效果的体外模型方面具有关键性改进。该方法可直接接触类肠结构的顶膜表面，化合物可被添加至细胞培养基中，并像在体内一样从顶膜侧被吸收。对于希望建立体外肠道炎症系统以测试潜在口服治疗药物的研究人员而言，该技术可能尤为有用。来自不同年龄和物种的组织可能需要进一步标准化。因此，在建立极性反转时间时，可能需要纳入患者样本。为逆转3D类肠器官的极性，从已建立的3D基底外侧朝外类肠器官的24孔板各孔中吸出培养基。向24孔板的每个孔中加入500微升5毫摩尔的冰冻EDTA或PBS，并使用P200移液器上下吹打5至6次，轻柔地机械破坏基底膜提取物或细胞外基质圆顶结构。将四个孔的内容物转移至一个15毫升离心管中。然后向管中加入 8 mL 冰冷的 EDTA/PBS。以相同方式转移剩余的 20 个孔。将试管置于 4 °C 条件下，在旋转平台或摇床上以 330 RPM 转速孵育 1 小时。孵育后，将各管离心并弃去上清液。用5毫升DMEM/F12培养基合并并洗涤沉淀。然后离心细胞悬液，弃去上清液，再向管中加入12毫升无抗生素培养基，确保充分重悬细胞沉淀。将500微升类肠体悬液移液至24孔超低吸附培养板的每孔中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养2至5天，或直至类肠体完成极性翻转。在第1天禁食时，将24孔板中4个孔的内容物转移至1.5毫升微量离心管中。对每种处理分别使用单独的离心管，重复上述步骤至所有目标孔。离心后，将沉淀物重悬于300 µL 4% 多聚甲醛固定液中，室温下孵育。30分钟后，用500 µL PBS洗涤沉淀物。向试管中加入 500 µL 的 0.1% Triton X-100。在室温下孵育试管 1 小时。接着，将试管置于 2–8 °C 条件下，在 200 RPM 的旋转摇床或振荡器上放置 15 分钟。最后一次孵育后，加入500微升含10% NDS的PBS T溶液，在室温下孵育45分钟。孵育期间，配制一抗溶液。次日，根据沉淀物的大小，向各管中加入250至500微升PBS T溶液，并在2至8摄氏度条件下，以200 RPM的速度在旋转仪或摇床上孵育1小时。加入200微升二抗溶液，将离心管置于2至8摄氏度避光孵育。次日，通过离心离心管并去除100微升上清液，开始进行染色后顶段外翻类肠体的封片。将细胞重悬于剩余的100微升上清液中，并将细胞悬液转移至500微升离心管中。将离心管放入小型离心机中离心20秒。弃去上清液，并将沉淀重悬于100 µL室温的远红核酸染料中。孵育20分钟后，离心细胞，并将沉淀重悬于100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）中。第二次洗涤和离心后，移除70微升上清液，并将沉淀物重悬于剩余的PBS体积中。然后将细胞悬液转移至已标记的24 mm × 60 mm盖玻片上。直接将75微升封片剂滴加到样本上，并用移液器吸头去除任何气泡。在避光条件下过夜固化后，将一层薄薄的甘油涂抹于盖玻片上，然后将盖玻片封片至载玻片上，并轻轻按压使其就位。轻敲以去除盖玻片与载玻片之间的气泡。在暗处室温下静置两小时后，使用共聚焦显微镜以20倍放大倍数对类肠体进行成像。对于类肠器官处理，按照文稿中所述方法，在培养皿模型中建立顶端朝外的坏死性小肠结肠炎，持续24小时。在进行检测前，从每个孔中移除100微升培养基，保留剩余的400微升。向每个孔中加入400微升细胞活力检测试剂。将平板置于摇床中，以200 RPM剧烈振荡5分钟，以诱导细胞裂解。随后，取200微升样品加入96孔透明底板的一个孔中。对剩余的600微升样品重复此操作，每孔制备四个技术重复。使用具备发光检测功能的酶标仪，以0.25毫秒积分时间记录数值，并比较不同处理组之间的相对值。对照组的代表性免疫荧光染色结果显示，细胞核位于顶端并朝向管腔，且在上皮外缘可检测到villain蛋白。与对照组相比，单独暴露于脂多糖、肿瘤坏死因子α或缺氧条件均未引起细胞总体形态、E-钙黏蛋白或villain蛋白定位或荧光强度的明显改变。在常氧或低氧条件下，脂多糖或肿瘤坏死因子α与低氧联合处理会破坏肠上皮结构，并显著导致黏附连接和刷状缘蛋白表达的丧失，这通过E-cadherin染色和villin染色的减弱得以证实。在常氧条件下，与对照组相比，脂多糖或肿瘤坏死因子α对类肠器官的顶端外细胞活力无显著影响。然而，与单独缺氧相比，脂多糖或肿瘤坏死因子α联合缺氧处理时，细胞活力显著降低。在建立顶膜外翻的“在培养皿中”模型时，请记住将EDTA保持在冰上低温的细胞悬液中。这将增强极性反转，并确保所有细胞外基质充分液化并被彻底清除。还可进一步开展其他下游应用，如qPCR、RNA-seq、蛋白质印迹或屏障通透性的功能评估，以表征缺氧条件下对炎症信号的响应。

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体外 坏死性小肠结肠炎的顶端出肠样模型

本视频展示了在人源性新生儿肠类器官模型中，通过脂多糖处理诱导坏死性小肠结肠炎疾病的发生过程。该模型有助于研究肠道病理生理学。...

人肠上皮类器官模型中坏死性小肠结肠炎的诱导

类肠器官正在成为研究人类疾病的一种新型模型。本方案描述了如何利用从新生儿组织获得的类肠器官，通过脂多糖（LPS）处理来模拟人类坏死性小肠结肠炎的类肠器官模型。所获得的类肠器官表现出类似于人类坏死性小肠结肠炎的炎症变化。...

一种新型的人类上皮类肠体坏死性小肠结肠炎模型

坏死性小肠结肠炎（NEC）是最严重的胃肠道（GI）疾病，常发生于早产儿，尤其是极低出生体重儿，具有高死亡率且发病机制尚不明确。NEC的病因可能与炎症性免疫调节系统异常有关。建立NEC动物模型是研究NEC疾病免疫机制不可或缺的工具。目前NEC动物模型通常采用C57BL/6J新生小鼠；而BALB/c新生小鼠则较少被使用。相关研究表明，小鼠感染时，与C57BL/6J小鼠相比，BALB/c小鼠更倾向于Th2细胞分化。已有研究提示，NEC的发生与发展与辅助性T细胞2型（Th2）细胞的增加相关，并常伴随感染。因此，本研究采用新生BALB/c小鼠建立NEC模型，该模型具有与NEC患儿相似的临床特征和肠道病理改变。尚需进一步研究以明确该动物模型是否可用于NEC中Th2细胞应答的研究。...

一种新生BALB/c小鼠的坏死性小肠结肠炎模型

本方案描述了一种在源自非人灵长类动物回肠类器官的二维（2D）单层细胞上建立并实施划痕伤口实验的方法。...

35 kDa 透明质酸对...的影响 体外 使用类肠体衍生的单层细胞建立早产小肠损伤与修复模型

本方案详细描述了从胎儿肠道组织建立类肠体（enteroid）这一三维肠道模型的过程。采用上皮生物标志物的免疫荧光成像对模型进行了表征。通过显微注射技术将细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide）施加于上皮顶端，可诱导上皮通透性增加，其程度呈剂量依赖性，并通过荧光标记葡聚糖的渗漏情况进行测定。...

检测胎儿组织来源类肠体的上皮通透性

本实验方案介绍了一种利用顶端朝外的肠类器官模型中荧光黄染料测定肠道通透性的方法。该方法可用于评估模拟坏死性小肠结肠炎等炎症性肠病的肠类器官的细胞旁通透性。...

利用荧光素黄在顶膜外翻肠类器官模型中测定肠道通透性

大肠杆菌 导致新生儿在出生前后摄入该细菌后发生败血症。所涉及的过程包括 E. coli的 从肠道进入血液的能力尚不明确。 体外 模型评估了……的能力 E.

新生儿肠道转胞吞作用的评估 大肠杆菌 菌血症分离株

本方案描述了一种 体外 坏死性小肠结肠炎（NEC）模型，可用于疾病发病机制的机制性研究。该模型采用微流控芯片，芯片中接种了来源于人类新生儿肠道的肠类器官、内皮细胞以及一名重症NEC新生儿的肠道微生物组。...

结合人类新生儿肠类器官与失调微生物组的坏死性小肠结肠炎微流控模型

本方案概述了一种坏死性小肠结肠炎（NEC）的新生小鼠模型，以及随后从新生小鼠小肠固有层中分离免疫细胞的方法。...

一种用于免疫细胞分析的坏死性小肠结肠炎新生小鼠模型及固有层分离方法

干细胞移植在一种 体外 模拟缺血/再灌注模型

了解顶端朝外肠样模型用于坏死性小肠结肠炎的体外研究方法。该技术通过反转极性实现顶端表面暴露，支持口服药物测试，为肠道炎症研究提供新型平台。

体外顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

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体外 顶端朝外的肠类器官坏死性小肠结肠炎模型

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