Name: 使用双光镊和微流体进行单分子研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学习使用双光镊和微流体技术进行单分子可视化生物化学研究的方法。掌握连接端口、消除气泡和可重复实验的关键技术，实现长达一年的稳定实验操作。

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Bianco 实验室的研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM100156 和 GM144414（资助对象：P.R.B.）的支持。

1. 使用聚苯乙烯微球进行光镊校准与测试
注意：设置请参考图1A、B。
警告：实验人员在进行激光束准直时应佩戴适当的护目镜或激光防护眼镜。由于本文所述的光镊系统同时使用了氦氖激光（HeNe）和红外激光（IR），因此需要两套不同的激光防护眼镜。
<ol>
	<li>HeNe 激光束准直
	<ol>
		<li>将所有光学元件放置在光学平台上。调整光学平台的位置，使其相对于显微镜尽可能接近 90° 角。</li>
		<li>将装有物镜和筒镜的接合套管连接到显微镜上（图 1A-11,12）。 
		注：筒镜是一种透镜系统，用于将图像聚焦在目镜的中间像平面。</li>
		<li>打开 HeNe 激光器并开启快门（图 1A-18）。光束应以 54 mm 的高度照射到滤光片（图 1A-3），其中 50% 的光被反射至反射镜 5（图 1A-5）。剩余 50% 的光束以与反射镜 3 相同的高度照射到反射镜 4（图 1A-4）。</li>
		<li>调节反射镜 4（图 1A-4），使光束以 51 mm 的高度照射到反射镜 6（图 1A-6）。</li>
		<li>调节反射镜 6（图 1A-6），使光束以 51 mm 的高度导向下方的振镜。从上方振镜出射的光束高度应为 57.5 mm。</li>
		<li>调节反射镜 3（图 1A-3），使该光束以 57.5 mm 的高度照射到反射镜 5（图 1A-5）。经反射镜 5 反射后，光束应以相同高度照射到反射镜 9（图 1A-9）。光束在反射镜 9 处有效合束后，穿过物镜和筒镜系统，到达反射镜 21（图 1A-21），并由其反射进入物镜。</li>
		<li>将一块干净的显微镜载玻片放置在显微镜载物台上。打开相机，在屏幕上分别成像固定光束和扫描光束。从反射镜 3 开始，依次调节反射镜 5 和 9，最后调节反射镜 21，进行微调，使固定光束位于屏幕中央。</li>
		<li>为确保从反射镜 21 出射的光束角度为 90°，调节显微镜的 Z 轴高度，使成像的光束分别位于载玻片的上表面和下表面。当两者重合时，表明光束处于正确位置，即垂直于载物台。使用快门 19（图 1A-19）关闭该光束。</li>
		<li>从反射镜 4 和 6 开始，进行微调，使固定光束位于屏幕中央。随后关闭该光束。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>红外（IR）光束准直 
	警告：出于安全考虑，请在低激光功率下执行所有步骤。
	<ol>
		<li>调节波片 14（图 1A-14），以调整在分束器 2（图 1A-2）处分裂的透射光束与反射光束的比例。分束器 2 反射激光束的 s 分量，并透射 p 分量。</li>
		<li>穿过分束器 2 的光束照射到反射镜 7（图 1A-7），该反射镜将光束偏转至下方的振镜。光束应沿 HeNe 光束的路径传播至反射镜 21。通过微调反射镜 7 实现此对准。</li>
		<li>调节反射镜 2，使经其反射的光束以 57.5 mm 的高度照射到反射镜 10（图 1A-10）。</li>
		<li>光束从反射镜 10 反射至反射镜 8（图 1A-8），高度为 57.5 mm。随后的光束应以相同高度照射到反射镜 9。若未对准，需根据需要微调反射镜 10 和 8。</li>
		<li>取下物镜，将功率计探头置于物镜转盘的接口处。</li>
		<li>使用波片 14、15 和 16（图 1A-14,15,16）调节各激光束的功率，使其相等，如 图 1C 所示。</li>
		<li>安装扩束镜 1（图 1A-1）。调节扩束后的激光束，使其呈圆形，且无彗差或像散。</li>
		<li>为测试光镊，制备含有 1 μm 聚苯乙烯微球的水溶液。取 10 μL 该溶液滴加在显微镜载玻片上，盖上盖玻片，并用指甲油密封。将载玻片置于显微镜载物台上，通过捕获这些 1 μm 微球来测试光镊性能。确保当移动载物台时，微球能被稳定吸入并牢固捕获。从光阱的各个方向均应实现同等高效的捕获。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 微流控腔室的制备
<ol>
	<li>如果流动池是市售装置，由盖玻片上的聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，则进入步骤3。如果是带有连接器的玻璃装置，则进入步骤4。</li>
	<li>如果流动池未安装连接器，需先将连接器键合到载玻片的入口孔上。连接器的安装步骤见步骤3。</li>
</ol>
3. 使用PDMS流动池的流路连接
注意：设置请参考图2D。
<ol>
	<li>将流通池放置在干净的平面上。用镊子夹住聚四氟乙烯（PTFE）管自由端前3 mm处，将其插入预制的接口中（该接口可承受2 bar的管路压力）。</li>
	<li>对剩余的每个接口重复此操作。将入口连接至注射泵，出口连接至废液瓶（图4A，B）。</li>
	<li>用1 mL光谱纯甲醇填充每支玻璃注射器。将每支注射器连接至切换阀。确保阀门出口朝向废液端，用50 μL甲醇冲洗每条管路（图4C，关闭位置）。</li>
	<li>将阀门出口切换至流通池（图4C，打开位置）。以100 μL/h的流速向流通池中泵入800 μL甲醇，以润湿表面并排除气泡。</li>
	<li>次日，使用800 μL超纯水重复此过程。此时流通池已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
4. 安装压配合管路接头
注意：设置请参考图2F。
<ol>
	<li>若使用压合式管路接头，请小心地从接头一侧取下胶带，并将其覆盖在显微镜载玻片的孔洞上，按压数秒钟。对剩余的接头重复此操作。</li>
	<li>将流动池放置在清洁、平坦的表面上。用镊子夹住聚四氟乙烯（PTFE）管路自由端前3 mm处，将其插入端口的预制孔中，并对其他各个剩余端口重复此步骤。</li>
	<li>将进样管路连接至切换阀。继续进行第7步。</li>
</ol>
5. 永久组件的安装
注意：设置请参考图2A-C。
<ol>
	<li>可在洁净的平面上或使用定制的夹具进行固定，以在粘合过程中固定流式池和连接器。</li>
	<li>将流式池放置在洁净的平面上或夹具的凹槽部分（图2B）。在组件底部涂抹少量玻璃胶，然后插入密封件。</li>
	<li>将纳米端口对准载玻片上的一个入口孔，轻轻下压并保持位置稳定，避免横向移动。对剩余端口重复此操作。</li>
	<li>静置干燥或在夹具中夹紧固定。轻轻将流式池从夹具中取出，确保各组件与流式池的入口孔对齐良好。准备就绪后，进入步骤7。</li>
</ol>
6. 流通池连接与准备
注意：设置请参考图4A、B。
<ol>
	<li>将流动池放置在显微镜载物台上。使用手指拧紧接头连接管路。</li>
	<li>用1 mL光谱纯甲醇填充每支玻璃注射器。将每支注射器连接至切换阀。确保阀门出口朝向废液端，并用50 μL甲醇冲洗每条管路（图4C，关闭位置）。</li>
	<li>将阀门出口切换至流动池（图4C，打开位置）。以100 μL/h的流速向流动池中泵入800 μL甲醇，以润湿表面并排除气泡。</li>
	<li>次日，使用800 μL超纯水重复此过程。此时流动池已准备就绪，可供使用。</li>
</ol>
7. 流体流动的控制
<ol>
	<li>将切换阀转至关闭位置（图4C）。取下注射器，弃去残留的水，并用实验溶液（例如DNA-珠粒、酶和ATP）重新填充注射器。将注射器放回泵上，并连接至切换阀。</li>
	<li>在此位置，手动将推杆压下5–10 μL，以排除任何气泡。将切换阀位置改为打开。</li>
	<li>使用流速方案实现最佳流体流速，以利于捕获和观察，具体参数见表1。用于光镊捕获的最佳流体流速应能够稳定捕获珠粒，且在DNA被拉伸后呈现B型构象（约3,000 bp/μm）。</li>
</ol>
8. 捕获带有单个DNA分子的聚苯乙烯微球
<ol>
	<li>在10倍放大倍数下，找到靠近通道入口处流体流之间的边界。向100倍物镜添加油并切换至更高放大倍数。</li>
	<li>打开光镊的快门（可同时打开两个，或逐个打开）。聚焦的激光束应立即捕获微珠，并使DNA迅速拉伸。</li>
	<li>一旦复合物被捕获，将载物台沿垂直于流动方向移动（图3A、C，插图）。这会将被捕获的复合物从DNA微珠溶液中移入流道2。继续移动可将复合物转移至流道3。</li>
</ol>
9. 流通池清洗
注意：每日执行此操作。
<ol>
	<li>实验结束后关闭泵。将切换阀转至关闭位置（图4C）。</li>
	<li>取下注射器并排空内容物，用过滤的蒸馏水冲洗三次。</li>
	<li>用清洗液填充注射器，将注射器装入泵中，并连接至切换阀。</li>
	<li>冲洗切换阀，并将其位置切换为打开状态。通常以100 μL/h的流速泵入800 μL清洗液，一般过夜运行。</li>
	<li>次日，先关闭切换阀，然后取下注射器并用水冲洗。以400–800 μL/h的流速，用4–800 μL水冲洗流通池和管路。若需对流通池进行更彻底的清洗，可将清洗液替换为6 M盐酸胍溶液。</li>
</ol>

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<li>Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+microfluidic+approaches+for+a+fast+and+efficient+reagent+exchange+in+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18069(2020).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

流体系统的精确组装对于实验的成功至关重要4,6。该实验方案中最困难的环节之一是将连接器固定在玻璃表面。为此，我们采用以下两种方法：压接式管路连接器和纳米端口组件。压接式连接器可轻松粘附于玻璃表面，随后用镊子将聚四氟乙烯（PTFE）管插入预制孔中。当需要更稳定的连接时，优先选择纳米端口组件的键合方式。若使用得当并妥善清洁，带有永久性组件的单个玻璃流动池可使用超过一年。若需要更频繁地更换流动池，可使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）流动池，因其是性能优良且成本更低的替代方案。PDMS 流动池可重复使用，但 PDMS 易发生溶胀，可能随时间改变流体流动行为。
玻璃和PDMS流动池均非不可破坏。在实验室中，使用的最大流速为800 μL/h。若长期或每日超过此流速，可能导致玻璃流动池发生翘曲&#160;（glass flow cells）以及PDMS材料变形。尽管使用甲醇和水进行初始润湿的步骤耗时较长，但非常值得，因为该过程可完全消除气泡，并可检测连接处是否存在泄漏。本文所述的流动...

在单分子水平上实时观察蛋白质与DNA相互作用的能力，为基因组稳定性研究提供了重要见解1,2。除了逐个操作单个DNA分子外，观察邻近个体分子之间相互作用的过程还能提供进一步的深入认识3,4,5。操控多个DNA分子需要额外的光镊装置，以及高质量的多通道微流控流动池6。
目前有多种方法可用于生成多个光镊。这些方法包括振镜扫描镜、声光调制器以及衍射光学元件，后者可生成全息光镊4,7,8,9。通常，扫描镜和声光调制器产生的光镊采用时间复用方式工作。在本文所述的装置中，单束Nd:YAG激光的光束按偏振方向被分束，随后由振镜激光扫描镜控制所谓的移动光镊的位置（图1）4。为了便于调整反射镜和滤光片的位置，使捕获光束准确进入显微镜物镜的后焦孔径，系统使用了一束HeNe激光。由于HeNe激光束肉眼可见，而红外光束不可见，因此这使得整体光路对准更加容易。此外，HeNe激光使用更安全，从而降低了调整反射镜和其他组件时的操作压力。最初，HeNe激光的光路与1064 nm激光光路相互独立，随后将其引入同一光路，并最终导入显微镜物镜。在完成物理对准后，通过将1064 nm光束与HeNe光束重合来实现共轴对准，此过程借助红外观察仪和多种光束成像工具来可视化光束位置和质量，从而实现精确对准。接着引入扩束器，将扩展后的红外光束对准至物镜的后焦孔径。最后，移除物镜，使用λ/2波片测量并调节两个偏振光束的功率，使其相等（图1C）。当物镜重新安装后，再次进行功率测量，通常会观察到约53%的功率损失。然而，剩余功率仍足以在焦平面上形成稳定且可移动的光学捕获阱（图1D）。
为了成像DNA的动态过程，微流控流动池发挥着关键作用，因其能够在单分子水平上实现具有高空间和时间分辨率的可控测量（图2）。微流控（microfluidic）一词指的是在尺寸范围为5–500 μm的一个或多个通道中操控流体的能力10,11。流（stream）指通道中实际存在的流体，而通道（channel）则指流体流经的物理结构。单通道流动池设计包含一个共用的物理通道，在该通道中观察反应，通常仅存在一个流体流，因此这类设计被称为单流流动池。相比之下，多流流动池是指一种微流控装置，其中两个或多个入口通道汇入一个共用的物理通道（图2A）。在共用通道内，来自各个入口通道的流体流彼此平行流动，并因扩散作用仅发生极少量混合而保持分离状态（图2B）。在大多数实验设置中，由单个泵以相同速度将流体推入各个通道。而当采用边界导向（boundary steering）技术时，则使用三个或更多独立控制的泵将流体送入通道，各泵以不同速度运行，但共用通道中的总流速保持恒定12。这一&#160;方法仅通过调节泵速即可实现主通道组分的快速更换。
除了层流之外，另一个关键因素是层流流体中呈抛物线形的速度分布。流速在流体中央区域最高，而在边缘区域最低。&#160;紧邻表面图2C)13此构型必须予以考虑，以充分拉伸固定在液流中微球上的DNA分子，从而实现对荧光标记DNA的精确可视化和准确的单分子分析。在此条件下，DNA被拉伸至B型构象，并在0 pN的力作用下保持固定。为实现该状态，应将光镊捕获位置聚焦于距底部盖玻片表面10–20 μm处图2D）。必须注意避免将DNA分子拉伸超过B型结构，否则可能抑制酶促反应。在常规缓冲条件下，1 μm 对应 3,000 bp 的DNA14此外，通过将DNA复合物捕获在距离盖玻片10–20 μm的位置，可使其远离表面，从而最大限度地减少表面相互作用。
已采用多种方法制备微流控装置的通道，这些方法可在实验室中完成，也可从商业渠道购买现成的微流控细胞。6,15,16,17构建流动池所用的最佳材料必须具备机械刚性，光学透明且荧光背景低，并能耐受有机溶剂。6通常使用硼硅酸盐浮法玻璃或熔融石英，以提供稳定的流动环境，适用于长时间的光镊操作、成像和力检测。这些材料还允许使用非水溶剂（例如.，光谱纯甲醇）以简化表面润湿并去除气泡，以及变性剂（例如.，6M 盐酸胍）或去垢剂清洗流路池。最后，将液体引入流路池的方法也各不相同，从复杂的真空泵系统到单个注射泵均可使用14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 在此处描述的方法中，使用可容纳多达10个注射器的注射泵（图 3A）。这使得可灵活使用单通道流体池或具有多个进样通道的流体池。此处采用三通道流体池，并通过聚醚醚酮（PEEK）管路将其连接至固定在注射泵上的注射器图 3A-C）。流体的流动由四通切换阀控制，从而有助于将气泡引入流动池的风险降至最低（图3A，D此外，建议使用哈密尔顿（Hamilton）气密性注射器，其具有坚固的玻璃管壁和聚四氟乙烯（PTFE）涂层的推杆，可提供极为顺滑的推杆运动，这对于实现平稳的流体流动至关重要14,27.
在所述的实验系统中，使用了具有两到五个进样通道的流动池。进样通道的数量取决于所进行的实验。在对RecBCD和Hop2-Mnd1的研究中，两个流道已足够14,28。对于解旋酶实验，将酶结合到DNA的游离末端，然后将其移入含有镁离子和ATP的流道中，以启动易位和解链过程。对于Hop2-Mnd1实验，将光镊捕获的DNA移入相邻的、含有蛋白质和缓冲液（±二价金属离子）的流道中。使用三通道流动池可实现将DNA在流道1中捕获，随后将其移入流道2以允许蛋白质结合，再移入流道3（例如含有ATP的流道）以启动反应。上述方法的一种变体是在通道2中使用荧光标记的蛋白质，这会导致流道完全发白，从而无法观察DNA。当该分子被移入流道3时，反应启动后即可同时观察到蛋白质和DNA。
使用四通切换阀控制流体流动是该系统中消除流动池内气泡的关键组成部分。气泡会以不可预测的方式收缩和膨胀，导致流速快速变化并引发湍流，从而对稳定的流体流动产生不利影响。当阀门位于注射器和入口管路之间时，在更换注射器时通过切换阀门位置来断开流路。当安装新的注射器后，可手动按压其推杆，使排出量超过&#62;6 μL（即阀门的死体积），从而几乎完全消除气泡。
将接头连接到流动池上通常是流动池使用过程中的限速步骤。我们介绍了两种类型接头的使用方法：一种是可拆卸的压合式接头，另一种是永久性接头（即纳米端口组件）。可拆卸接头易于粘接到流动池上，并且除了推荐的聚四氟乙烯（PTFE）管外，还可用于测试多种类型的柔性管路。这种方法快速且经济，可在不损耗更昂贵的玻璃流动池的情况下测试不同管路和接头。相比之下，纳米端口组件为永久性连接，可耐受高达1,000 psi的压力，且据我们经验，其仅适用于不同直径的聚醚醚酮（PEEK）管路。这并非缺点，因为PEEK管路通常是首选。一个带有永久性组件的玻璃流动池，在小心使用的情况下，可重复使用超过一年。

<table><tbody><tr><td>100倍物镜</td><td>Leica</td><td>506318 或 506038</td><td>油浸镜头；仅用于成像和光镊；专为荧光成像优化的 Plan APO 物镜</td></tr><tr><td>10倍物镜</td><td>Leica</td><td>506263</td><td>用于在准直过程中定位激光光斑；用于在流动池中寻找焦平面和 X-Y 位置</td></tr><tr><td>1 mm 荧光微珠</td><td>Bangs Labs</td><td>FSDG004</td><td>用于光镊性能测试、焦平面位置确定</td></tr><tr><td>1 mm 聚苯乙烯微珠</td><td>Bangs Labs</td><td>CPO1004</td><td>用于光镊性能评估以及与生物素化分子的结合</td></tr><tr><td>63倍物镜</td><td>Leica</td><td>506081</td><td>用于在准直过程中定位激光光斑，以及在流动池中寻找焦平面和 X-Y 位置；也可用于光镊，因其后孔径直径与 100倍物镜相同；油浸镜头</td></tr><tr><td>准直激光器</td><td>Lumentum</td><td>1100 系列</td><td>10 mW 氦氖激光器，肉眼可见，用于光学元件的定位</td></tr><tr><td>光束准直相机</td><td>Amscope</td><td>MU303</td><td>一种简单、低成本且由软件控制的相机，用于成像光束位置</td></tr><tr><td>相机控制与图像采集软件</td><td>Hamamatsu</td><td>HCImage</td><td>协调 Lambda DG4 与相机的活动，以实现快速波长切换</td></tr><tr><td>相机；Orca flash 4</td><td>Hamamatsu</td><td>c13440-20cu</td><td>用于单分子实验成像的 CCD 相机</td></tr><tr><td>光束准直相机的 C 接口</td><td>Spot imaging solutions</td><td>DE50CMT</td><td>为相机提供最佳定位，以便在准直过程中成像激光光束</td></tr><tr><td>Orca Flash 4 相机的 C 接口</td><td></td><td></td><td>带有固定环，用于固定红外阻断滤光片。可消除光镊中反射的红外光束，有助于更清晰地成像被捕获物体</td></tr><tr><td>Cy5&amp;nbsp; 荧光滤光立方体</td><td>Semrock</td><td>cy5-404a-lsc-zero</td><td>与 Lambda DG4 配合使用，仅用于成像 Cy5</td></tr><tr><td>Fitc-Txred&amp;nbsp; 荧光滤光立方体</td><td>Semrock</td><td>fitc/txred-2x-b-000</td><td>与 Lambda DG4 配合使用，用于成像 FITC 和 TXRed</td></tr><tr><td>流体管路</td><td>Grace Bio</td><td>46004</td><td>作为 PEEK 的替代材料的 PTFE 管路；适用于某些流动池。当使用 Grace Bio 的适配管路连接器时，可用于 PDMS 流动池或玻璃流动池</td></tr><tr><td>GFP 荧光滤光立方体</td><td>Semrock</td><td>gfp-3035b-lsc-zero</td><td>与 Lambda DG4 配合使用，仅用于成像 GFP</td></tr><tr><td>玻璃流动池</td><td>Translume</td><td>定制</td><td>透明流道，用于成像（图 2E）</td></tr><tr><td>玻璃胶</td><td>Loctite</td><td>233841</td><td>可牢固且方便地将 Nanoport 组件粘接到玻璃流动池上</td></tr><tr><td>玻璃/PDMS 夹层流动池</td><td>CIDRA Precision services</td><td>定制设计</td><td>根据您的规格制造的流动池；成像通道透明（图 2C）</td></tr><tr><td>Hamilton 清洗液</td><td>Hamilton</td><td>18311</td><td>温和但高效的玻璃流动池清洗液；小心使用时不会产生气泡</td></tr><tr><td>照明系统</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lamda DG4</td><td>已停产，建议使用 Lambda 721</td></tr><tr><td>照明系统</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lamda DG4</td><td>已停产，建议使用 Lambda 721</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Media cybernetics</td><td>Image Pro Premiere</td><td>用于图像分析和单分子追踪</td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Fiji/NIH Image/Image J</td><td>共享软件</td><td>用于图像分析和单分子追踪</td></tr><tr><td>图像显示卡</td><td>Melles Griot</td><td>06 DLA 001</td><td>Thorlabs 的替代产品：VRC5</td></tr><tr><td>浸油</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td>Immersol 518 F，无荧光</td></tr><tr><td>激光光束准直工具</td><td>Thor labs</td><td>FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1&amp;nbsp;</td><td>用于确保光束水平且处于正确高度</td></tr><tr><td>激光光束观察仪</td><td>Canadian Photonics labs</td><td>IR 3150</td><td>用于成像镜子和&amp;nbsp;目标上的红外光斑</td></tr><tr><td>激光功率计</td><td>Thor labs</td><td></td><td>用于测量激光输出功率以及光镊强度</td></tr><tr><td>激光安全眼镜（HeNe）</td><td>Thor labs</td><td>LG7 或 8</td><td>可阻挡 &gt;3 OD 单位、波长 &gt;600 nm 的光</td></tr><tr><td>激光安全眼镜（红外）</td><td>Thor labs</td><td>LG11</td><td>可阻挡 &gt;7 OD 单位、波长 &amp;sup3;1000 nm 的光</td></tr><tr><td>mcherry&amp;nbsp; 荧光滤光立方体</td><td>Semrock</td><td>mcherry-a-lsc-zero</td><td>与 Lambda DG4 配合使用，仅用于成像 mcherry</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>DMIRE2</td><td>移除了微分干涉（DIC）端口，以容纳双色光镊/准直镜</td></tr><tr><td>显微镜控制软件&amp;nbsp;</td><td>UCSF/共享软件</td><td>uManager</td><td>控制显微镜，允许物镜的焦准直以及载物台控制</td></tr><tr><td>Nanoport 组件</td><td>IDEX</td><td>N333</td><td>粘接到流动池上的连接器</td></tr><tr><td>光学平台支撑</td><td>Thor Labs</td><td>PA52502</td><td>主动隔振平台支撑</td></tr><tr><td>光学元件和透镜</td><td>Solar TII</td><td>多种</td><td>为系统定制设计的干涉镜、望远镜和透镜</td></tr><tr><td>PDMS 流动池</td><td>ufluidix</td><td>定制</td><td>根据您的规格制造的流动池；成像通道透明（图 2B 和 D）</td></tr><tr><td>PEEK 管路</td><td>IDEX</td><td>1532</td><td>为流动池和切换阀提供优异的连接</td></tr><tr><td>Pinkel 荧光滤光立方体</td><td>Semrock</td><td>lf488/543/635-3x-a-000</td><td>与 Lambda DG4 配合使用，用于快速成像多种荧光染料</td></tr><tr><td>压接式管路连接器</td><td>GraceBio</td><td>46003</td><td>透明硅胶连接器，带有可牢固粘接玻璃的粘合剂</td></tr><tr><td>扫描镜</td><td>GSI Lumonics</td><td>VM500</td><td>用于控制第二个光镊。GSI Lumonics 已不存在。类似镜片可从 Cambridge Scientific 购买</td></tr><tr><td>载物台</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载物台测微尺</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>68042-08</td><td>提供屏幕标尺，用于光束定位和系统校准</td></tr><tr><td>切换阀</td><td>IDEX</td><td>V-101T</td><td>控制流体流向，并防止气泡进入流动池</td></tr><tr><td>注射器与阀体歧管</td><td>机械加工车间</td><td>无</td><td>定制制造</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>控制流经流动池的流体流动</td></tr><tr><td>注射泵软件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>&lt;strong&gt;70-6000&lt;/strong&gt;</td><td>流量控制提供无缝、可编程的流体流动控制</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td>气密性、PTFE 鲁尔锁、玻璃筒体带聚四氟乙烯涂层活塞</td></tr><tr><td>桌面平台</td><td>Thor Labs</td><td>T36H</td><td>光学桌面或面包板</td></tr><tr><td>光镊激光器</td><td>Newport/Spectra Physics</td><td>J系列；BL106C</td><td>Nd:YAG 激光器；1064 nm；5 W 激光器</td></tr></tbody></table>

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

可视化生物化学是一种强大的技术，可用于观察单个酶或酶复合物的随机特性，这些特性在传统体相实验的平均效应中往往被掩盖。为了实现可视化，将双光镊系统（其中一个光阱固定，另一个可移动）聚焦到置于倒置荧光显微镜载物台上的多通道微流控芯片的一个通道中。光镊捕获荧光标记的单个DNA分子，当液体流经芯片并经过被捕获的微珠时，在极小的作用力（即0 pN）下将DNA拉伸至B型构象，核酸在黑色背景上呈现为一条白色细线。通过将载物台沿垂直于液流方向移动，可将DNA分子从一个液流切换至另一个液流，从而以受控方式启动反应。为确保实验成功，需将具有光学透明通道的微流控装置与固定在注射泵中的玻璃注射器连接。最佳实验效果依赖于永久键合在流动池上的接头、机械刚性强且化学性质稳定的管路，以及可消除气泡的切换阀，以避免破坏层流状态。

首先使用1 μm的非荧光聚苯乙烯微球对光阱的对准和捕获力进行初步测试。由于实验室中的大多数研究涉及荧光检测，我们进一步采用1 μm的Dragon green荧光聚苯乙烯微球来测试光阱强度（图1D、E）。随后实验转为对DNA-微球复合物进行光镊捕获，其中DNA使用双嵌入染料YOYO-1进行染色14,29。当这些复合物在微流控流动池中被捕获于盖玻片表面以上10–15 μm处时，流体流动会使微球周围的DNA被拉伸展开（图3B、C）。测量流体拉伸后DNA的长度至关重要，以确保其被拉伸至B型构象的预期长度。例如，λ噬菌体DNA的完整长度略长于16 μm，对应48,504个碱基对14。
为了表征流体流动，将荧光微珠引入流动池中，并在盖玻片表面以上...

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。

可视化生物化学是一种强大的技术，可用于观察单个酶或酶复合物的随机特性，而这些特性在整体实验中往往被掩盖……

将端口连接至带有管路的注射器至关重要，因为正确操作时不会发生泄漏，流式池中不会产生气泡，并且在小心使用的情况下，可在长达一年的时间内重复使用同一个流式池进行实验。本文将介绍两种将连接器安装到流式池上的简单方法。这些方法操作简便、可重复性强，且使研究人员能够轻松根据自身需求对流式池进行适配，而无需过多麻烦。这些流动池的设计初衷是用于单分子实验，特别是我们称之为可视化生物化学的研究，但它们也可应用于任何需要微流控技术以及层流流体条件的研究场景。因此，为了避免失误，建议不要一开始就使用宝贵的流动池来建立实验技术，而是先在载玻片或盖玻片上进行练习。这将帮助操作者熟悉玻璃或聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料的特性，了解如何正确操作，以及在插入管路或连接接头时应施加多大的力。此过程可能需要损耗一些接头，但它们的成本远低于流动池。首先，将流动池放置在干净、平整的表面上。用镊子夹住聚四氟乙烯管自由端前3毫米处，将管子推入端口。对剩余的每个端口重复此操作。将入口端口连接至注射泵，出口连接至废液瓶。用一毫升分光光度级甲醇填充每个玻璃注射器，并将其连接至切换阀。确保阀的出口朝向废液端，用50微升甲醇冲洗每条管路。将出口位置切换至流通池，并以每小时100微升的流速向流通池泵入800微升甲醇，以润湿表面并排除气泡。第二天，使用 800 微升超纯水重复此过程。流动池现在已准备就绪，可供使用。如果使用压合式管路连接器，请小心地从连接器一侧移除胶带，并将其放置在显微镜载玻片的孔上。按压数秒钟。对剩余的连接器重复此操作。然后将流路池放置在干净的平面上。握住聚四氟乙烯管，使其自由端露出3毫米，然后将管子推入端口的孔中。对剩余的每个端口重复此操作。将进样口的管路连接至切换阀。将附件置于洁净的平面或定制的流体池固定装置上，以在粘合过程中固定流体池和连接件。将流体池放置在固定装置的凹槽部分，然后在组件底部涂抹少量玻璃胶，插入密封圈。将纳米进样口对准载玻片上的一个进样孔。轻轻下压并固定，避免横向移动。对剩余的端口重复此操作。让其自然干燥，或在多通阀上夹紧固定。轻轻将流路池从管路系统中取出，并确保组件与流路池的入口端口良好对齐。将流路池放置在显微镜载物台上，使用手指拧紧接头连接管路。每个玻璃注射器中加入一毫升光谱纯级甲醇。将每个注射器连接至切换阀。确保阀门出口指向废液端，用50 µL甲醇冲洗每条管路。将出口位置切换至流通池，并以100 µL/h的流速向流通池中泵入800 µL甲醇。第二天，使用 800 微升超纯水重复此过程。此处显示了输出功率的测量。在将激光头安装到光学系统之前，需测量激光器的输出功率。完成光阱对准后，使用100倍物镜对每个光阱测量光束功率。图像展示了一微米荧光微珠的稳定光学捕获。其中F为固定光阱，M为可移动光阱。移动光阱以30赫兹的频率在小圆或大圆路径上扫描。流动池内的流体流动呈层流状态。示意图从顶部展示流动池结构，以说明通道间的扩散是相邻流体流之间混合的主要来源。蓝色箭头表示流动方向，各股流体分别显示为白色、浅灰色和白色。通道间横向扩散的扩展区域以红色标示。插图显示了相邻流体流在10倍放大下的荧光图像，其中下部流体流含有荧光标记的DNA-微珠复合物，上部流体流仅含缓冲液。上游的白色斑点是CCD相机产生的散粒噪声。流速分布和层流细胞呈抛物线形。流室从侧面观察，每个细胞上方标示了流动方向。线性珠粒流速受泵速和蔗糖浓度影响。溶液黏度影响作用于珠粒的阻力。在流动条件下，珠粒直径会影响作用于珠粒的力。进行该操作时，请确保工作区域洁净，并已使用光谱级甲醇或丙酮清洁玻璃表面。此时，您应已将流动池连接至注射泵，接下来即可引入溶液并开始光镊实验。流动池的使用可延长实验时间，使研究人员能够研究多种单分子反应，包括测量受力、通过荧光观察反应过程，或同时结合这两种方法。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用双光镊和微流体进行单分子研究

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