Name: 用于评估COVID-19相关中耳病变的高速人颞骨切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: 了解使用双金刚石刀片微型锯进行人颞骨快速切片的技术，用于COVID-19相关中耳病变的病理学研究。该方法将处理时间从9至10个月缩短至10至14天，实现耳病理学的快速评估。

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感谢 Mohamed Lehar 在本项目中的协助。本研究部分由美国国立卫生研究院（T32DC000027，NSA）资助。

本方案已获得机构审查委员会（IRB00250002）批准，并遵循机构关于使用人体组织和传染性材料的政策。每位颞骨捐献者均在生前签署书面同意书，或由其家属在捐献者去世后获得同意。有关本方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 颞骨采集
<ol>
	<li>在使用本方案前，需获得当地机构审查委员会（IRB）的批准，查阅机构关于使用人体组织和传染性材料的政策，并取得组织捐献的知情同意。</li>
	<li>在处理来自 COVID-19 阳性颞骨捐献者的组织前，应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。确保 PPE 包括 N-95 呼吸器和面罩（或 alternatively 使用正压空气净化系统）、防护服以及两副手套。在开始本方案前，应复习正确穿戴和脱卸 PPE 的技术10。</li>
	<li>在捐献者死亡后 12–24 小时内获取颞骨组织。若尸体未冷藏，应确保在死亡后 8 小时内完成取材。
	<ol>
		<li>在尸检过程中，使用骨凿采用四切口整块法获取颞骨7。
		<ol>
			<li>开颅后，移除脑组织，并锐性切断至内听道的脑神经。</li>
			<li>使用骨凿在鳞部颞骨的平行位置且略偏内侧处进行第一处骨切口。</li>
			<li>在颞骨内侧边缘处，与第一切口平行进行第二处骨切口。</li>
			<li>然后，在岩嵴前方 3–4 cm 处，与岩嵴平行进行第三处切口。</li>
			<li>第四处切口大致与第三切口平行，位于岩嵴后方约 2 cm 处。 
			注意：确保所有切口均穿透颅底。</li>
			<li>随后，通过锐性解剖分离标本下缘的软组织附着，取出颞骨。若在获取颞骨后需进行尸体灌注固定，应结扎颈动脉残端。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 组织固定、脱钙与切片
<ol>
	<li>立即将组织置于 200–300 mL 的 10% 缓冲福尔马林（甲醛）溶液中，确保组织完全浸没。在室温下固定组织至少 72 小时，每天更换一次溶液。将组织储存在密闭容器中，并在通风橱内佩戴适当的个人防护装备（PPE）进行溶液更换，以防止病毒扩散。 
	注意：经过 72 小时固定后，标本不再具有传染性。</li>
	<li>使用带有双金刚石刀片的精密微切锯，将每个标本切成三个&#34;厚&#34;切片，以加快组织脱钙速度。将双金刚石刀片间距设置为 5 mm，使颞骨中央部分切片厚度为 5 mm。确保两端组织切片厚度为 3–5 mm。</li>
	<li>将厚切片置于 200–300 mL 的 23% w/w 甲酸脱钙液中，在室温下处理 7–10 天，直至组织足够柔软以进行石蜡包埋。每天更换一次溶液。通过触诊标本检查脱钙是否充分，标本应感觉柔软。 
	注意：也可通过 X 射线验证脱钙效果。</li>
	<li>将标本置于流水下冲洗 24 小时，方法是将其放入大烧杯中，并置于持续流动的水龙头下。</li>
	<li>使用浓度递增的系列酒精对组织进行脱水7。将组织浸入 100–200 mL 的 70% 乙醇中 1.5 小时，随后分别用 95% 和 100% 乙醇各清洗三次，每次 1.5 小时。接着用二甲苯清洗 3 次，每次 1.5 小时。</li>
	<li>将厚切片进行石蜡包埋，共处理四次，每次 45 分钟。</li>
	<li>使用切片机切割薄切片（10 µm）。调整组织位置，使其沿轴向切片。如需要，可切割较厚切片（20 µm）。</li>
</ol>
3. 免疫组织化学与成像
<ol>
	<li>如果需要进行传统的苏木精-伊红染色（本文未描述），应在将切片贴附到载玻片之前完成染色7。</li>
	<li>将切片贴附于带正电荷的玻璃载玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于60 °C的加热板上烘烤20分钟。</li>
	<li>将载玻片放入支架中，并浸入含有有机溶剂（本实验中为二乙醇胺）和乙醇的商用预处理液中，以进行脱蜡、再水化及抗原修复。 
	注意：此步骤对于福尔马林固定石蜡包埋组织的免疫组织化学获得满意结果是必要的。</li>
	<li>将载玻片置于高压锅中，在高压力下加热20分钟。</li>
	<li>将载玻片置于湿化孵育盒中，使用商用封闭液对组织进行封闭处理。</li>
	<li>使用针对血管紧张素转换酶2（ACE2；1:50）、跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2，1:1,000）以及弗林蛋白酶（Furin，1:250）的一抗孵育组织切片。 
	注意：选用ACE2、TMPRSS2和Furin抗体是因为这些蛋白被认为在SARS-CoV-2感染性中发挥作用11,12，本方案旨在探讨SARS-CoV-2可能感染中耳的潜在机制13。</li>
	<li>使用HRP标记的抗兔二抗（ACE2、Furin；1:100稀释）或抗山羊二抗（TMPRSS2；1:100稀释）进行孵育。</li>
	<li>用70%水溶性苏木精对切片进行复染。</li>
	<li>使用配备数字相机的光学显微镜采集图像。分别以20倍和10倍放大倍数获取中耳黏膜和咽鼓管的图像。</li>
</ol>

<ol><li>Nogueira, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+otorhinolaryngology%3A+Otology%2C+laryngology+and+rhinology%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology.</a> Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).</li>
<li>Pappas, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otology+through+the+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Otology through the ages.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).</li>
<li>Schuknecht, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology%3A+The+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Auris+Nasus+Larynx%22%5BJournal%5D)">Otopathology: The past, present, and future.</a> Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).</li>
<li>Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otopathology+in+the+United+States%3A+History%2C+current+situation%2C+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives.</a> Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).</li>
<li>Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pathology+of+high-tone+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nervous+and+Mental+Disease%22%5BJournal%5D)">Observations on the pathology of high-tone deafness.</a> Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480(1934).</li>
<li>Andresen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+presbycusis+from+the+first+temporal+bone+laboratory+within+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States.</a> Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).</li>
<li>Schuknecht, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchuknecht%2C+H+%22Pathology+of+the+Ear%22">Pathology of the Ear</a>. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).</li>
<li>Chole, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labs+in+crisis%3A+Protecting+the+science--and+art--of+otopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Otology+%26+Neurotology%22%5BJournal%5D)">Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology.</a> Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).</li>
<li>Nager, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNager%2C+GT+%22Pathology+of+the+Ear+and+Temporal+Bone%22">Pathology of the Ear and Temporal Bone</a>. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).</li>
<li>COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html">https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html</a> (2022).</li>
<li>Essalmani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+roles+of+Furin+and+TMPRSS2+in+SARS-CoV-2+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity.</a> Journal of Virology. 96 (8), 0012822(2022).</li>
<li>Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2%2C+TMPRSS2%2C+and+Furin+expression+in+the+nose+and+olfactory+bulb+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rhinology%22%5BJournal%5D)">ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans.</a> Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).</li>
<li>Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+virus+isolated+from+the+mastoid+and+middle+ear%3A+Implications+for+COVID-19+precautions+during+ear+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Otolaryngology+-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery.</a> JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).</li>
<li>Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+decalcification+of+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Microwave decalcification of human temporal bones.</a> Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).</li>
<li>Stephenson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+location+of+Na%2B%2C+K%2B-ATPase+%CE%B11+subunit+in+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear.</a> Hearing Research. 400, 108113(2021).</li>
<li>McCall, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralabyrinthine+manifestations+of+DFNA9%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Extralabyrinthine manifestations of DFNA9.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).</li>
<li>Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+hearing+loss+is+dominated+by+damage+to+inner+ear+sensory+cells%2C+not+the+cellular+battery+that+powers+them%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them.</a> The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).</li>
<li>Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+26+immunohistochemistry+in+temporal+bones+with+cochlear+otosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+%26+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis.</a> Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).</li>
<li>Lopez, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+techniques+for+the+human+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical techniques for the human inner ear.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

人类颞骨研究对于探讨中耳和内耳病理至关重要，但该研究仍耗时且耗费资源。本文介绍了一种利用金刚石微锯制备较厚颞骨切片的技术，该切片可在进一步切片前快速脱钙，从而使组织从获取到研究的时间由9至10个月缩短至10至14天。该技术可能减少颞骨处理所需的资源，并促进对时间敏感的研究，例如与新型冠状病毒（COVID-19）相关的中耳和内耳病理研究13，这正是开发本实验方案的动因。本方案实现了对中耳和咽鼓管内ACE2、TMPRSS2和Furin表达的可视化，揭示了SARS-CoV-2可能通过咽鼓管从鼻咽部传播进而感染中耳的潜在机制。
本方案的主要创新之处在于使用金刚石锯在脱钙前对组织进行切割，从而产生&#34;较厚&#34;的颞骨切片，通过增加组织暴露于脱钙剂的表面积，可实现快速脱钙。该步骤使组织脱钙时间缩短至7–10天，而传统方案通常需要1–2个月才能完成脱钙。使用金刚石锯制备的&#34;较厚&#34;组织切片也比标准的颞骨组织块脱水更快，从而缩短了脱钙与包埋之间的时间。此外，本方案采用石蜡作为包埋介质，而非需要约3个月才能硬化的火棉胶<sup ...

人类颞骨研究为探索中耳和内耳的病理学及病理生理学提供了宝贵的资源。在19世纪之前，人们对耳科疾病知之甚少。1,2,3更好地理解耳科疾病以及 &#34;将耳科手术从庸医手中拯救出来&#34; 约瑟夫·图恩比（Joseph Toynbee，1815–1866）开发了研究人颞骨组织学切片的方法3这项工作在19世纪后期由维也纳的亚当·波利策（Adam Politzer，1835–1920）及欧洲其他地区的学者进一步推进，他们利用颞骨切片描述了多种常见耳部疾病的组织病理学特征2,3,4.
美国首个用于人类颞骨研究的实验室于1927年在约翰斯·霍普金斯医院成立，斯泰西·吉尔德（Stacy Guild，1890–1966）在此建立了颞骨切片技术5,6。吉尔德所建立的方法包括死后取材、固定、硝酸脱钙、乙醇脱水、火棉胶包埋、切片、染色和封片，整个过程持续9至10个月。此后，哈罗德·舒克内希特（Harold Schuknecht，1917–1996）对该技术进行了改进7；然而，该流程的基本步骤至今仍基本保持不变。
维持颞骨实验室所需的大量资源给颞骨研究带来了挑战，这可能是过去30年来该领域研究热度下降的重要原因4,8。颞骨实验室的大量资源必须投入到长达9至10个月的颞骨制备过程中。其中最耗时的步骤之一是脱钙，因为颞骨是人体中最致密的骨骼。脱钙通常使用硝酸或乙二胺四乙酸（EDTA）进行，耗时数周至数月，并需频繁更换溶液7,9。此外，对于时效性较强的人耳研究（例如与COVID-19大流行相关的研究），这一缓慢的制备过程可能构成阻碍。本文介绍了一种高速颞骨切片技术，该技术使用金刚石微锯切割出较厚的切片，可在颞骨获取后的10至14天内实现快速脱钙和组织学分析。

<table><tbody><tr><td>抗ACE-2抗体（1:50稀释）</td><td>Novus Biologicals</td><td>SN0754</td><td></td></tr><tr><td>抗Furin抗体（1:250稀释）</td><td>Abcam</td><td>EPR 14674</td><td></td></tr><tr><td>抗TMPRSS2抗体（1:1,000稀释）</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20984</td><td></td></tr><tr><td>BX43手动系统显微镜</td><td>Olympus Life Science Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBN/金刚石复合切片刀片</td><td>Pace Technologies</td><td>WB-007GP</td><td></td></tr><tr><td>Collin骨锤 - 8英寸</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1517</td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi3显微镜相机</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双重内源性酶阻断剂（商用封闭液）</td><td>Dako</td><td>S2003</td><td></td></tr><tr><td>伊红染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>548-24-3</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液（10%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Formical-4脱钙剂（甲酸脱钙液）</td><td>StatLab</td><td>1214-1 GAL</td><td></td></tr><tr><td>苏木精染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的抗兔二抗（1:100稀释）</td><td>Leica Biosystems</td><td>PV6119</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS HRP马抗山羊IgG检测试剂盒，过氧化物酶（1:100稀释）</td><td>Vector Laboratories</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>Lambotte骨刀</td><td>Surgical Mart</td><td>SM1553</td><td></td></tr><tr><td>金相PICO 155P精密切割锯</td><td>Pace Technologies</td><td>PICO 155P</td><td>microsaw</td></tr><tr><td>NIS Elements软件版本4.6</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>paraffin</td></tr><tr><td>带白色磨砂端的正电荷载玻片</td><td>Walter Products</td><td>1140B15</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Shandon Crytome FSE冷冻切片机</td><td>New Life Scientific Inc.</td><td>A78900104</td><td>cryotome</td></tr><tr><td>Triology预处理溶液（商用预处理液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>920P-05</td><td></td></tr></tbody></table>

用于评估与 covid-19 相关中耳病变的高速人颞骨切片技术

High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology

人颞骨切片的组织病理学分析是研究中耳和内耳病理学的基本技术。颞骨切片的制备包括死后获取颞骨、固定、脱钙、包埋和染色等步骤。由于颞骨密度较高，脱钙过程耗时且资源消耗大；完整的组织制备平均可能需要9至10个月。这会延缓耳病理学研究，并阻碍对时间敏感的研究，例如与新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行相关的研究。本文介绍一种快速制备和脱钙颞骨切片的技术，以加快组织处理进程。
采用标准技术在死后获取颞骨，并用10%福尔马林固定。使用带有双金刚石刀片的精密微型锯将每个样本切成三个较厚的切片。将较厚的颞骨切片在脱钙液中脱钙7-10天，随后包埋于石蜡中，用冷冻切片机切成薄片（10 µm），并贴附于未带电荷的载玻片上。组织样本随后进行脱蜡和再水化处理，用于抗体染色（ACE2、TMPRSS2、Furin）并成像。该技术将从取材到组织分析的时间由9-10个月缩短至10-14天。高速颞骨切片技术可加快耳病理学研究速度，减少组织制备所需的资源，同时有助于开展时间敏感性研究，例如与COVID-19相关的研究。

中耳黏膜和咽鼓管的苏木精-伊红染色显示，经过处理后中耳黏膜及黏膜下组织结构得以保留（图1）。免疫组织化学图像显示，中耳黏膜和咽鼓管中存在ACE2、TMPRSS2和Furin蛋白的表达（图1）。这些蛋白在中耳内的存在提示了SARS-CoV-2可能通过此途径感染中耳呼吸上皮11,12,13。此外，这些蛋白在咽鼓管中的表达可能解释了病毒经由鼻咽部通过咽鼓管进入中耳的途径。
<img alt="组织学染色分析；H&amp;E、ACE2、TMPRSS2、Furin；组织切片；显微镜结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64012/64012fig01.jpg" data-al...

本文介绍了一种利用带有双金刚石刀片的微型锯对人颞骨进行快速切片的技术，可制备出薄切片，用于快速脱钙及颞骨免疫组织化学分析。

用于评估与 COVID-19 相关中耳病变的高速人颞骨切片技术

人类颞骨切片的组织病理学分析是研究中耳和内耳病理学的基本技术。颞骨切片……

该方案将颞骨处理的时间从9到10个月缩短至10到14天。该技术的主要优势在于能够快速评估耳部病理变化，在本研究中尤其适用于评估与COVID-19相关的中耳病变。该技术可能对时间敏感的颞骨研究具有重要帮助。未来，该方法可能进一步优化，用于内耳病理学的研究。在尸检过程中开始获取组织，将颅神经锐性分离至内听道。使用骨凿进行第一处骨性切口，切口方向与颞骨鳞部平行且紧邻其内侧。然后，在颞骨内侧缘处，平行于第一处骨切口进行第二次骨切口。在岩嵴前方3至4厘米处，平行于岩嵴做第三处切口。接着，在岩嵴后方约2厘米处，平行于第三处切口做第四处切口。使用锐性分离技术游离标本下缘附着的软组织，并去除颞骨。取材后，立即将组织浸入 200 至 300 毫升的 10% 缓冲福尔马林溶液中。随后，将配备双金刚石刀片的精密微型锯调节至 5 毫米的间距。为快速进行组织脱钙，将每个标本切成三个部分，使颞骨的中央部分厚约5毫米，两端部分厚3至5毫米。将组织块置于200至300毫升的0.37摩尔EDTA溶液中，在室温下放置7至10天以软化组织。中耳黏膜和咽鼓管的苏木精-伊红染色显示，采用本方案处理后组织得以良好保存。免疫组织化学分析显示，这些组织中存在ACE2、跨膜丝氨酸蛋白酶和弗林蛋白酶，这为SARS-CoV2在中耳呼吸上皮中的感染提供了可能的途径。将颞骨组织正确地放置在金刚石锯中至关重要。可与此方法结合使用的其他技术包括针对不同蛋白质的免疫组织化学、不同的组织染色方法以及转录组学。该技术使我们能够在 COVID-19 大流行期间快速评估中耳内是否存在参与 SARS-CoV-2 感染的蛋白质。

high-speed-human-temporal-bone-sectioning-for-assessment-covid-19

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

用于评估COVID-19相关中耳病变的高速人颞骨切片

本文描述了一种简单的振动切片机切取耳蜗柯蒂器官组织，随后进行免疫组织化学染色和共聚焦显微镜观察的实验方法。该方法可更好地保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官精细的细胞结构，从而实现对不同类型细胞的准确定量分析。...

用于增强保存哺乳动物耳蜗柯蒂器官细胞结构的振动切片法

存在多种将耳毒性物质导入动物模型耳蜗的方法。本文介绍了一种通过圆窗龛递送耳毒性物质的手术方案。该方法具有良好的可靠性，可产生靶向的耳蜗内损伤，同时避免对微细结构造成机械性损伤。此外，可进一步用于研究耳蜗的自我修复与再生能力。...

小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

我们介绍了一种分离成年耳蜗柯蒂器官的方法，可获得完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作步骤。结合这些技术，可对耳蜗中的毛细胞、支持细胞及其他细胞类型进行研究。...

成年小鼠耳蜗的全组织解剖与免疫荧光染色

我们介绍一种从新生小鼠中分离听泡、耳囊及听小骨以进行整体封片和组织学分析的实验方案。...

出生后小鼠听泡的解剖：中耳听小骨的分离与组织学分析

本文的目的是介绍完全内镜下尸体中耳解剖的操作方法，并旨在提供一份全面的内镜中耳解剖学指南。...

经耳道内镜耳科手术探查中耳解剖：解剖操作手册

本实验方案的目的是展示一种有效的方法，用于对小鼠耳蜗进行脱细胞和脱钙处理，以制备可用于组织工程应用的支架材料。...

小鼠耳蜗脱细胞方案在内耳组织工程中的应用

为了确保原发性纤毛运动障碍（PCD）诊断中纤毛功能分析的成功与高质量，必须采用精确且谨慎的呼吸道上皮取样与处理方法。为在新冠疫情期间持续提供PCD诊断服务，纤毛视频显微镜检测方案已更新，纳入了适当的感染控制措施。...

鼻腔刷取采样及利用数字高速纤毛视频显微镜进行处理——针对新冠疫情的适应性改进

本文介绍了一种通过钻除法从尸体颞骨中提取人耳蜗的可靠方法，该方法遵循明确的解剖学标志进行操作。...

从人颞骨中提取耳蜗：一种尸体解剖方案

本文介绍了一种从小鼠中分离和培养原代耳蜗毛细胞的详细方案。首先，在显微镜下从新生小鼠（3-5日龄）耳蜗中分离出柯蒂氏器。随后，通过酶消化法将组织解离为单细胞悬液，并在培养数天后通过免疫荧光鉴定细胞。...

新生小鼠耳蜗毛细胞的分离与原代培养

本文介绍了一种在迷路切除术期间于生理条件下获取人类前庭终器并利用免疫染色对其进行分析的技术。...

在迷路切除术期间生理条件下前庭终器的获取

了解使用双金刚石刀片微型锯进行人颞骨快速切片的技术，用于COVID-19相关中耳病变的病理学研究。该方法将处理时间从9至10个月缩短至10至14天，实现耳病理学的快速评估。

用于评估与 COVID-19 相关中耳病变的高速人颞骨切片技术

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