使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

将端口连接至带有管路的注射器至关重要，因为正确操作时不会发生泄漏，流式池中不会产生气泡，并且在小心使用的情况下，可在长达一年的时间内重复使用同一个流式池进行实验。本文将介绍两种将连接器安装到流式池上的简单方法。这些方法操作简便、可重复性强，且使研究人员能够轻松根据自身需求对流式池进行适配，而无需过多麻烦。

这些流动池的设计初衷是用于单分子实验，特别是我们称之为可视化生物化学的研究，但它们也可应用于任何需要微流控技术以及层流流体条件的研究场景。因此，为了避免失误，建议不要一开始就使用宝贵的流动池来建立实验技术，而是先在载玻片或盖玻片上进行练习。

这将帮助操作者熟悉玻璃或聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料的特性，了解如何正确操作，以及在插入管路或连接接头时应施加多大的力。此过程可能需要损耗一些接头，但它们的成本远低于流动池。首先，将流动池放置在干净、平整的表面上。

用镊子夹住聚四氟乙烯管自由端前3毫米处，将管子推入端口。对剩余的每个端口重复此操作。将入口端口连接至注射泵，出口连接至废液瓶。

用一毫升分光光度级甲醇填充每个玻璃注射器，并将其连接至切换阀。确保阀的出口朝向废液端，用50微升甲醇冲洗每条管路。将出口位置切换至流通池，并以每小时100微升的流速向流通池泵入800微升甲醇，以润湿表面并排除气泡。

第二天，使用 800 微升超纯水重复此过程。流动池现在已准备就绪，可供使用。如果使用压合式管路连接器，请小心地从连接器一侧移除胶带，并将其放置在显微镜载玻片的孔上。

按压数秒钟。对剩余的连接器重复此操作。然后将流路池放置在干净的平面上。

握住聚四氟乙烯管，使其自由端露出3毫米，然后将管子推入端口的孔中。对剩余的每个端口重复此操作。将进样口的管路连接至切换阀。

将附件置于洁净的平面或定制的流体池固定装置上，以在粘合过程中固定流体池和连接件。将流体池放置在固定装置的凹槽部分，然后在组件底部涂抹少量玻璃胶，插入密封圈。将纳米进样口对准载玻片上的一个进样孔。

轻轻下压并固定，避免横向移动。对剩余的端口重复此操作。让其自然干燥，或在多通阀上夹紧固定。

轻轻将流路池从管路系统中取出，并确保组件与流路池的入口端口良好对齐。将流路池放置在显微镜载物台上，使用手指拧紧接头连接管路。每个玻璃注射器中加入一毫升光谱纯级甲醇。

将每个注射器连接至切换阀。确保阀门出口指向废液端，用50 µL甲醇冲洗每条管路。将出口位置切换至流通池，并以100 µL/h的流速向流通池中泵入800 µL甲醇。

第二天，使用 800 微升超纯水重复此过程。此处显示了输出功率的测量。在将激光头安装到光学系统之前，需测量激光器的输出功率。

完成光阱对准后，使用100倍物镜对每个光阱测量光束功率。图像展示了一微米荧光微珠的稳定光学捕获。其中F为固定光阱，M为可移动光阱。

移动光阱以30赫兹的频率在小圆或大圆路径上扫描。流动池内的流体流动呈层流状态。示意图从顶部展示流动池结构，以说明通道间的扩散是相邻流体流之间混合的主要来源。

蓝色箭头表示流动方向，各股流体分别显示为白色、浅灰色和白色。通道间横向扩散的扩展区域以红色标示。插图显示了相邻流体流在10倍放大下的荧光图像，其中下部流体流含有荧光标记的DNA-微珠复合物，上部流体流仅含缓冲液。

上游的白色斑点是CCD相机产生的散粒噪声。流速分布和层流细胞呈抛物线形。流室从侧面观察，每个细胞上方标示了流动方向。

线性珠粒流速受泵速和蔗糖浓度影响。溶液黏度影响作用于珠粒的阻力。在流动条件下，珠粒直径会影响作用于珠粒的力。

进行该操作时，请确保工作区域洁净，并已使用光谱级甲醇或丙酮清洁玻璃表面。此时，您应已将流动池连接至注射泵，接下来即可引入溶液并开始光镊实验。流动池的使用可延长实验时间，使研究人员能够研究多种单分子反应，包括测量受力、通过荧光观察反应过程，或同时结合这两种方法。