Name: 厌氧菌小鼠阴道定植模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学习厌氧菌小鼠阴道定植模型，用于研究女性生殖道中的厌氧细菌感染。本方法以Gardnerella vaginalis为重点，提供阴道接种和细菌回收的详细操作指南，帮助科研人员深入理解相关病原体的生物学特性与致病机制。

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我们感谢Lynne Foster在这些模型开发过程中提供的技术协助。感谢分子微生物学系和女性传染病研究中⼼（资助对象：AL）以及美国出生缺陷基金会（Basil O'Connor 奖项，授予AL）提供的启动资金，这些资金支持了早期实验的开展。美国过敏与传染病研究所（R01 AI114635）也资助了&#160;这些模型的开发工作。

所有动物实验均经批准，并依照加州大学圣地亚哥分校（UCSD，方案编号：S20057，2020年至今）以及此前在圣路易斯华盛顿大学（方案编号：20110149，至2020年）的机构指南和《实验动物护理与使用指南》进行。
注意：以下方案使用常规饲养的雌性 C57Bl/6 小鼠，在接种时年龄为 6-11 周。请注意相关引用文献中先前使用的供应商信息和具体年龄范围。
1. β-雌二醇-17-戊酸酯的制备与给药
注意：β-雌二醇-17-戊酸酯是一种可通过皮肤吸收的致癌物和生殖毒素27,28。在操作粉末和液体溶液时，应穿戴适当的个人防护装备。该物质 also 是一种水生毒素29；应将其妥善弃置于密封良好并正确标识的容器中。
<ol>
	<li>使用50 mL锥形管真空过滤系统，通过0.22 µm滤膜对最多50 mL芝麻油进行过滤除菌。操作仅可在生物安全柜内打开，以维持无菌状态。</li>
	<li>计算实验所需β-雌二醇戊酸酯溶液的体积：每只小鼠200 µL，另加2–3 mL以补偿注射器填充过程中的样品损失（例如，10只小鼠的实验共需4 mL）。计算配制5 mg/mL溶液所需的β-雌二醇戊酸酯量，并直接称量至14 mL圆底管中。</li>
	<li>将14 mL管盖紧后涡旋振荡，以打散粉末中的结块（这有助于β-雌二醇戊酸酯更快溶解）。向14 mL管中加入经除菌过滤的芝麻油，使β-雌二醇戊酸酯终浓度为5 mg/mL。</li>
	<li>将盖紧的14 mL管置于37 °C旋转仪上孵育30–40分钟，直至固体粉末完全溶解。注射前需肉眼确认溶液均匀。37 °C孵育可降低芝麻油的黏度，使其更易于注射。</li>
	<li>将β-雌二醇戊酸酯溶液吸入1 mL注射器（不带针头）。为避免引入气泡，先吸入少量溶液，然后在保持注射器尖端浸入芝麻油中的情况下轻轻排出。再缓慢重新吸入溶液，略超过100 µL刻度。</li>
	<li>将25 G × 5/8 in针头安装到注射器上。随后缓慢排出芝麻油溶液以润洗针头，直至液体从针尖流出。排液至注射器刻度为100 µL。每只小鼠准备一支注射器。</li>
	<li>在接种前48 h或72 h，通过腹腔注射给予β-雌二醇17-戊酸酯。每只小鼠注射100 µL 5 mg/mL β-雌二醇戊酸酯溶液（即0.5 mg β-雌二醇戊酸酯/小鼠），操作如前所述22,30。剩余溶液于4 °C保存，最多72 h，用于下一次注射。</li>
	<li>在接种当天，于小鼠阴道接种前立即再次给予β-雌二醇戊酸酯溶液。将溶液从4 °C取出，置于37 °C旋转仪上孵育30分钟，使芝麻油升温并降低黏度。随后按步骤1.7所述进行注射。</li>
</ol>
2. 接种物的制备
注意：本节包含从厌氧培养的链霉素抗性&#160;Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR24,25,31,32制备接种物的一般步骤。本节所有操作均应在厌氧舱内进行。
<ol>
	<li>将所有试剂（包括配制好的NYC III肉汤、琼脂和PBS）放入厌氧室中，至少平衡24小时后再使用。 
	注意：此处使用的是以5%氢气混合气体平衡的乙烯厌氧室。室内氧气浓度通常维持在0 ppm，但在将物品转入转出厌氧室时，可能会出现短暂的低水平上升（10–25 ppm）。</li>
	<li>在阴道接种前两天，在厌氧室中将冻存的甘油菌种中的Gardnerella划线接种至NYC III琼脂平板上。在转移过程中，使用装有干冰的小容器（如空的移液枪头盒）保持甘油菌种处于冷冻状态。</li>
	<li>在阴道接种前一天，取平板上5–10个单独的Gardnerella菌落接种至10 mL NYC III肉汤中，于37 °C培养16小时（过夜）。同时设置一份未接种的1 mL培养基作为对照，与接种样本一同孵育，以确认培养基无污染。</li>
	<li>按以下步骤从液体培养物制备接种物。尽可能在厌氧室内完成接种物的制备。
	<ol>
		<li>测定培养物的光密度（OD）：取200 µL培养物加入800 µL新鲜培养基中，置于1.5 mL比色皿中（1:5稀释）。使用分光光度计在600 nm波长下测定稀释后培养物的光密度（OD），以另一只仅含新鲜培养基的比色皿作为空白对照。将测得的OD值乘以5，得到16小时培养物的实际OD600值。</li>
		<li>计算实验所需的接种物体积。例如，若需为15只小鼠每只接种20 µL，则共需15 × 20 µL = 300 µL接种物。建议额外多准备约25%，即为15只小鼠准备300 µL + (0.25 × 300 µL) = 375 µL接种物。</li>
		<li>根据步骤2.4.1测得的OD600值，计算需要离心并重悬的16小时培养物体积，以获得OD600 = 5.0的接种物，并使其最终体积等于步骤2.4.2中计算出的接种物体积。例如，若培养物的OD600为1.5，所需接种物体积为375 µL，则需离心的培养物体积为(375 µL × 5)/1.5 = 1250 µL。</li>
		<li>用移液器吸取步骤2.4.3计算出的培养物体积，转移至无菌微量离心管中，于16,000 × g离心1–3分钟，使细菌沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，并将沉淀用厌氧PBS重悬至步骤2.4.2中计算出的体积，所得接种物的OD600即为5.0。如需，另准备一管PBS作为未感染对照组小鼠的载体对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将接种物管从厌氧室取出前，用PBS制备从1:10至1:10&#160;× 106&#160;的系列稀释液。使用多通道移液器将每个稀释度取5个重复点样于琼脂平板上，以测定接种物的菌落形成单位（CFU）。此为接种前CFU。</li>
</ol>
3. 阴道预冲洗及接种 Gardnerella
<ol>
	<li>在厌氧环境中准备阴道灌洗/冲洗管（此步骤可与步骤2.4中的接种物制备同时进行）。将70 µL无菌厌氧PBS加入已标记小鼠编号的1.5 mL微量离心管中。每只小鼠准备一根冲洗管。将管子盖紧后移出厌氧环境。</li>
	<li>使用步骤3.1中为各小鼠准备的试管中的50 µL厌氧PBS对每只小鼠进行阴道灌洗。这些阴道灌洗液为接种前的冲洗样本，可用于后续检测与分析。
	<ol>
		<li>在第二次注射β-雌二醇戊酸酯后（步骤1.8），将每只小鼠置于笼子顶部或清洁坚硬的表面上，使其前肢能够抓握。轻轻握住尾巴中段并提起，使后躯略微抬高，暴露阴道开口。</li>
		<li>使用移液器和P-200滤芯吸头，从对应小鼠的冲洗管中吸取50 µL PBS。将吸头轻轻插入阴道腔约2–3 mm，轻柔地将50 µL液体吹吸3–4次。</li>
		<li>将收集的灌洗液（约50 µL）重新转移回其来源的同一冲洗管中，在仍含有剩余20 µL PBS的管中上下吹打混匀。若存在过多黏液导致吸头堵塞，可更换新的P-200吸头收集残留物质，并放入同一冲洗管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将20 µL浓缩细菌悬液或对照载体经阴道接种至每只小鼠的阴道内。每只小鼠完成阴道灌洗后应立即进行接种（即对每只小鼠依次完成灌洗和接种操作后再进行下一只）。为简化操作，建议使用两支P200移液器：一支设定为50 µL用于灌洗，另一支设定为20 µL用于接种。
	<ol>
		<li>按照步骤3.2.1所述方式固定小鼠。使用P-200吸头将20 µL细菌悬液注入阴道。在进行两种不同细菌种类/菌株共接种实验时，每种细菌悬液各使用10 µL，并避免在接种前将两种菌株混合。 
		注意：总接种体积不应超过20 µL，以防止液体溢出阴道。</li>
		<li>继续抬高每只小鼠的后躯10–20秒，防止接种液体立即积聚于阴道口。随后将小鼠放入新笼具/容器中，或与已完成接种的同笼动物放在一起。</li>
		<li>对每只小鼠重复步骤3.2和步骤3.3。切勿将小鼠放回尚未完成接种的动物所在的笼中。此举可避免小鼠在接种前意外接触链霉素抗性细菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有小鼠完成接种后，将接种物管重新移回厌氧环境。按照步骤2.5所述方法再次制备并涂布系列稀释液。此为接种后CFU测定。比较接种前后平板的CFU数值，以判断接种物在动物接种期间暴露于厌氧环境外时其活性是否下降。</li>
	<li>将步骤3.2中收集的阴道灌洗液接种于选择性琼脂平板（本实验中为含1 mg/mL链霉素的平板）。将平板置于37 °C厌氧环境中培养1–2天，观察是否有菌落生长。 
	注意：若有菌落生长，表明微生物组中的内源性菌群对筛选标记具有抗性，可能因此干扰目标生物的CFU计数。</li>
</ol>
4. 收集阴道灌洗液以测定活菌数 加德纳菌属 定植
<ol>
	<li>在选定的时间点收集阴道冲洗液，以分析阴道定植情况。收集方法如步骤 3.2 所述。</li>
	<li>收集后立即将阴道灌洗液转移至厌氧培养箱中。取每份灌洗液 10 µL，按照步骤 2.5 所述进行连续稀释，并接种至选择性琼脂平板上。以菌落形成单位（CFU）计数作为衡量阴道内加德纳菌（Gardnerella）或其他目标厌氧菌定植水平的指标。</li>
</ol>
5. 处死、解剖与组织匀浆
<ol>
	<li>为每只小鼠待采集的每个器官准备一个5 mL离心管（例如，若需采集阴道、宫颈和子宫，则每只小鼠准备三个管）。在厌氧工作站内，向每个管中加入无菌厌氧的1×PBS（或其他匀浆介质）。用于采集阴道和宫颈的管中加入1 mL PBS，用于采集子宫角的管中加入750 µL。</li>
	<li>加入PBS后，称量每个单独的离心管（此为采集前重量，用于确定所收获组织的总重量）。若厌氧工作站内无天平，可将管子 tightly capped 后移出工作站称重，再循环回工作站内。 
	注意：离心管的准备和称重可在处死动物前一天完成，但管子应始终保留在厌氧工作站内，并 tightly capped 以防止蒸发。</li>
	<li>按照步骤3.1所述方法准备一组阴道灌洗管，用于在处死时收集最后一次灌洗液。同时准备一个50 mL烧杯盛装去离子水（DI水），另准备一个50 mL烧杯盛装70%–90%乙醇，用于在处死过程中冲洗和灭菌常规钢制解剖器械。</li>
	<li>将装有PBS的器官采集管从厌氧工作站中移出。在组织准备好加入前，保持管子 tightly closed。</li>
	<li>采用IACUC批准的方法处死每只小鼠。在处死前或处死后立即，按照步骤3.2.2和3.2.3所述进行最后一次灌洗。</li>
	<li>开始解剖和组织采集。用70%乙醇喷洒每只小鼠的腹部和背部。将剪刀浸入乙醇烧杯中灭菌，晾干后沿腹盆腔中线做一条垂直切口。</li>
	<li>使用无菌镊子向后拉开皮肤，并轻轻将肠管推出体腔并移至操作视野一侧，以暴露生殖道。 
	注意：操作时应避免刺破或穿刺肠道，因其可能携带链霉素耐药菌，干扰实验结果。</li>
	<li>为获取最大量的阴道组织，在尸检过程中可折断耻骨。使用无菌剪刀剪断耻骨联合中心部位，注意避免剪入阴道组织。使用两把无菌镊子分别夹住骨盆两侧，横向拉开骨盆，以暴露其下方的阴道下段。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住宫颈（相较于周围组织质地较硬），轻柔上提宫颈以暴露隐藏在其后方并与之紧密相连的结肠。</li>
	<li>使用小剪刀将阴道从外部结缔组织中分离。小心地将阴道与结肠分开，避免穿破肠管。完全游离后，在阴道外口两侧用剪刀剪断，使阴道脱离小鼠身体。</li>
	<li>在轻柔夹持宫颈的同时稍向上提拉，使子宫角更清晰可见。另一只手在左右两侧卵巢下方直接剪断，以游离子宫角。将已分离的生殖道整体从体腔中取出，放入无菌培养皿中。</li>
	<li>使用刀片将子宫角、宫颈和阴道分离。将每种组织分别放入对应标记的采集管中。若需检测细胞因子，组织加入后应立即将管子置于冰上。</li>
	<li>组织加入后再次称量每个管子，此为采集后重量。用采集后重量减去采集前重量，得到组织的总重量。</li>
	<li>使用手持式匀浆器在采集管中对器官进行匀浆。对于Gardnerella JCP8151B，此步骤应在生物安全柜（有氧条件）或厌氧工作站内进行。
	<ol>
		<li>准备多组用于清洗和无菌处理手持式匀浆器的离心管（每组样品间使用）。确保每组包含三个50 mL锥形管：分别装有去离子水、70%乙醇和1×PBS。为每组小鼠处理组单独准备一组清洗管。</li>
		<li>清洗匀浆器时，将刀头依次浸入各清洗管液体中，并将仪器调至最高速运转。在每个管中保持约3秒。清洗顺序为：去离子水（去除物理残留物）、乙醇（消毒）、最后1×PBS（中和）。每次冲洗后，将探头在纸巾或一次性实验台垫上轻甩，去除多余液体。</li>
		<li>初步清洗后，将匀浆器探头插入采集管底部，使组织位于其下方并被固定。开启匀浆器研磨组织，同时轻柔上下移动探头约5次，保持探头始终浸没于液体中。每个器官匀浆约15–30秒。</li>
		<li>关闭并取出匀浆器后，目视检查管内内容物，确保组织已完全破碎。此步骤对宫颈和阴道尤为重要，因其有时可能未被探头充分捕获。 
		注意：子宫角上附着的少量脂肪未完全匀浆是可接受的。</li>
		<li>重复步骤5.14.1–5.14.4，在每份样品间清洗并灭菌探头。每个实验组更换一组新的清洗管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有匀浆样品的管子移入厌氧工作站。为测定各组织的细菌负荷量，对样品进行短暂轻柔涡旋混匀，然后取100 µL组织匀浆液进行系列稀释，并涂布于选择性琼脂平板以进行CFU计数（第一稀释度为1 × 100）。若需更低检测限，可对未稀释匀浆液进行涂布，取200–250 µL进行涂布平板。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本模型与先前发表的阴道接种模型最主要的差异在于使用了厌氧培养的细菌，这对接种物的制备以及从小鼠体内回收细菌均提出了特殊要求。上述方案中的具体步骤可能因所用细菌的种类/菌株不同而略有调整，具体建议参见补充文件1。此外，本文描述了一种新的细菌接种和阴道冲洗操作方法，该方法对实验人员的操作经验要求较低，同时减少了对小鼠的束缚。如果实验人员对步骤3.2和3.3中所述的束缚方式不熟悉，可根据实验设计及所在机构IACUC指南，改用此前报道的抓持背部皮肤的方法34，是否使用麻醉亦依具体情况而定。
在小鼠模型中使用厌氧培养细菌时，一个重要的注意事项是某些步骤（例如涉及活体动物的操作）必须在厌氧舱外进行。因此，本方案中最关键的步骤是目标细菌暴露于有氧环境的过程，例如小鼠接种期间。在此模型中使用任何新的厌氧菌之前，都需要初步研究其在接触氧气后维持存活的能力（例如步骤2.5和步骤3.4中所述的接种前后菌落形成单位CFU的比较）。根据该微生物对氧气和PBS的敏感程度，应考虑不同的接种物制备方法（补充文件1，步骤2.4.5）。对于使用G. vaginalis JCP8151B进行接种的情况，我们发现可在PBS中制备单管接种物，并用于感染所有小鼠。如果所使用的其他厌氧菌对氧气更为敏感，则可为每只小鼠分别制备独立的接种管，以避免反复开闭同一管导致的氧气暴露。同样地，如果目标细菌种类比G. vaginalis更难培养或在PBS中存活能力较差，则可改用培养基来制备接种物。若所用培养基中含有还原剂，例如用于培养Prevotella bivia的CDC厌氧培养基（补充文件1，步骤2.1和步骤2.2），则细菌在暴露于氧气时也将获得更强的保护作用。
也可考虑其他均质化方法，例如珠击法22,35，该方法在管盖封闭的条件下进行，因此可能比手持式匀浆器引入更少的氧气。此外，对氧气更敏感的生物可能需要更长的培养基平衡时间。可使用刃天青等氧指示剂检测是否达到厌氧条件（步骤 2.1）。其他方法（如厌氧罐）可能影响实验结果，应在使用前验证其对细菌活性的影响。
实验生物体对氧气的敏感性和苛养性也可能影响从冲洗液/匀浆过程中从小鼠体内成功回收活菌的效果（补充文件1，步骤3.2和步骤5.1）。对于高度敏感的生物体，采集冲洗液至接种到培养基之间的时间可能导致细菌活力下降，从而低估阴道细菌定植水平。为减轻此影响，采集的冲洗液可立即稀释至新鲜的厌氧培养基中（含还原剂）。类似地，组织匀浆可在新鲜培养基中进行，而非使用PBS，以提高细菌存活率；也可直接在厌氧工作站内完成匀浆操作，以最大限度减少氧气暴露。
根据特定实验的目的，实验人员必须注意设置对照组。为了验证假设，需检测仅用溶剂模拟处理的未感染对照小鼠的基础水平，以确定是否存在趋化因子/细胞因子或其他特定感染结果的诱导。所使用的对照溶剂必须与接种时使用的溶剂相同，因此如果细菌是用培养基接种的，则必须使用未接种的培养基作为对照（补充文件1，步骤2.4.5）。
本方案中描述的方法也可应用于兼性细菌，这类细菌能够在无氧条件下生长，但传统上通常使用有氧培养条件进行研究（例如 Escherichia coli 或B族Streptococcus）。对于在被认为含氧量较低的人体部位（如宫颈）发生的此类微生物感染，该方法可能尤为相关。兼性微生物在接种物经无氧条件制备时，可能比经有氧条件制备时更易成功感染低氧环境。在此类实验中，活菌的回收及菌落形成单位（CFU）计数可能无需无氧条件。

在哺乳动物中，阴道是多种细菌物种的栖息地。与其他哺乳动物相比，人类阴道微生物组的独特之处在于其含有大量属水平的成员 乳酸杆菌 以及相应的低阴道pH值（3.8-4.5）1,2,3,4. 破坏这一 乳酸杆菌 优势地位与多种负面健康结果相关。
在细菌性阴道病（BV）中，乳杆菌数量减少，而多种厌氧菌丰度增加，例如Gardnerella vaginalis和Prevotella bivia5,6。患有BV的女性发生性传播感染7,8,9、不孕症10、妊娠丢失11、早产12,13,14、宫内感染15、宫颈感染16以及癌症16,17,18的风险升高。&#160;BV还与阴道内潜在致病菌定植的可能性增加相关，例如具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）1,19,20，该菌是羊膜腔感染中常见的分离菌21。
由于厌氧菌在人类阴道健康中具有重要作用，因此需要能够用于研究这些生物体生物学特性及致病机制的动物模型。本文介绍了在雌激素处理的小鼠中进行阴道接种及成功回收活体Gardnerella vaginalis的方法，并提出了针对Prevotella bivia和Fusobacterium nucleatum的额外实验策略。此前已有其他小鼠阴道定植模型的报道，但这些模型主要关注的是在有氧条件下培养的兼性厌氧菌，如B族Streptococcus22和Neisseria gonorrhoeae23的接种与回收。通过适当的实验设计，专性厌氧菌的接种与活体回收亦可成功实现。我们讨论了多种细菌分类群的活体回收方法，并建议对其他感兴趣物种或菌株的存活条件进行实证评估。
估计活细菌定植的经典方法是回收菌落形成单位（CFUs）。在具有自身内源性微生物群的常规饲养小鼠中，这需要使用选择性琼脂培养基，该培养基可抑制内源性阴道微生物群成员的生长，同时允许接种的细菌菌株正常生长。本文中，我们使用一种对链霉素耐药的G. vaginalis24分离株，可在含链霉素的琼脂培养基上进行选择性回收。为确保该培养基具有足够的选择性，同时排除内源性微生物组中存在链霉素耐药细菌的可能性，应在接种前采集阴道灌洗液，并接种至选择性（含链霉素）琼脂平板上进行培养验证。
不同种类和菌株的细菌，其接种物制备的最佳方法可能有所不同。在小鼠实验开始之前，应进行预实验以确定培养基、生长终点、接种物制备条件，以及细菌对氧气的敏感性与在磷酸盐缓冲液（PBS）中存活能力的最适参数。对于氧气更敏感的细菌，可考虑采用替代的接种物制备方法（例如，在厌氧培养基中培养，并设置适当的载体对照组）25,26。

<table><tbody><tr><td>&amp;beta;-雌二醇17-戊酸酯</td><td>Sigma</td><td>E1631</td><td>小鼠雌激素化处理</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m，50 mL Steriflip 真空滤器</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;SCGP00525</td><td>芝麻油无菌过滤</td></tr><tr><td>14 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>小鼠雌激素化处理</td></tr><tr><td>190-proof 乙醇</td><td>Koptec</td><td>&amp;nbsp;V1105M</td><td>解剖、组织匀浆、CDC 和哥伦比亚培养基配制</td></tr><tr><td>1× PBS</td><td>Fisher</td><td>MT21040CM</td><td>阴道灌洗、阴道加德纳菌接种液制备、组织采集与匀浆</td></tr><tr><td>25 G &amp;times; &lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;/&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt; -注射针头</td><td>BD</td><td>305122</td><td>小鼠雌激素化处理</td></tr><tr><td>5 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>组织采集与匀浆</td></tr><tr><td>厌氧培养箱</td><td>Coy</td><td>7200000</td><td>厌氧菌培养</td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>Fisher</td><td>DF0140074</td><td>阴道加德纳菌、具核梭杆菌和二路普雷沃菌琼脂平板</td></tr><tr><td>Bacto 蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>DF0118170</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>哥伦比亚肉汤</td><td>Fisher</td><td>DF0944170</td><td>用于具核梭杆菌生长的哥伦比亚培养基</td></tr><tr><td>去纤维羊血</td><td>Hemostat</td><td>DSB500</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>&amp;nbsp;11008-13</td><td>小鼠/组织解剖</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>用于阴道加德纳菌生长的 NYCIII 培养基</td></tr><tr><td>手持式匀浆器</td><td>ISC Bio</td><td>3305500</td><td>组织匀浆</td></tr><tr><td>血红素</td><td>Sigma</td><td>51280</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基，用于具核梭杆菌生长的哥伦比亚培养基</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>用于阴道加德纳菌生长的 NYCIII 培养基</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Hemostat</td><td>SHS500</td><td>用于阴道加德纳菌生长的 NYCIII 培养基</td></tr><tr><td>氢气混合气（5% 氢气，10% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，85% 氮气）</td><td>Matheson</td><td></td><td>厌氧培养箱用气体</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td>处死小鼠时的麻醉</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>G1626</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>Milli-Q 超纯水系统</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>用于培养基配制和组织匀浆</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>用于阴道加德纳菌生长的 NYCIII 培养基</td></tr><tr><td>NaOH 片剂</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>氮气</td><td>&amp;nbsp;Airgas</td><td></td><td>&amp;nbsp;厌氧培养箱用气体</td></tr><tr><td>p-200 滤芯吸头</td><td>ISC Bio</td><td>&amp;nbsp;P-1237-200</td><td>阴道灌洗和细菌接种</td></tr><tr><td>酪蛋白胰酶消化物</td><td>Sigma</td><td>70169</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>蛋白胨 #3</td><td>Fisher</td><td>DF-122-17-4</td><td>用于阴道加德纳菌生长的 NYCIII 培养基</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>&amp;nbsp;14084-08</td><td>小鼠/组织解剖</td></tr><tr><td>芝麻油</td><td>Fisher</td><td>&amp;nbsp;ICN15662191</td><td>小鼠雌激素化处理</td></tr><tr><td>单刃外科碳钢刀片</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>组织解剖</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>测定细菌 OD600</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>添加至琼脂培养基以制备选择性平板</td></tr><tr><td>结核菌素滑动接头 1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td>小鼠雌激素化处理</td></tr><tr><td>维生素 K3</td><td>Sigma</td><td>M5625</td><td>用于具核梭杆菌生长的哥伦比亚培养基</td></tr><tr><td>维生素 K1</td><td>Sigma</td><td>95271</td><td>用于二路普雷沃菌生长的 CDC 厌氧培养基</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>用于阴道加德纳菌生长的 NYCIII 培养基</td></tr></tbody></table>

小鼠阴道定植的厌氧培养细菌模型

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

哺乳动物的阴道可被多种细菌类群定植。人类阴道微生物组通常以乳杆菌属（Lactobacillus）物种为主，但每四位女性中就有一位会经历细菌性阴道病，其特征是乳杆菌水平降低，并伴有多种厌氧菌的过度生长。该状况与多种健康并发症相关，包括对生殖健康和性健康的潜在风险。尽管越来越多的证据表明人类阴道健康中微生物相互作用的复杂性，但这些不同厌氧菌各自的生物学作用尚未完全阐明。这一研究难点还因缺乏合适的模型来研究厌氧培养的阴道细菌而加剧。小鼠模型使我们能够在体内（in vivo）研究这些微生物的生物学特性及其致病性。此前已有其他关于阴道细菌接种的小鼠模型被报道。本文详细描述了在常规饲养的C57Bl/6小鼠中接种厌氧培养细菌及其活菌回收的方法。同时介绍了一种新的、对动物应激更小的阴道接种与冲洗操作流程。文中以加德纳菌（Gardnerella）为例，详细阐述了其接种与活菌回收的具体步骤，并讨论了针对其他厌氧菌如普雷沃氏菌（Prevotella bivia）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）的实验策略。

一个示例实验的示意图展示了实施所述方案的一些可能方式（图1）。
一些动物的阴道微生物组中会携带可在非选择性培养基上生长的内源性微生物。本文所述方法依赖于研究菌株的链霉素抗性分离株，并结合含有链霉素的选择性培养基，以抑制内源性细菌的生长（图2A、B）。链霉素抗性可能自发产生，因此在感染前对小鼠进行检测（第0天冲洗样本）有助于判断这是否可能成为问题。
通过连续稀释法并将样品接种至琼脂培养基，可实现从阴道冲洗液中回收可存活的细菌。标准培养皿最多可容纳 6 × 6 的点样阵列，每点 5 µL，若采用 10 倍系列稀释，则每个样本可在六个数量级范围内对六个重复点进行细菌滴度计数（图 3A）。该方法可用于定量从 Gardnerella 到 Prevotella 和 Fusobacterium 等多种细菌的滴度（图 3B–D）。
这些方法共同支持对细菌在女性生殖道定植/感染的假设进行检验和解释。例如，阴道灌洗液与阴道组织匀浆液中 Gardnerella 滴度的比较显示，这两种方法的结果具有一致性（图 4A）。同样，在阴道共接种模型中，与 Prevotella 单独感染相比，Gardnerella 共同感染期间子宫组织中 Prevotella 的滴度显著更高（约高 20 倍）（图 4B）。最后，在这些模型中可比较野生型与突变型细菌菌株，以明确特定基因及其产物在生殖道定植/感染过程中的作用。例如，一种无法转运和利用碳水化合物唾液酸的 Fusobacterium 突变菌株，在接种后 3 天导致定植水平降低（图 4C）。
<img alt="C57BL/6 小鼠实验示意图，显示细菌接种和雌二醇给药时间线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：一个示例实验的示意图33。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="琼脂平板扩散试验比较；抗生素耐药性分析；微生物学实验。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：选择性与非选择性琼脂上小鼠阴道内源性微生物的生长情况。 来自五只雌性 C57Bl/6 小鼠（1-5）的阴道灌洗液分别划线接种于两种不同的 NYC III 琼脂平板，并在厌氧条件下培养。（A）左侧平板不含任何抗生素，允许小鼠阴道道内的内源性厌氧菌生长。（B）右侧平板含有 1 mg/mL 链霉素，可抑制内源性细菌的生长。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="琼脂平板上的细菌菌落形成及微生物生长研究的CFU/ml分析图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：从阴道冲洗液中回收可存活的 G. vaginalis、P. bivia 和 F. nucleatum 菌落形成单位（CFU）。（A）G. vaginalis JCP8151B-SmR 接种液在NYC III琼脂培养基上进行系列稀释并复制接种后的CFU结果。（B–D）从单一感染动物的阴道灌洗液中回收的可存活（B）G. vaginalis24、（C）P. bivia25 和（D）F. nucleatum26。每张图（B–D）的数据均来自两次独立实验，每次实验包含10–15只小鼠24,25,26。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌载量分析；图表比较组织中的CFU；标明统计学显著性。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：小鼠阴道接种模型中厌氧菌定植的进一步分析。（A）接种后24 h和72 h，阴道冲洗液中的 G. vaginalis 滴度与阴道组织匀浆中回收的 G. vaginalis 滴度呈正相关（合并两项独立实验，每项 n = 10。显著性由Spearman等级相关检验确定）24。（B）与单独感染 P. bivia 的动物相比，在接种后48 h，合并感染 G. vaginalis 导致子宫角组织中 P. bivia 滴度升高（合并两项独立实验，每组6–10只小鼠。显著性由Mann-Whitney U 检验确定，**p = 0.0017）25。（C）与野生型 F. nucleatum 相比，sialic acid转运蛋白缺失的 F. nucleatum 突变株（Ω SiaT）在接种后72 h的单感染小鼠阴道灌洗液中滴度降低（合并两项独立实验，每组10只小鼠。显著性由Mann-Whitney U-检验确定，**p &lt; 0.01）26。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件1：在厌氧条件下培养的不同阴道细菌所用方法的示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一种利用厌氧培养的人源阴道细菌建立小鼠阴道定植模型的方法。我们主要关注Gardnerella vaginalis&#160;，同时也提供了针对Prevotella bivia和Fusobacterium nucleatum的操作建议。该方案也可作为其他厌氧培养细菌进行阴道接种及活菌回收的参考指南。

哺乳动物的阴道可被多种细菌类群定植。人类阴道微生物组通常以乳杆菌属（Lactobacillus）物种为主，但每四位女性中就有一位……

该方法将帮助研究人员研究定植于女性生殖道并引起感染的厌氧菌的生物学特性及病理生理学机制。以往的小鼠阴道接种模型主要关注在有氧条件下培养和回收的细菌。本方法介绍了专性厌氧菌的接种与回收技术，此类细菌需要采取额外策略以最大限度减少氧气暴露。根据细菌菌株的苛养程度不同，本模型中使用的新菌株可能需要对某些步骤进行调整。我们在论文的表一中提供了潜在修改方案的建议。首先，在厌氧环境中，将200 µL的16小时菌液加入含有800 µL新鲜培养基的1.5 mL比色皿中。然后使用分光光度计在600纳米处测定稀释后菌液的光密度（OD），以仅含培养基的独立比色皿作为空白对照。为获得菌液的实际OD值，将分光光度计读数乘以5，随后确定实验所需的接种量，并计算达到目标接种密度所需的细菌培养物体积。接下来，用移液器吸取所需体积的细菌培养物至无菌微量离心管中，在16,000 × g条件下离心1至3分钟。去除上清液后，将沉淀重悬于厌氧 PBS 中，以获得先前计算好的接种物体积。为确定制备的接种物中细菌菌落形成单位的数量，首先取 10 微升细菌悬液，在 PBS 中进行系列梯度稀释，并使用多通道移液器将稀释后的接种物点种到琼脂平板上。同时，在厌氧工作站中准备阴道灌洗管：将 70 微升无菌厌氧 PBS 加入已标记小鼠编号的 1.5 毫升微量离心管中。将管子盖紧并从腔室中取出。进行阴道灌洗时，首先将一只小鼠放置在笼盖上方，使其前爪可以抓住笼盖。然后轻轻抓住尾巴的中段并提起，使后躯略微抬高，暴露阴道开口。从标记好的洗涤管中吸取50微升PBS后，将移液器吸头轻轻插入阴道腔内2至3毫米，通过吹打3至4次用PBS清洗阴道腔。然后，将洗涤液连同剩余的20微升未使用的PBS一起转移回原来的洗涤管中。完成该阴道灌洗后，立即通过阴道给予每只小鼠20微升细菌悬液或载体对照。对于两种不同细菌菌株的共接种实验，应分别接种每种细菌悬液10微升，而不是预先混合菌株。为防止接种体积立即积聚在阴道口，继续将小鼠的后部抬高10至20秒。将接种后的小鼠转移至新笼子或与已接种的同伴小鼠同笼，并对其他小鼠重复该操作。接种所有小鼠后，在厌氧环境中通过梯度稀释接种物并涂布平板，测定接种后活菌数（菌落形成单位）。为收集小鼠器官，需在厌氧环境中预先准备5 mL器官收集管：每管加入1 mL无菌厌氧PBS，用于阴道和宫颈组织；标记用于子宫角的收集管则加入750 µL PBS。在处死动物时收集最终灌洗液，需按照先前演示的方法准备另一套阴道灌洗管。同时，为冲洗和消毒解剖器械，准备一个盛有50毫升去离子水的烧杯和一个盛有50毫升70%至90%乙醇的烧杯。在处死小鼠前或处死后立即按照之前演示的方法进行最终灌洗。处死小鼠后，用70%乙醇喷洒小鼠的腹部和背部。然后，使用经乙醇灭菌并干燥的剪刀，通过垂直剪切切开小鼠的腹腔和盆腔。接着，用镊子将皮肤向后拉开。为了暴露生殖道，轻轻将肠管从体腔推向手术视野的一侧，并移除膀胱，以暴露生殖道的下部。随后，用剪刀剪断耻骨中段，注意不要损伤阴道。接着，使用两把镊子分别夹住骨盆两侧，横向向外拉开骨盆，以充分暴露其下方的阴道下段。用镊子轻轻夹住宫颈并向上提起，以暴露结肠。随后，使用小剪刀将阴道从外部结缔组织中分离。小心地将阴道与结肠分离，避免刺破肠管。当阴道完全从结肠分离后，用剪刀在阴道口两侧剪开，然后剪断以将其从鼠体中移除。轻轻夹住宫颈并向上提起，使子宫角更清晰可见，随后在左右两侧卵巢下方直接剪断，以分离子宫角。接着，将整个生殖道从鼠体中取出，并置于无菌培养皿中。然后，使用剃刀刀片分离子宫角、宫颈和阴道。将每种组织放入相应标记的收集管中。为了匀浆器官，需在生物安全柜中准备好手持式匀浆器。首先，准备三支50毫升离心管，分别装入去离子水、70%乙醇和磷酸盐缓冲液（PBS），用于在匀浆每个器官后清洗匀浆器刀头。清洗匀浆器时，将刀头浸入装有水的离心管中，以全速启动机器约三秒钟。随后，将刀头在纸巾上轻轻抖动，以去除多余水分。依次用70%乙醇和PBS冲洗刀片。初次冲洗后，将匀浆器探头降至装有器官的离心管底部，以将组织固定在下方。然后启动匀浆器以研磨组织，并轻轻上下移动探头约五次，保持探头始终浸没在液体中。关闭并移除匀浆器，目视确认组织已完全破碎。匀浆完成后，将样品重新转移回厌氧舱内，进行系列稀释以回收菌落形成单位（CFU）。按照本方案，可成功从阴道冲洗液中回收并计数细菌菌株阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）、两形拟杆菌（Prevotella bivia）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）的活菌及菌落形成单位。此外，从阴道冲洗液中获得的阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）菌落形成单位数量与从阴道组织匀浆中回收的数量呈正相关。该方法还显示，在与阴道加德纳菌共感染期间，普雷沃氏菌属毕氏种（Prevotella bivia）在小鼠子宫组织中的滴度显著高于其单一感染时。此外，该方法可成功用于比较接种后24小时和72小时时，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）突变株与野生型菌株在阴道内的持续定植能力。为了研究对阴道细菌接种的免疫反应，可对组织匀浆进行细胞因子检测。或者，可保存组织用于组织学检查，以评估是否存在炎症迹象。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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