Name: 通过纳流式细胞术表征单个细胞外囊泡跨膜蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 了解纳流式细胞术表征单个细胞外囊泡跨膜蛋白的方法，该技术可无标记检测大于14纳米的颗粒并去除假阳性，适用于血浆、脑脊液等多种生物来源的细胞外囊泡分析。

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我们感谢 Owen Davies 和 Nick Peake 团队持续提供材料和专业知识。

1. nFCM 仪器的设置及 nFCM 标准品的测量
注意：在开始采集样本数据之前，需进行三次测量，以验证纳米流式检测仪（nFCM）的正确校准，并提供仪器间可靠的比较依据。这三项测量分别为浓度标准品/质控品（QC）、尺寸标准品和空白对照。
<ol>
	<li>在适当的 0.6 µL 离心管中，将质控微球用蒸馏水按 1:100 比例稀释，并放入加样区。</li>
	<li>从 样本流 下拉菜单中选择 增压，将质控样本引入系统持续 45 秒，以完全替换前一个样本或清洗液。
	<ol>
		<li>在增压过程中，将激光功率设置为质控微球的预设模板 &#34;250 nm FL QC standard&#34;，例如蓝光激光为 10/40 mW，红光激光为 20/50 mW，散射光衰减设为 0.2%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从同一菜单中选择 采样 压力，以降低系统压力。</li>
	<li>将自动采样压力设为 1.0 kPa，以维持恒定压力。</li>
	<li>在采集控制中选择 记录时间，开始 1 分钟的分析。数据将在点图上绘制，散射光强度（SS-intensity）采用对数刻度，荧光强度（FL intensity）采用选定通道。</li>
	<li>保存文件前输入文件名和样本稀释倍数。</li>
	<li>选择“卸载”以将离心管从加样区移除。加入 150 µL 清洗液，通过选择 增压 清洗超过 &#62;30 秒，然后选择 卸载 移除清洗液。
	<ol>
		<li>使用装有 150 µL 水的离心管，清除毛细管尖端残留的多余清洗液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将粒径标准微球用纯水按 1:100 比例稀释，取 100 µL 加入加样区，然后选择 增压 进样 45 秒。</li>
	<li>将激光功率设置为预设模板 &#34;S16 exo 68-155 nm&#34;。该设置适用于粒径标准品以及含有小于 &#60; 200 nm 的细胞外囊泡（EVs）的样本。例如，蓝光激光设为 15/40 mW，红光激光设为 20/50 mW，散射光衰减为 0.2%。</li>
	<li>选择 采样，并如前所述开始记录样本 1 分钟。</li>
	<li>使用水或 PBS 样本进行第三次测量，以建立洗脱液的空白对照，用于软件识别并去除假阳性信号。标准测量值的输入方法将在下一节中说明。</li>
</ol>
2. 测定未标记样品的颗粒浓度并生成PDF报告
<ol>
	<li>用 PBS 将未标记的 EV 样品稀释至适用于 nFCM 分析的合适粒子浓度范围，即 1 × 108–5 × 108 粒子/mL。取 10–100 µL 稀释后的样品加入上样孔中。</li>
	<li>当粒子浓度未知时，先对 EV 样品进行 1:100 的稀释。可通过增强过程中 CCD 相机上激光光斑的大小，或采样期间事件爆发轨迹的观察，快速估算样品浓度。</li>
	<li>对上样样品进行 45 秒的增强处理，然后选择采样并记录 1 分钟，保存方式如前所述。</li>
	<li>要开始分析此数据，请从采集选项卡切换到分析选项卡。打开已保存的 nfa 文件。</li>
	<li>为实现准确的样品测量，在样品测量前应使用之前采集的两个标准测量值来设定用于样品比较和空白对照的参数。</li>
	<li>通过首先选择尺寸标准文件并使用设定阈值工具（也称为自动阈值化），创建用于将 SS 转换为直径的尺寸标准曲线。该阈值在事件爆发轨迹中可见，表示判定一个事件具有显著性的最低信号强度。</li>
	<li>设定阈值后，检查散点图的 x 轴和 y 轴参数是否分别为 x 轴上的 SS-H 或 SS-A 与 y 轴上的 FITC-A。</li>
	<li>打开标准曲线生成工具，并选择S16 exo 68-155 nm作为尺寸模板。点击寻找峰，以识别峰对应的 SS 强度，分别对应直径为 68、91、113 或 155 nm 的粒子。</li>
	<li>在关闭窗口前，检查 SS 至直径曲线是否已生成，且 r 值接近 1。</li>
	<li>通过选择已保存的文件并点击计数标准来设定浓度标准。输入标准品的粒子浓度。</li>
	<li>设定完标准信息后，选择 EV 样品文件并设定阈值。</li>
	<li>选择空白文件并点击设定空白，以识别需从样品计数中扣除的假阳性数量。此操作应使用与样品相同的阈值。然后返回 EV 样品文件。</li>
	<li>打开 PDF 生成工具并选择粒径与浓度。输入样品的稀释倍数。系统将显示样品的浓度及粒子的粒径分布。</li>
</ol>
3. 样品标记
注意：可同时采用两种染色策略，以对悬浮颗粒进行综合分析。标记方案通常需要针对新抗体或新的样本来源进行优化。
<ol>
	<li>将EV样本的一部分用PBS稀释至浓度为1.25 × 1010 粒子/mL。取8 µL稀释后的EV样本，加入1 µL抗体和1 µL染料，使粒子终浓度为1 × 1010 粒子/mL（总粒子数为1 × 108，悬浮于10 µL中）。本实例中，抗体的孵育比例为1:50（即1 µL的1:5稀释抗体）。
	<ol>
		<li>在优化过程中应使用三种以上不同浓度的抗体或染料，以获得数据表明该方案可在不导致所选标记物过度饱和的前提下实现表位的最大结合，避免影响低强度荧光事件的识别。膜染料的孵育浓度为40 nM（即1 µL的400 nM染料）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将10 µL样本涡旋混匀5秒，在室温下避光孵育30分钟。 
	注：对照设置的相关建议见讨论部分。</li>
	<li>孵育完成后，取1 µL标记后的样本，在0.6 mL离心管中用PBS按1:50稀释。</li>
	<li>将样本加载至进样口，并施加助推压力45秒。确保激光设置正确，并已安装合适的镜头。</li>
	<li>切换至采样压力，选择记录时间。完成1分钟的数据采集后，命名数据文件并保存。</li>
	<li>卸载样本并更换为清洗液。施加助推压力超过&#62;30秒，然后加载下一个标记样本。</li>
</ol>
4. nFCM 分析——用于亚群分析的 PDF 生成
<ol>
	<li>进行 PDF 生成时，应用与之前相同的标准；仅空白测量的设置会有所不同。</li>
	<li>选择样品文件并设置阈值。在点图上，将 y 轴更改为显示来自绿色或红色通道的 FL 测量值。</li>
	<li>选择方格门控工具，使用左键在 FL+ 群体周围绘制一个方框。</li>
	<li>打开空白测量文件，点击 Set Blank，然后返回样品文件。</li>
	<li>像之前一样打开 PDF 生成工具，即可获得 FL+ 亚群的粒径分布、浓度以及占所有 SS+ 事件的百分比。
	<ol>
		<li>对每个感兴趣的亚群（标识为 &#34;Total, P1, P2 等&#34;）重复此步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Couch, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+nearly+EV-erything+-+The+rise+and+rise+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A brief history of nearly EV-erything - The rise and rise of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (14), 12144(2021).</li>
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</ol>

A.L.、B.P.、D.A.、R.L、R.T 是 NanoFCM 的员工，他们对本文的贡献是在受雇期间完成的。

样品与试剂详情 
为演示荧光标记及后续的纳米流式细胞术（nFCM）分析，选择了来自两种不同细胞系的细胞外囊泡（EV）分离物。两种EV样本均悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并在-80 °C下保存&#60;3个月，但两者的其他制备条件存在差异。C2C12小鼠成肌细胞系是骨骼肌细胞的胚胎前体细胞，在二维培养体系中培养，并在超速离心法分离EV前，对培养基进行72小时的条件化处理。SW620是一种人结肠腺癌细胞系，在简易生物反应器中培养，培养基富集持续7周，通过尺寸排阻色谱法（SEC）分离EV，并将Sepharose CL-2B柱洗脱的第7至第9组分合并为单一样本。
尽管从条件培养基（CCM）中分离并浓缩的细胞外囊泡（EVs）是最容易处理的样本类型，但纳米流式细胞术（nFCM）同样适用于大多数EV分离物，包括血清、血浆、尿液和脑脊液（CSF）等生物液体。这类样本的分析得益于nFCM对所有颗粒的侧向散射（SS）检测能力，可与纳米颗粒追踪分析（NTA）、 tunable resistive pulse sensing（TRPS）及其他颗粒分析方法相互验证，同时以定量方式描述荧光标记的EV亚群，并给出其占总颗粒数的比例，从而实现无偏倚的多参数颗粒分析。低处理程度的样本也可进行分析，例如未澄清的尿液和EV富集的CCM，但需注意应尽量减少蛋白污染。
此处使用的膜染料旨在整合到脂质双层中，其含有用于膜负载的亲脂性基团和保持在质膜中的亲水性染料25。目前尚无理想的外泌体（EV）标记染料，在选择时必须考虑多个标准，包括对外泌体的特异性、与固定或通透处理的兼容性，以及外泌体标记的效率26。
荧光标记的偶联抗体对表面暴露表位进行标记已被证明是鉴定细胞外囊泡（EV）亚群的有效方法27。实验方案优化的一个关键方面是达到但不超过标记饱和点，以结合所有可及的表位，同时避免未结合的荧光抗体充满周围缓冲液，从而干扰低荧光颗粒的检测28。此外，抗体标记所依赖的表面结合位点的可及性可能受多种因素影响。已有研究表明，EV的储存条件会影响其浓度和粒径分布29，并有观察提示其也会影响抗体标记效果30。表面冠状蛋白的存在、蛋白质修饰以及分离技术的影响在某些情况下也可能对抗体标记产生影响。最终，随着荧光标记在EV研究中的应用日益广泛，针对多种分析技术的实验设计与优化将变得更加精细。
为提高结果的准确性，可设置多种对照，包括：（1）PBS + 染料对照，用于评估某些染料中胶束或聚集体的形成，这些结构在纳米流式细胞术（nFCM）分析中可能表现为侧向散射阳性（SS+）颗粒；（2）PBS + 抗体对照，抗体可能发生聚集，尽管通常不足以产生足够强的光散射信号被SS检测到；（3）EV样本 + IgG抗体对照，这在流式细胞术中较为常见，用于识别非特异性结合；（4）非EV颗粒样本 + 抗体/染料对照——在需要从复杂颗粒样本中识别EV时尤为重要，例如使用纯化的低密度脂蛋白（LDL）颗粒或去除了/消除了EV的样本作为阴性对照，以验证标记的选择性；（5）阳性对照较难设计，但将抗体在细胞上的验证结果作为参考具有实用价值。
细胞外囊泡上四跨膜蛋白的展示 
本实验通过抗体和膜染色表明，纳米流式细胞术（nFCM）分析可在较短时间内获得高水平的定量数据。同时测量颗粒直径/浓度等关键物理特性以及膜和/或蛋白质存在的表型特征，可对颗粒分离物中的亚群进行深入表征。
重要的是，在这两种细胞外囊泡（EV）样本中检测到三种与EV相关的“关键”四跨膜蛋白（tetraspanin）CD9、CD63和CD81的表达水平存在差异。在C2C12来源的EV和SW620来源的EV中，CD9均在最大比例的EV上表达，CD81次之，CD63的表达比例最低。
尽管在此处观察到两种截然不同细胞来源的细胞外囊泡（EV）在四跨膜蛋白谱上存在一些相似性，但CD9、CD63和CD81的水平在细胞系来源与患者来源的EV之间可能存在显著差异31。
两种细胞外囊泡（EV）样本之间CD63表达的差异与当前关于“EV特性”关键标志物的讨论密切相关。尽管SW620细胞来源EV中仅有约8%表达CD63，这一结果可能令部分研究者感到意外，但已有研究指出，CD63作为基于大小或密度分离的不同类型EV的标志物并不可靠32，甚至在被描述为外泌体样（exosome-like）的EV中也已发现存在四跨膜蛋白（tetraspanin）阴性的EV33。
在复杂颗粒分离物中鉴定细胞外囊泡（EVs） 
无论是细胞系来源还是患者来源的EVs，其四跨膜蛋白（tetraspanin）表达谱均具有异质性，这提示应谨慎依赖基于四跨膜蛋白的EV捕获方法，并凸显了未来开发新型EV鉴定技术的必要性31。如果能够证明其对EV具有高度特异性，那么不依赖特定蛋白质的EV标记方法可能在区分EV与大小相似的非EV颗粒方面发挥重要作用。这一点在体液EV分离物中尤为关键，已有研究指出，人血浆中EV的浓度约为1010 粒子/mL，而脂蛋白的浓度则高达每毫升1016 个14,34。即使经过EV富集，比较颗粒对四跨膜蛋白标志物和/或低密度脂蛋白（LDL）标志物ApoB阳性率的研究也表明，在去血小板血浆（PFP）样本中，LDL的丰度仍约为EV的50至100倍35。
所采用的分离技术极大地影响了共分离的非囊泡颗粒（如极低密度脂蛋白（VLDL）、中等密度脂蛋白（IDL）和LDL36）的种类。此外，已有文献报道脂蛋白可与细胞外囊泡（EV）结合并被共分离，这种结合可能具有重要的生物学作用，但也使得获得高纯度EV样本成为一项具有挑战性的目标35。
因此，可以认为应更加关注对样本中颗粒的描述，而不是专注于分离出纯度较高但种类有限的细胞外囊泡（EV）。通过批量测量四跨膜蛋白的丰度和颗粒计数来全面描述颗粒，可能不足以准确测定EV的浓度，尤其是来自生物液体样本时36,37。采用分层方法识别亚群——展示总颗粒数、EV数量以及表达特定蛋白的EV数量——如本实验所示，可能为纳米颗粒表征提供一种可靠的解决方案。这种方法已在涉及EV载药设计以用于未来治疗应用的研究项目中得到应用20，并用于识别携带线粒体等腔内 cargo 的CD63+ EV38。
nFCM 在细胞外囊泡分析技术中的地位 
nFCM 对细胞外囊泡（EV）分析的一个优势在于其数据能够与最常用的 EV 分析方法相互验证，并在物理特性与表型数据集之间建立联系。然而，这一优势依赖于准确的标记方案，而这些方案通常需要针对特定的标记试剂（如染料和抗体）进行优化。实现准确分析的关键标准之一是确保标记后的颗粒悬浮在无荧光背景的缓冲液中，这可以通过去除未结合的过量荧光染料，或优化实验方案以避免表位饱和来实现。
比较研究表明，纳米流式细胞术（nFCM）对细胞外囊泡（EVs）的粒径分析结果与TRPS和冷冻电镜（cryo-TEM）一致，这两种技术被认为在EV粒径分析方面比纳米颗粒追踪分析（NTA）更为准确10,39。然而，与所有基于光学的方法一样，在解读数据时必须考虑EVs自身光学性质的异质性，以及标准物质与EVs之间光学性质的差异10。
通过鉴定细胞外囊泡（EV）标志物来指示EV富集，蛋白质印迹（Western blotting）一直是关键方法40。然而，为了证明这些标志物存在于颗粒表面，推动了基于EV的流式细胞术分析技术的发展17。但是，目前要获得可靠的数据，仍需依赖专用仪器，以实现对散射光和荧光信号的必要分辨率19。
nFCM 利用侧向散射测量，提供了一种无偏倚的方法，可初步描述所有颗粒（不依赖于特定标记物），从而能够与 NTA、RPS 和 TEM1 等最常用技术进行相互验证，同时以定量方式添加类似于 WB 或 ELISA 的表型检测。

什么是细胞外囊泡（EVs）？ 
细胞外囊泡（EVs）是一类来源于细胞的膜性颗粒的统称，参与多种正常的细胞和组织活动。它们在广泛科学领域中的影响及其潜在的临床相关性，推动了EV研究和产业兴趣的增长1。小细胞外囊泡（sEV）的研究主要集中在外泌体，即直径为40–100 nm的颗粒，其形成始于早期内体，经多泡体（MVB）成熟后通过与质膜融合而释放；此外还包括微囊泡，它们直接从质膜出芽形成，直径为80–1,000 nm2。第三类EV群体是凋亡小体，为细胞死亡过程中形成的50–1,500 nm颗粒，因此其相对于其他EV的比例可能差异较大3。
由于细胞外囊泡（EV）的特征可能反映其来源细胞/组织发生的变化，因此其在诊断领域具有应用潜力。目前，各种“组学”分析已开始鉴定能够指示细胞来源和疾病状态的标志物，这使得利用血液血浆/血清、尿液、唾液和脑脊液（CSF）等EV来源对患者进行无创评估成为可能4,5。推动这些EV相关创新发展的关键在于克服了以往局限性的新型表征技术。
单个细胞外囊泡（EV）表征的需求与挑战 
单个EV的表征对于EV分离物的验证与描述日益重要，同时也对阐明这些纳米颗粒的关键特性以推动基于EV的治疗和诊断技术的发展具有重要意义6。根据EV的来源及其预期用途，对纯度的分析（通常表示为EV与非EV颗粒之比或EV与游离蛋白之比）可能需要来自多种分析方法的大量数据7。
在细胞外囊泡（EV）研究文献中，颗粒计数和粒径测量以往主要依赖纳米颗粒追踪技术（NTA）、电阻脉冲传感技术（RPS）和电子显微镜（EM）2。标准NTA和RPS技术无法区分EV颗粒与非EV颗粒，且各自存在局限性，例如NTA检测通量较慢8，以及检测下限不理想等问题9,10,11。
四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81历来是鉴定细胞外囊泡（EV）分离物/制备物中EV存在的关键标志物。通常采用蛋白质印迹（WB）和点印迹技术，以显示这些蛋白在EV分离物中的富集程度高于细胞裂解液12。然而，这些方法缺乏定量能力，且这些EV标志物在不同EV亚群之间以及在细胞、组织或患者间的表达具有异质性，因此需要发展更先进的分析技术，以实现对EV物理特性和表型特征的统一表征13。
纳米流式细胞术作为一种全面的细胞外囊泡分析技术 
确定真实的细胞外囊泡（EV）浓度需要识别完整颗粒并使用通用标记物，特别是在复杂的颗粒分离物中，其分辨率必须能够检测到所有EV，同时将EV颗粒与非EV颗粒区分开来14。
纳米流式细胞术（nFCM）是一种能够在45–1,000 nm粒径范围内对无标记颗粒进行分析的技术，同时利用荧光标记和检测来识别颗粒亚群。与传统流式细胞术的一个关键区别在于，该技术采用专用于纳米颗粒分析的设备，从而实现最高的分辨能力15。细胞外囊泡（EV）分析虽已尝试使用经改造用于小颗粒分析的传统流式仪器，其性能正在不断改进，但仍难以达到检测和分析&#60;100 nm EVs所需的分辨率16,17。基于微球的流式细胞术是常用于EV分析的另一种改进方法，但该方法无法实现单颗粒检测，并可能引入基于捕获效率的偏差18。
得益于侧向散射（SS）通道在EV分析中约45 nm的较低检测限，nFCM采用SS触发模式。这种模式可被视为“先粒子”分析，即在分析荧光强度之前，事件必须产生超过设定阈值的SS信号。该方法可消除降解的膜成分和荧光团聚集物等假阳性信号，并聚焦于&#160;对完整细胞外囊泡的分析15SS 测量还可通过与四模态二氧化硅纳米球标准品比较，用于测定单个颗粒的尺寸19荧光信号由另外两个检测器采集，从而对每个颗粒同时进行三项测量，以描述颗粒浓度、大小以及标志物或其他目标物质的存在情况，进而识别细胞外囊泡（EV）亚群。20.
在以下实验中，采用SS和荧光（FL）测量方法来测定 &#62;45 nm 颗粒可显示膜阳性细胞外囊泡（EVs）的亚群，并鉴定 EV 亚群上 CD9、CD63 和 CD81 的表达情况。文中描述了这些亚群的浓度及其占 SS 测得的总颗粒数的比例，同时也提供了它们的粒径分布特征。

<table><tbody><tr><td>APC 抗 CD81 抗体 (M38)</td><td>abcam</td><td>ab233259</td><td>抗人 CD81 APC&lt;br/&gt; 偶联抗体</td></tr><tr><td>APC 抗 CD9 抗体 (EM-04)</td><td>Abcam</td><td>ab82392</td><td>抗小鼠 CD9 APC&lt;br/&gt; 偶联抗体</td></tr><tr><td>APC 抗 CD9 抗体 (MEM-61)，预稀释</td><td>abcam</td><td>ab82389</td><td>抗人 CD9 APC&lt;br/&gt; 偶联抗体</td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD63 抗体</td><td>biolegend</td><td>143905</td><td>抗小鼠 CD63 APC&lt;br/&gt; 偶联抗体</td></tr><tr><td>APC 抗小鼠/大鼠 CD81 抗体</td><td>biolegend</td><td>104909</td><td>抗小鼠 CD81 APC&lt;br/&gt; 偶联抗体</td></tr><tr><td>CD63 单克隆抗体 (MEM-259)，APC 标记</td><td>invitrogen Via Fisherscientific</td><td>A15712</td><td>抗人 CD63 APC&lt;br/&gt; 偶联抗体</td></tr><tr><td>Celline AD1000 生物反应器</td><td>Merck</td><td>Z688037-5EA</td><td></td></tr><tr><td>清洗液</td><td>NanoFCM</td><td>17159</td><td>纳米分析仪专用内部清洗溶液</td></tr><tr><td>来自 C2C12 的细胞外囊泡 (EVs)</td><td>赠予</td><td></td><td>小鼠细胞系</td></tr><tr><td>来自 SW620 的细胞外囊泡 (EVs)</td><td>赠予</td><td></td><td>人源细胞系</td></tr><tr><td>Memglow - 荧光生成型膜探针</td><td>Cytoskeleton</td><td>MG01</td><td>无毒细胞膜染料</td></tr><tr><td>纳米分析仪</td><td>NanoFCM</td><td></td><td>用于单颗粒检测的纳米流式细胞仪</td></tr><tr><td>PBS，pH 7.2</td><td>Gibco Via Fisherscientific</td><td>12549079</td><td>用于样本和抗体稀释的盐溶液</td></tr><tr><td>Snaplock 微量离心管，0.60 mL</td><td>Axygen Via Fisherscientific</td><td>11371944</td><td>用于向纳米分析仪加载样本的管材</td></tr></tbody></table>

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

单颗粒表征在细胞外囊泡研究中正变得日益重要，已从整体分析技术及第一代颗粒分析方法发展为纳米流式细胞术（nFCM）等全面的多参数测量手段。nFCM 是一种流式细胞术，采用专为纳米颗粒分析设计的仪器，可在使用或不使用染色技术的情况下，每分钟对数千个细胞外囊泡（EV）进行表征。高分辨率侧向散射（SS）检测可确定所有大于 45 nm 的生物颗粒的粒径和浓度，而同步的荧光（FL）检测则可识别标记的标志物和目标分子的存在。标记的亚群随后可用每毫升颗粒数（particles/mL）的定量单位表示，或以侧向散射所识别的总颗粒数的百分比形式进行描述。
在此，从条件培养基（CCM）中提取的细胞外囊泡（EVs）使用脂质染料进行标记，以识别具有膜结构的颗粒，同时使用针对CD9、CD63和CD81的特异性抗体进行标记，这些是常见的EV标志物。在1分钟的分析过程中，对对照材料、二氧化硅纳米球浓度标准品和粒径标准品以及标记样品的测量结果进行分析。随后，软件首先对所有颗粒（无论是否标记）的浓度和粒径分布进行测定，再进一步确定各标记阳性的颗粒。
同时检测SS和FL可灵活应用于多种不同EV来源及外部和内部标记靶点，以全面且定量的方式描述EV样本。

SW620 来源的细胞外囊泡和 C2C12 来源的细胞外囊泡中四跨膜蛋白的表达 
目前对多种来源细胞外囊泡（EVs）中关键四跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 表达丰度的分析表明，无论是在整体分析中，还是在分析其于 EV 亚群中的表达情况时，这些蛋白的存在均表现出极大的变异性21。这可能与不同的生物发生途径（如依赖 ESCRT 和非依赖 ESCRT 的途径）的可用性有关22。
在图1中，CD9在C2C12细胞外囊泡（EVs）上的表达比例最高，约为50%，而CD63的表达仅约为30%。当使用三种抗四跨膜蛋白抗体同时进行标记时，约70%的颗粒显示出至少表达一种EV标志物。重复测量结果显示，CD9/63/81联合标记C2C12 EVs的标准偏差最低，约为3.8%，而单独CD81标记的C2C12 EVs标准偏差约为8.1%。
SW620 细胞来源的细胞外囊泡显示出不同的四跨膜蛋白谱，其中表达量最高的 CD9 约为 40%，而表达量最低的 CD63 约为 7%，两者之间差异显著。与 C2C12 细胞来源的细胞外囊泡相似，CD9 存在于大多数四跨膜蛋白阳性群体中，因为 CD9/63/81 联合标记发现约 42% 的颗粒至少表达这三种标记物之一。
C2C12 来源的大多数颗粒，即总 SS+ 群体，大小范围为 45–120 nm，中位直径约为 65 nm。每种单个四跨膜蛋白标记的 EV 亚群的粒径分布如图所示 图1，彼此相似，显示出较大的中位尺寸，约为 ~75-85 nm，且数量较少 &lt;65 nm的细胞外囊泡占总颗粒群体的比例。
SW620 来源的颗粒大小在 45-160 nm 之间，中位粒径约为 65 nm，呈偏态分布。四跨膜蛋白标记的细胞外囊泡显示出更接近正态的分布，中位直径更大，介于 90-110 nm 之间，且不同四跨膜蛋白阳性亚群间的分布相似。
尽管这两种细胞系中表达最多和最少的四跨膜蛋白相同，但它们的相对表达水平差异显著，并且在四跨膜蛋白潜在共表达方面存在一个有趣的差异，这体现在CD9阳性率与CD9/63/81共阳性率之间的差别上。
结合EV膜标记与抗体标记 
细胞外囊泡（EV）的双层膜结构提供了一种更通用的标记靶点，可能有助于将EV与大小相似的非EV颗粒（如蛋白质聚集体以及具有脂质单层的某些形式低密度脂蛋白LDL）区分开来23。此类标记的特异性必须经过验证，因为在EV研究中常用的一些膜染料也被证明可结合非EV颗粒24。
膜标记反复显示，C2C12 来源的 EVs 和 SW620 EVs 的阳性率约为 80%。SS 散射强度（SS-H）在 C2C12 和 SW620 结果的点图中均与 FITC 荧光强度表现出良好相关性。 图2. 这是预料之中的，因为SS强度与颗粒大小相关，因而与膜表面积成正比。
大多数抗体标记的EVs也对膜标记呈阳性，显示双阳性百分比（FITC+ &amp; APC+) 与四跨膜蛋白阳性百分比非常相似。FITC 与 APC 点图显示膜标记与四跨膜蛋白标记之间存在轻微相关性，其中 CD63 标记与膜标记的相关性似乎最弱。检测到极少的事件为抗体标记阳性而膜标记阴性。
可重复性、双重标记效率及替代数据输出 
设计纳米流式细胞术（nFCM）实验时，一个重要考虑因素是荧光染料或标记物之间的相互作用。图3a 显示，在有或无额外膜标记的情况下重复抗体标记，所得的阳性百分比测量值非常相似。特别是SW620的标记在两组测量之间表现出极小的差异。这表明染料与抗体结合之间的干扰有限，同时也凸显了在重复细胞外囊泡（EV）标记时具有良好的可重复性。
可以将每个被测颗粒的侧向散射和荧光强度测量值导出至 Excel。由此可计算平均荧光强度（MFI），以提供对标记靶标丰度的相对估算。C2C12 来源的细胞外囊泡（EVs）荧光群体的 MFI 结果显示，CD63 和 CD81 的表达水平略低，其 MFI 值分别约为 550 和 600，而 CD9+ EVs 的 MFI 值约为 850。此处 MFI 的测量单位为 FL-A，未通过荧光校准标准进行标准化。同时使用三种抗体并未比单独使用 CD9 标记产生更强的荧光信号。这与 SW620 的 MFI 测量结果明显不同，后者表明，使用三种抗体的混合物对标记 EVs 产生的荧光信号强于任一单一抗体标记。
NanoFCM 软件生成的粒径分布直方图也可导出至 Excel，以便叠加三组重复数据。图 3 中的粒径分布曲线与图 1 相似，但包含误差线。源自 C2C12 细胞的细胞外囊泡（EV）中四跨膜蛋白阳性亚群的中位粒径约为 70 nm，略大于总颗粒群体的 60 nm 平均值。SW620 细胞来源的四跨膜蛋白标志物阳性 EV 粒径更大，峰值出现在约 100 nm 处。
<img alt="CD9、CD63、CD81在C2C12、SW620细胞来源EV上的抗体标记柱状图及粒径分布直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：通过抗体标记鉴定出CD9、CD63、CD81阳性的EV亚群。（A）柱状图显示，与SS检测到的C2C12来源EV总颗粒数相比，被标记EV所占的百分比。（B）柱状图显示，与SS检测到的SW620来源EV总颗粒数相比，被标记EV所占的百分比。（C）C2C12来源EV的代表性粒径分布图谱。每个直方图均来自三组重复数据集中首次测量所生成的概率密度函数（PDF）图谱。（D）SW620来源EV的代表性粒径分布图谱。每个直方图均来自三组重复数据集中首次测量所生成的概率密度函数（PDF）图谱。误差线表示同一批标记样本三次重复测量的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="C2C12和SW620细胞外囊泡的抗体标记柱状图与散点图；流式细胞术结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：CD9、CD63、CD81膜标记及抗体标记显示的细胞外囊泡亚群。（A）C2C12来源细胞外囊泡中膜阳性（Membrane+）百分比、四跨膜蛋白（tetraspanin+）阳性百分比及双阳性（double+）百分比的柱状图。（B）SW620来源细胞外囊泡中膜阳性、四跨膜蛋白阳性及双阳性百分比的柱状图。（C）代表性SS vs FITC点图，显示膜阳性群体的设门策略。（D）代表性FITC vs APC点图，显示来自C2C12的细胞外囊泡双阳性群体的设门情况。（E）代表性FITC vs APC点图，显示来自SW620的细胞外囊泡双阳性群体的设门情况。误差线表示同一样品三次重复测量的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于分析 C2C12 和 SW620 颗粒大小的抗体标记重复性示意图与直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64020/64020fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：评估重复测量中的变异情况。 （A）柱状图显示抗体标记的阳性百分比，包含或不包含额外的膜标记。（B）门控 EV 亚群的平均荧光强度测量结果。（C）C2C12 EVs 三份重复数据集的平均粒径分布直方图。（D）SW620 EVs 三份重复数据集的平均粒径分布直方图。误差线表示同一样本标记后三次重复测量的标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64020/64020fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45 nm的所有生物颗粒进行无标记检测，并通过多种荧光标记技术鉴定亚群的特定特征。

单颗粒表征在细胞外囊泡研究中正变得日益重要，已逐步从整体分析技术发展而来……

对细胞外囊泡（EVs）进行深入表征具有挑战性，通常需要多种仪器分别描述各个参数。而采用纳米流式细胞术等单一技术即可同时描述多个EV亚群，从而对每个EV进行单独测量，在确定其荧光特性之前，无需标记即可识别直径大于14纳米的颗粒。这可以通过去除假阳性结果来获得稳健的数据集。纳米流式细胞术可应用于多种来源的细胞外囊泡（EVs）分析，包括从血浆、脑脊液和培养基中富集的囊泡。该技术还可用于病毒、脂质纳米颗粒以及纳米材料的分析。优化标记方案至关重要，这可以最大限度地提高与颗粒相关的荧光信号，同时减少缓冲液中残留的背景荧光。首先，打开仪器，启动 Nano-Flow Profession 软件，从鞘流菜单中选择“启动”，将水加入加载舱，然后从鞘流菜单中选择“增压”。将质控微球用去离子水按1:100稀释于0.6微升离心管中，并将其放入加样舱以将样品引入系统。随后按照之前演示的方法推动样品45秒，以完全替换之前的样品、水或清洗液。在推动过程中，将激光功率设置为质控微球预设模板中的250纳米荧光质控标准。随后，为降低系统压力，从同一下拉菜单中选择采样压力，并将自动采样压力设置为1千帕，以维持恒定压力。然后，在采集控制中选择“记录时间”，启动一分钟的分析。数据将绘制在点图上，横坐标显示侧向散射光强度的对数刻度，纵坐标显示选定的荧光强度。保存文件前，输入文件名和样品稀释倍数。接着，选择“卸载”以将试管从装载舱中取出。用150 µL清洗液替换质控微珠，并通过选择“增强”清洗超过30秒。使用含有150微升水的离心管，通过将毛细管尖端浸入水中以去除毛细管尖端上多余的清洗液。然后将尺寸标准微珠按1:100的比例用水稀释，并将100微升稀释液加入上样孔中。接着，将激光功率设置为预设模板S16 EXO 68至155纳米。此设置适用于大小标准品以及含有小于200纳米EV的样品。选择采样并记录样品一分钟。第三次测量使用水或PBS样品进行，以创建空白测量去值，供软件识别并去除假阳性信号。将未标记的EV样品用PBS稀释至适合nFCM分析的粒子浓度范围，即每毫升1×10⁸至5×10⁸个粒子。取10至100微升稀释后的样品加入上样孔中。若粒子浓度未知，可先将EV样品进行1:100稀释。可通过增强过程中CCD相机上激光光斑的大小，或采样期间事件簇信号的观察，快速估算样品浓度。样品加载并增强45秒后，记录一分钟数据，并按之前演示的方法保存文件。记录完成后，开始分析该数据，从“采集”选项卡切换至“分析”选项卡，打开已保存的NFA文件。为准确测量样品，使用采样前测得的两个标准值来设定样品比较值及空白值。通过选择尺寸标准文件并使用设定阈值工具，创建侧向散射到直径转换的尺寸标准曲线。在事件脉冲轨迹中可见的阈值，表示将一个事件判定为有效信号所需的最小信号强度。设定阈值后，检查点图参数，X 轴为 SS-H 或 SS-A，Y 轴为 FITC-A。打开标准曲线生成工具，并选择 S16 EXO 68 至 155 纳米作为粒径模板。点击“寻找峰”以识别侧向散射光强度的峰值，对应颗粒直径分别为 68、91、113 或 155 纳米。在关闭窗口前，请检查侧向散射与直径曲线是否已生成，且R值是否接近1。设置浓度标准，选择已保存的文件，单击计数标准，输入标准样品的颗粒浓度。设置标准信息。选择EV样本文件并设定阈值。选择空白文件，然后点击“设为空白”以确定需从样本计数中去除的假阳性数量。打开PDF生成工具后，检查样品的粒径、浓度及稀释倍数。然后显示样品的浓度及颗粒的大小分布。按照文稿中所述对EV样品进行标记后，取一微升标记后的样品，在0.6毫升离心管中用PBS稀释至50倍。将样品加载到进样舱中，并施加助推压力45秒。同时，确保激光设置正确，并安装了适当的透镜。然后，切换至采样压力，并选择记录时间。完成一分钟的数据采集后，为数据文件命名并保存。卸下样品，替换为清洗液，并将清洗液冲洗超过30秒，然后再加载下一个标记好的样品，操作方法如前所述。生成PDF时，应采用与之前相同的规范标准。仅空白测量的设置会有所不同。选择样品文件并设定阈值。选择门控工具，使用左键绘制一条线，以分离荧光阳性细胞群。设置用于表示的名称和颜色。设定空白文件，点击“设为空白”以识别需从各个不同群体中去除的假阳性数量。打开PDF生成工具，确定荧光阳性亚群的大小分布、浓度及百分比。在散点图上，将 Y 轴更改为显示来自绿色或红色通道的荧光测量值。设置空白对照并生成 PDF，操作方法如前所述。在散点图上，将 X 轴设为 FITC，Y 轴设为 APC。利用象限工具识别双荧光阳性群体。设置具有代表性的名称和颜色，然后打开 PDF 文件并选择荧光亚群。C2C12 来源的细胞外囊泡（EVs）约有 50% 表达 CD9，30% 表达 CD63，70% 的群体至少表达三种 EV 标志物中的一种。单个四跨膜蛋白标记的细胞外囊泡亚群的尺寸分布显示，其中位尺寸较大，约为75至85纳米，且小于65纳米的囊泡比例少于总颗粒群体。SW620来源的细胞外囊泡中，约40%表达CD9，7%表达CD63，42%的颗粒至少表达三种标记物中的一种。来源于SW620且经四跨膜蛋白标记的细胞外囊泡呈现出更接近正态的分布，中位直径在90至110纳米之间，各四跨膜蛋白阳性亚群之间的分布相似。膜标记反复显示C2C12和SW620来源的EVs有80%的阳性率。侧向散射强度与C2C12和SW620点图上的FITC强度相关。双阳性百分比与四跨膜蛋白阳性百分比非常相似。CD63 标记似乎与膜标记的相关性最弱。在有或无额外膜标记的情况下，抗体标记的阳性百分比测量结果相似。C2C12 来源的细胞外囊泡（EV）中荧光群体的平均荧光强度表明，CD63 和 CD81 的表达水平低于 CD9 EV；而 SW620 显示，联合使用三种抗体所产生的荧光信号强于任一单独抗体标记。在本方案中，常见的 EV 标志物已进行荧光标记，但也可根据研究需求选择其他多种抗体靶点，以显示 EV 的来源、功能或疾病状态。

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科研

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Biology

生物学

通过纳流式细胞术表征单个细胞外囊泡跨膜蛋白

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使用流式细胞术分析细胞外囊泡的技术

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细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

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优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化

在此，我们介绍一种简便的实验方案，可实现 体外...

利用流式细胞术追踪miRNA向细胞外囊泡的释放

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设定外泌体分离的成功分选条件

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

了解纳流式细胞术表征单个细胞外囊泡跨膜蛋白的方法，该技术可无标记检测大于14纳米的颗粒并去除假阳性，适用于血浆、脑脊液等多种生物来源的细胞外囊泡分析。

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

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