突触膜微移植以重激活人突触受体用于功能研究

神经退行性疾病和精神健康障碍源于突触通讯的改变。多种因素共同作用，以我们尚未完全理解的方式改变突触受体。突触膜微移植技术为研究这些改变提供了重要见解。

该技术的主要优势在于能够记录人类大脑中天然脑受体的活动，从而真实反映我们所研究的疾病状态。突触受体是调节大脑电活动药物的重要靶点，通过深入理解这些受体的变化机制，有望开发出恢复其功能的更优治疗方案。该方法已成功应用于多种物种，包括昆虫、鱼类和哺乳动物，同时也可应用于脑外的膜受体，例如肌肉和肿瘤中的受体。

可能性很多。修剪注射针非常关键：太细可能导致无法注射蛋白，而太粗则可能杀死细胞。

使用一致的测量方法会有所帮助，例如使用剃须刀片的边缘。将从人脑特定区域制备的选定样本置于浮有湿冰的水浴中，超声处理三次，每次持续五秒，两次超声之间在湿冰上间隔一分钟。

取一微升样品置于热塑性材料上，必要时可在放置样品前于表面压出凹痕，以防止样品移动。使用操纵器上的旋钮调整纳米注射针的位置，并将其移向样品以进行吸样。当针尖进入样品后，按住填充按钮，直至吸入足够的样品量。

每10个卵母细胞需要约0.5 µL样品。使用旋钮将纳米注射器的针头移回最高位置。用针头刺入卵母细胞表面下方，不可过深，然后使用脚踏板注入样品。

等待约两到三秒。注射成功后，细胞将膨胀。使用操纵器上的旋钮退出细胞。

移动培养皿，使下一个卵母细胞与针头对齐。重复此过程，直至培养皿中达到所需注射数量的卵母细胞，然后将纳米注射器缩回至原始位置并移除针头。确保留出一孔未注射的卵母细胞作为对照。

开启所有用于记录离子电流的设备，然后启动台式计算机，登录 WinEDR 3.9.1 版本。确保程序正常运行，并将记录设置为磁盘模式。随后，设置记录时长，并取消选中 Simulator 选项。

对于电压电极部分，关闭负电容补偿。将浴电极部分的增益选择开关设置为10，然后将用于选择增益倍率的三档拨动开关设置为×1。LED灯将指示所选的增益倍率。

关闭钳制模式选择器，将直流增益控制置于“in”位置，并将增益控制设置为接近全带宽开环的一半。将指令设为40毫伏，保持控制设为负，量程倍增器设为×2。对于电流电极，在穿刺卵母细胞之前，使用VE偏移建立零参考。

接下来，打开 WinEDR 3.9.1 版本软件，进入顶部菜单，依次选择“文件”（File）和“新建”（New）。创建自己的文件夹并保存文件。在主菜单中，选择“记录”（Record），然后选择“记录到磁盘”（Record to Disk）。

将琼脂盐桥放入记录室后方相应的圆形孔中，连接记录室内用作接地参考电极的电极孔。向相应的灌流阀中加入1×任氏工作液。打开阀门，直至记录室充满任氏溶液。

使用左右操纵器夹持电极，将电极针引导至充满任氏液的记录室中。通过将电压表（VM）和电极电压（VE）调零旋钮归零，然后按下电极测试按钮，检查每个电极的电阻。电阻值应在0.5至3兆欧之间。

如果电阻超出范围，则使用新的微电极进行更换。接着，用新鲜的林格溶液填充记录室。用玻璃移液管将未注射或显微移植的卵母细胞置于记录室的中央。

在显微镜下确保卵母细胞清晰可见，且动物极朝上。将电极引导至林格氏液中，直至接触卵母细胞膜。用两根电极轻轻刺破动物极一侧的卵母细胞膜，并记录静息膜电位。

打开林格氏液的流动。使用卵母细胞电压钳制放大器，将模式切换至慢速电压钳制，并将钳制电压设置为 80 毫伏。监视器上的电流应为负值，通常在 0 至 0.4 微安之间。

转到“文件”，选择“新建”，然后在软件中保存录音以创建新文件，并保存该录音。按“录制”按钮，随后按“录制到光盘”以开始录音。使用“标记图表”对话框向文件中添加相关信息。

通过打开阀门将激动剂灌注到记录室中，进行化学刺激，持续15秒。记录完成后，将电压钳调至关闭位置，并关闭任氏液阀门。取出卵母细胞，根据机构关于人脑样本的处理政策予以丢弃，然后停止记录并保存文件。

将录音文件副本保存至U盘。随后，打开需要分析的文件。为测量AMPA最大反应和GABA A峰值反应，首先通过找到红线来确定零电平或基线，然后将其拖动至林格液应用所产生的电流处或基线位置。

一旦确定零电平，通过将绿色垂直读数光标拖动至图谱轨迹的所需位置来确定反应测量值。记录了注射了人突触受体膜的卵母细胞的离子电流。AMPA受体由100微摩尔红藻氨酸激活，GABA A受体由1毫摩尔GABA激活。

将富含乙酰胆碱受体的电鳐电器官滤过膜与编码 GABA A 型受体的 cDNA 共同注射到动物极后，根据卵母细胞的反应主要形成两组。一组卵母细胞对乙酰胆碱反应强烈，但对 1 微摩尔 GABA 无反应；另一组卵母细胞对乙酰胆碱无反应或反应微弱，但对 GABA 反应强烈。

图示显示了第一组和第二组峰值电流的均值加减标准误。第二组中的一个卵母细胞对GABA和乙酰胆碱表现出较强的反应，提示细胞核可能已破裂。因此，反应分布偏向较低值，这可通过膜电流分布的均值与中位数之间的差异看出。

卵母细胞反应性低的原因之一是膜被注射并滞留在卵母细胞的细胞核内。此处展示了将来自非阿尔茨海默病（非AD）脑组织和AD脑组织的未过滤膜分别注射到卵母细胞动物极或植物极后，卵母细胞对GABA和红藻氨酸的反应情况。未靶向细胞核而靠近动物极注射的卵母细胞产生的反应大于在植物极注射的卵母细胞，因此该方法可用于研究受体数量极少的组织样本。

进行该操作时，务必始终监测林格液的液位。往往在关键记录过程中液体会耗尽，这将影响实验结果，导致卵母细胞死亡以及珍贵数据的丢失。完成该操作后，我们可以进行Western印迹检测，以验证突触受体或目的蛋白的存在。

它能够测量不同脑区以及不同脑部疾病中的总体兴奋性与抑制性突触比率，从而对有关疾病成因的理论预测进行直接检验。