单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

对细胞外囊泡（EVs）进行深入表征具有挑战性，通常需要多种仪器分别描述各个参数。而采用纳米流式细胞术等单一技术即可同时描述多个EV亚群，从而对每个EV进行单独测量，在确定其荧光特性之前，无需标记即可识别直径大于14纳米的颗粒。

这可以通过去除假阳性结果来获得稳健的数据集。纳米流式细胞术可应用于多种来源的细胞外囊泡（EVs）分析，包括从血浆、脑脊液和培养基中富集的囊泡。该技术还可用于病毒、脂质纳米颗粒以及纳米材料的分析。

优化标记方案至关重要，这可以最大限度地提高与颗粒相关的荧光信号，同时减少缓冲液中残留的背景荧光。首先，打开仪器，启动 Nano-Flow Profession 软件，从鞘流菜单中选择“启动”，将水加入加载舱，然后从鞘流菜单中选择“增压”。

将质控微球用去离子水按1:100稀释于0.6微升离心管中，并将其放入加样舱以将样品引入系统。随后按照之前演示的方法推动样品45秒，以完全替换之前的样品、水或清洗液。在推动过程中，将激光功率设置为质控微球预设模板中的250纳米荧光质控标准。

随后，为降低系统压力，从同一下拉菜单中选择采样压力，并将自动采样压力设置为1千帕，以维持恒定压力。然后，在采集控制中选择“记录时间”，启动一分钟的分析。数据将绘制在点图上，横坐标显示侧向散射光强度的对数刻度，纵坐标显示选定的荧光强度。

保存文件前，输入文件名和样品稀释倍数。接着，选择“卸载”以将试管从装载舱中取出。用150 µL清洗液替换质控微珠，并通过选择“增强”清洗超过30秒。

使用含有150微升水的离心管，通过将毛细管尖端浸入水中以去除毛细管尖端上多余的清洗液。然后将尺寸标准微珠按1:100的比例用水稀释，并将100微升稀释液加入上样孔中。接着，将激光功率设置为预设模板S16 EXO 68至155纳米。

此设置适用于大小标准品以及含有小于200纳米EV的样品。选择采样并记录样品一分钟。第三次测量使用水或PBS样品进行，以创建空白测量去值，供软件识别并去除假阳性信号。

将未标记的EV样品用PBS稀释至适合nFCM分析的粒子浓度范围，即每毫升1×10⁸至5×10⁸个粒子。取10至100微升稀释后的样品加入上样孔中。若粒子浓度未知，可先将EV样品进行1:100稀释。

可通过增强过程中CCD相机上激光光斑的大小，或采样期间事件簇信号的观察，快速估算样品浓度。样品加载并增强45秒后，记录一分钟数据，并按之前演示的方法保存文件。记录完成后，开始分析该数据，从“采集”选项卡切换至“分析”选项卡，打开已保存的NFA文件。

为准确测量样品，使用采样前测得的两个标准值来设定样品比较值及空白值。通过选择尺寸标准文件并使用设定阈值工具，创建侧向散射到直径转换的尺寸标准曲线。在事件脉冲轨迹中可见的阈值，表示将一个事件判定为有效信号所需的最小信号强度。

设定阈值后，检查点图参数，X 轴为 SS-H 或 SS-A，Y 轴为 FITC-A。打开标准曲线生成工具，并选择 S16 EXO 68 至 155 纳米作为粒径模板。点击“寻找峰”以识别侧向散射光强度的峰值，对应颗粒直径分别为 68、91、113 或 155 纳米。

在关闭窗口前，请检查侧向散射与直径曲线是否已生成，且R值是否接近1。设置浓度标准，选择已保存的文件，单击计数标准，输入标准样品的颗粒浓度。

设置标准信息。选择EV样本文件并设定阈值。选择空白文件，然后点击“设为空白”以确定需从样本计数中去除的假阳性数量。

打开PDF生成工具后，检查样品的粒径、浓度及稀释倍数。然后显示样品的浓度及颗粒的大小分布。按照文稿中所述对EV样品进行标记后，取一微升标记后的样品，在0.6毫升离心管中用PBS稀释至50倍。

将样品加载到进样舱中，并施加助推压力45秒。同时，确保激光设置正确，并安装了适当的透镜。然后，切换至采样压力，并选择记录时间。

完成一分钟的数据采集后，为数据文件命名并保存。卸下样品，替换为清洗液，并将清洗液冲洗超过30秒，然后再加载下一个标记好的样品，操作方法如前所述。生成PDF时，应采用与之前相同的规范标准。

仅空白测量的设置会有所不同。选择样品文件并设定阈值。选择门控工具，使用左键绘制一条线，以分离荧光阳性细胞群。

设置用于表示的名称和颜色。设定空白文件，点击“设为空白”以识别需从各个不同群体中去除的假阳性数量。打开PDF生成工具，确定荧光阳性亚群的大小分布、浓度及百分比。

在散点图上，将 Y 轴更改为显示来自绿色或红色通道的荧光测量值。设置空白对照并生成 PDF，操作方法如前所述。在散点图上，将 X 轴设为 FITC，Y 轴设为 APC。

利用象限工具识别双荧光阳性群体。设置具有代表性的名称和颜色，然后打开 PDF 文件并选择荧光亚群。C2C12 来源的细胞外囊泡（EVs）约有 50% 表达 CD9，30% 表达 CD63，70% 的群体至少表达三种 EV 标志物中的一种。

单个四跨膜蛋白标记的细胞外囊泡亚群的尺寸分布显示，其中位尺寸较大，约为75至85纳米，且小于65纳米的囊泡比例少于总颗粒群体。SW620来源的细胞外囊泡中，约40%表达CD9，7%表达CD63，42%的颗粒至少表达三种标记物中的一种。来源于SW620且经四跨膜蛋白标记的细胞外囊泡呈现出更接近正态的分布，中位直径在90至110纳米之间，各四跨膜蛋白阳性亚群之间的分布相似。

膜标记反复显示C2C12和SW620来源的EVs有80%的阳性率。侧向散射强度与C2C12和SW620点图上的FITC强度相关。双阳性百分比与四跨膜蛋白阳性百分比非常相似。

CD63 标记似乎与膜标记的相关性最弱。在有或无额外膜标记的情况下，抗体标记的阳性百分比测量结果相似。C2C12 来源的细胞外囊泡（EV）中荧光群体的平均荧光强度表明，CD63 和 CD81 的表达水平低于 CD9 EV；而 SW620 显示，联合使用三种抗体所产生的荧光信号强于任一单独抗体标记。在本方案中，常见的 EV 标志物已进行荧光标记，但也可根据研究需求选择其他多种抗体靶点，以显示 EV 的来源、功能或疾病状态。