药物处理后对肿瘤聚集体内区域细胞密度的无损评估

本方案以非破坏性方式提供肿瘤模型进展的相关信息。此外，它能够在单个聚集体内全程监测药物治疗方案的疗效反应，而无需依赖年龄匹配的样本。传统方法获取聚集体内细胞密度和活性时，需要对样本进行固定和切片处理，而我们的方法则可非破坏性地提供数据。

因此，可以随时间推移追踪单个聚集体内的变化。该技术有望加深我们对聚集体模型中特定区域药物反应的理解，进而影响这些模型对体内反应的模拟效果以及药物筛选应用的准确性。首先，在标准条件下培养所需细胞系，使其达到70%至90%的融合度。

按照标准的胰蛋白酶消化法将细胞单层从培养瓶中分离，并将细胞悬液加入离心管中。取10 µL细胞悬液加入血细胞计数板，通过显微镜计数以确定悬液中的细胞数量。通过离心沉淀细胞，并将细胞重悬于培养基中，调整至所需浓度（2.5 × 10⁵ 个细胞/毫升）。

对于使用基底膜基质制备的悬浮液，将基质小瓶从零下20摄氏度的储存环境中取出，并置于冰箱中过夜解冻。准备一个含有生长培养基的容器，并将其冷藏10分钟以预冷。使用预冷的移液枪头将基质加入已冷却的培养基中，使该溶液中基质的终浓度为5%。随后，将50微升该培养基加入至圆底、非黏附性96孔板的每孔中，以便在加入细胞悬液后，这些孔中基质的终浓度为2.5%。

对于未添加基质制备的悬浮液，向每个孔中加入50微升普通培养基。将50微升细胞悬液分配至每个孔中。接种后立即在室温下以123 G离心10分钟，以确保每个孔底部形成细胞沉淀。

使用OCT系统进行结构成像。将A扫描速率设置为5.5千赫兹，以实现高分辨率图像采集。对于液体介质中的样本，将折射率设置为1.33。

在屏幕右侧的图像参数窗口中，通过输入 X、Y 和 Z 值来设置视野范围，使样品位于该兴趣区域内。单击 3D Acquisition Mode，然后单击 Record 以采集样品的三维体积扫描图像。要进行体积重建，请打开 Imaris 软件，并在其工作区中导航至已转换的 TIF 文件。

转到“编辑”，然后点击“图像属性”，将OCT图像的体素大小输入对应的XYZ框中。接着点击“确定”。在对象树上方点击“添加新表面”。在树下方的菜单中，点击“跳过自动创建”并手动编辑。

在显示调整窗口中，手动拖动红色和黑色箭头，以增强样本与背景之间的对比度，改善样本的可视化效果。将切片位置调整至样本边缘处的切片。按下 Esc 键将鼠标从导航模式切换为选择模式，然后点击“绘制”。

手动描记显示信号区域的轮廓。通过在输入框中输入下一个位置来推进切片位置。下一个位置应比前一个位置在样品中最多前进不超过100个切片。

手动勾画出显示信号的区域。沿样本厚度方向重复此步骤，直至到达样本的对侧边缘。然后点击左侧菜单中的“Create Surface”以将这些切片拼接在一起。

最后，单击“编辑”，然后单击“遮罩选定区域”，再单击“确定”以完成体积重建。为获得样本的总细胞密度，请选择“添加新斑点”。在算法设置菜单中，取消选中所有复选框。

单击蓝色箭头进入源通道界面。从出现的下拉菜单中选择“掩膜通道”。在XY直径框中输入样品的平均细胞直径。

确保已勾选背景减除。点击蓝色箭头进入斑点分类界面。在菜单底部的图表中，点击并拖动黄色阈值的左边缘至图表的左边缘，使所有对象均包含在黄色阴影阈值范围内。

然后点击绿色箭头以完成斑点创建。通过点击“统计”获取识别出的对象数量，然后点击“总体”，最后点击“斑点总数”。

单击创建的表面，然后转到表面样式质量选项卡。将选择更改为中心点，并将像素宽度更改为小于或等于 20 以获得最佳可见性。转到统计信息。

然后点击“详细信息”，接着选择“位置”，并记录中心点的坐标。从对象树上方的菜单中选择“添加新参考框架”。在菜单中，勾选X、Y旁边的“可见”和“固定”复选框。

单击并拖动参考坐标系图标的中心，使其与中心点对齐。取消选中 XY 可见和固定选项，然后选中 XZ 的对应选项。再次单击并拖动参考坐标系图标的中心，使其与中心点对齐。最后，对 YZ 平面重复此操作，交替在这三个固定平面之间切换，直到参考坐标系与中心点完全对齐。

在对象树中双击参考坐标系，将其重命名为“center”或类似名称。单击生成的斑点，进入“Statistics”（统计）选项，然后点击“Detailed”（详细信息），接着选择“Position Reference Frame”（位置参考坐标系）。

单击位置 X 参考帧，直到其按从高到低的顺序排列。记录最高值以获得聚集体的半径。进行手动计算以确定其他感兴趣的位置。

为此，将 X 中心值增加 100 微米，然后使用中心点的 Y 和 Z 值来定义中心轴上的第一个位置。选择“添加新点”。然后选择“跳过自动创建，手动编辑”。

按住键盘上的 Shift 键，然后在屏幕上的任意位置单击以放置一个新的标记点。输入第一个感兴趣位置的 XYZ 坐标值。然后选择“添加新参考框架”并将其对准该标记点。

在每个连续的 X 位置添加 100 微米。将最后一个参考帧放置在距离样品外半径小于等于 50 微米的位置。单击创建的点并导航至统计。

在菜单的右下角，点击“导出所有统计结果到文件”，并将数据保存到电子表格中。打开该电子表格，切换到“距原点距离参考帧”工作表。

使用 mod 函数将每个距离数值分配到其对应的参考帧中。筛选此列中的数值，以处理每个参考帧中的距离。对于每个参考帧，使用 COUNTIF 函数计算位于该帧 50 微米范围内的对象数量。

所得数值对应于该区域凝胶段中的细胞数量。将该数值除以100微米凝胶段的体积，即可获得细胞密度。Student T检验显示，在MDA-MB-231类球体模型中，类球体核心区域的细胞密度显著高于过渡层和外层。

结果表明，该类球体核心在四天后出现致密化现象。在 AU565 和 MDA-MB-231 两种聚集体模型中，添加基质似乎未影响类球体的体积或细胞数量，因此对细胞增殖的影响可忽略不计。相反，基质的添加似乎重新分布了细胞密度，促进核心显著致密化，同时降低了外层的细胞密度。

这些研究结果为基质在不同乳腺癌细胞系中促进细胞聚集的物理机制提供了宝贵的见解。接下来，针对使用基质制备的AU565肿瘤类球体，将成熟的细胞聚集体用曲妥珠单抗处理，并通过为期五天的给药方案评估局部细胞密度。在整个聚集体厚度方向上，每隔100 µm设置一个检测点。

在每个聚集体内部500微米范围内，随时间推移观察到细胞密度仅有轻微波动，表明细胞死亡极少。细胞死亡主要出现在肿瘤球状体的外层，这一可视化结果提示药物反应，与曲妥珠单抗的药物渗透问题一致。现在，我们可以在不破坏结构的情况下无损地测量聚集体中的细胞活力。

这使得能够评估单个肿瘤聚集体对药物的长期反应，以确定候选抗癌药物的时间效应和穿透特性。