Name: 导管内乙醇消融治疗在大鼠模型中预防乳腺癌的X射线可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: 了解导管内乙醇消融治疗在大鼠模型中预防乳腺癌的方法。该技术通过乳头开口直接靶向乳腺上皮细胞，实现X射线可视化并最大限度减少周围组织损伤，为乳腺癌预防提供了一种侵入性更小的替代方案。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所授予 LFS 的 R21 CA226579 和 R01 CA258314 基金以及美国国立生物医学成像与生物工程研究所授予 EMS 的 R01 EB029418 基金的支持。我们感谢密歇根州立大学定量健康科学与工程研究所（IQ）成像核心设施提供其成像系统和技术支持。我们感谢 Danielle Ferguson 博士对视频内容及图示进行审阅，以确保符合动物福利指南。

所描述的所有实验均在密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准的协议下进行。
1. 延长抗炎治疗
<ol>
	<li>制备蔗糖素凝胶杯，用于口服给予卡洛芬。从注射70%乙醇（EtOH）前2天开始，至操作后7天，为大鼠提供该抗炎治疗。</li>
	<li>将卡洛芬工作液用无菌PBS稀释后注入凝胶杯中。从50 mg/mL的储备液中，配制含1% v/v无菌蓝色食用染料的2 mg/mL稀释液，并向每个杯中注入500 µL。添加染料有助于观察药物在蔗糖素凝胶中是否完全混合均匀。</li>
	<li>按照制造商说明准备凝胶杯以加入卡洛芬。除非供应商另有说明，将凝胶杯置于60 °C水浴中加热15分钟，取出后擦干表面，以降低污染风险。
	<ol>
		<li>用70%乙醇擦拭蔗糖素凝胶杯盖表面，在指定位置插入装有卡洛芬工作液的注射器针头，注入适当体积（500 µL）的药液。</li>
		<li>用贴纸覆盖穿刺孔，用力振摇15秒，随后将杯子置于涡旋振荡器上继续混合15秒。在储存备用前，目视评估混合是否均匀且完全，观察是否呈现均匀的深蓝色。 
		&#8203;注意：让凝胶杯恢复至室温。可根据需要在室温下储存，但需注意遵循制造商关于药物有效性的指导建议。或者，可在4 °C条件下储存，并在一个月内使用完毕。在贴纸上标注日期，有助于记录配制时间，同时避免使用笔或尖锐记号笔标记时刺穿杯盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前，用70%乙醇擦拭凝胶杯外表面。将凝胶杯放入动物笼内前需取下杯盖。每隔一天更换一次凝胶杯，或在凝胶耗尽时及时更换。每日检查凝胶量，确保给药充足。一个凝胶杯最多可为两只大鼠提供长达2天的卡洛芬；但大鼠可能在更短时间内将凝胶全部消耗。</li>
</ol>
2. 术前准备
注意：动物准备步骤应在 ID 注射操作前 2-3 天进行。
<ol>
	<li>打开异氟烷蒸发器（2%–3% 异氟烷，1.5 L/min 氧气）以麻醉大鼠。将动物转移至加热垫上的鼻罩中。为大鼠涂抹眼部润滑剂，然后将其置于仰卧位。密切监测动物呼吸，确保麻醉深度维持在 1%–3% 异氟烷浓度范围内。 
	注意：可在脱毛前使用电动剃刀去除多余毛发。使用剃刀时必须格外小心，避免损伤乳头。因此，此步骤可省略。大鼠对脱毛膏比小鼠更敏感，因此彻底清除脱毛膏非常重要。避免将含乙醇的溶液注射到因脱毛已出现擦伤的区域。某些脱毛膏含有芦荟和羊毛脂等添加成分，有助于减少擦伤的发生。</li>
	<li>使用棉签将市售脱毛膏涂抹于乳头区域，并用棉签将脱毛膏在该区域揉搓 10–30 秒。检查毛发是否已迅速松动。
	<ol>
		<li>应尽可能缩短脱毛膏在大鼠体表的停留时间，并彻底清除，以防皮肤灼伤。大鼠对该操作的敏感性甚至高于小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>涂抹 10–30 秒后，用温水浸湿纱布，冲洗动物体表的脱毛膏及松动的毛发。使用新的湿润纱布至少重复冲洗该区域三次，最后一次冲洗后用干纱布擦干。确认乳头区域去毛后视野清晰且易于操作。如有必要，可重复脱毛步骤。</li>
	<li>将大鼠置于加热垫上的清洁笼具中，使其恢复。观察大鼠状态，确保其完全从麻醉中恢复后，再将其送回永久性饲养笼。</li>
	<li>在笼内放置一个含卡洛芬（1 mg/杯）的三氯蔗糖凝胶杯，用于抗炎治疗。每日检查凝胶消耗情况，并根据需要更换新杯。单个凝胶杯使用时间不得超过 2 天。通常情况下，需在 1 天后更换新杯。</li>
</ol>
3. 导管内注射
<ol>
	<li>按照文献19所述方法，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）配制333.3 mM的TaOx储备液。若粉末未完全溶解，可适当加热溶液。轻轻搅拌，避免涡旋或剧烈震荡，以防产生气泡。</li>
	<li>将三份333.3 mM TaOx溶液与七份100%乙醇（EtOH）混合，得到终浓度为70% EtOH、100 mM/TaOx的消融溶液。可选地，加入适量0.5%-1.5%的乙基纤维素（EC）作为凝胶剂，以增强消融溶液在局部的滞留效果。向消融溶液中加入1%（v/v）蓝色食用染料，以便在灌注过程中直观观察溶液在导管树内的输送情况。</li>
	<li>根据实验需求准备适当体积的溶液。第1对（颈）和第6对（腹股沟）腺体最多可填充100 μL溶液，其余各对腺体最多可填充300 μL。</li>
	<li>按照步骤2.1对大鼠进行麻醉，待其完全麻醉后移至鼻罩。在双眼涂抹眼用润滑剂，然后将动物仰卧放置。如需固定，可用胶带将大鼠固定于体视显微镜下，胶带可贴在待注射乳头附近。通常大鼠自身重量已足以防止其显著移动，无需额外固定。</li>
	<li>为准备乳头注射，若可能，使用精细尖头镊子去除覆盖乳头开口的死皮组织。大鼠乳头开口处常有栓状物突出，若不移除，可能阻碍乳头成功插管。 
	注意：在大鼠中使用较大体积的消融溶液注射时，注射部位附近更易出现浅表性皮肤损伤。因此，单次操作中隔一个乳头注射一次，比连续注射相邻乳头对动物造成的损伤和刺激更小。注射后7天内密切监测大鼠是否出现擦伤，以确保动物因搔抓导致皮肤破损并接触笼底杂物后不会引发严重健康问题。如出现损伤或感染迹象，可使用三重抗生素软膏或氯己定溶液清洗处理（表1）。</li>
	<li>使用500 µL注射器配33 G针头，吸取101–301 µL消融溶液。额外多吸取1 µL溶液，以补偿拔出插管针头时可能发生的微量泄漏。 
	注意：上述体积建议旨在充分填充导管树：颈腺和腹股沟腺最多100 µL，其他腺体最多300 µL。对于其他应用，可根据需要使用更小或更大的体积。</li>
	<li>使用镊子轻轻夹住乳头，将针头插入乳头开口。轻柔推进针头，直至针尖斜面完全进入乳头内部。为适应乳头结构，应将乳头向上提向针头，而非将针头向下压入乳头（表1）。操作时应注意沿乳头开口的自然走向进行。 
	注意：由于尺寸较大，大鼠乳头通常比小鼠乳头更容易操作和成功插管。然而，乳头开口周围脂肪组织较多，若针头偏离主导管，更易误注入脂肪垫。</li>
	<li>当针尖斜面完全插入后，以约100 µL/min的恒定速率缓慢灌注溶液。灌注速率的突然变化可能导致导管树破裂或损伤。灌注结束后，等待30秒再在镊子辅助下将针头从插管的导管树中拔出；此举可确保注入的液体保留在导管树内（图2），并减少泄漏风险。</li>
	<li>使用湿润纱布或乙醇擦拭巾清理任何溢出的溶液，以避免成像时出现额外的对比信号干扰。</li>
	<li>若导管内（ID）注射溶液中含有乙醇，应腹腔注射含5%蔗糖的PBS（10 mL/kg），以减轻酒精中毒效应。该剂量可在操作开始和结束时各给予一次。</li>
</ol>
4. 微型计算机断层扫描成像
<ol>
	<li>在完成所有目标腺体的注射后，迅速将动物转移至微计算机断层扫描（micro-CT）系统，并继续使用系统集成的异氟烷蒸发器维持麻醉状态。</li>
	<li>拉直动物的脊柱，并用胶带将每只后肢固定于伸展位置，使腿部骨骼远离感兴趣的下部腺体，避免在扫描图像中与目标区域重叠。</li>
	<li>若扫描下部腺体，需在腹部横向粘贴胶带，以尽量减少呼吸运动造成的伪影。 
	注意：若谨慎评估并确定大鼠可接受的终生辐射剂量限值，并确保累积剂量不超过该限值，则可采用不同扫描参数（如高分辨率、纵向扫描）对动物进行成像。通过采集透视静态图像和视频而不进行完整扫描，可进一步降低辐射暴露（图2）。</li>
	<li>使用以下扫描参数对大鼠导管树进行TaOx成像，可获得良好的分辨率，并支持重复进行标准（2分钟）采集扫描：90 kVp/88 µA；视野（FOV），72 mm；层数，512；层厚，72 µm；体素分辨率，72 µm3。对于无需进行纵向扫描的动物，也可采用相同参数获取更长时间（4–14分钟）的高分辨率扫描。</li>
	<li>数据采集完成后，小心将大鼠从麻醉罩中取出，并置于加热垫上的新洁净笼具中。需定期检查大鼠，确保其完全从麻醉中恢复后，再将其送回永久饲养笼。放置含卡洛芬的蔗糖溶液杯，并按照步骤2.5所述方法及时更换，以确保动物在接下来的7天内持续接受抗炎治疗。</li>
	<li>在micro-CT软件中将扫描图像快速重建为可视化图像，以便更好地评估是否存在对比剂泄漏、填充不全或过度填充等情况（图2）。</li>
	<li>如需进行图像的正式处理以用于发表或详细分析，请继续进入下一节操作（图3）。</li>
</ol>
5. 图像分析
<ol>
	<li>使用专业软件包对填充的导管树进行三维重建。 
	注意：为了最佳呈现注射的导管树，建议对乳腺脂肪垫进行分割。通过样条追踪动物完整厚度中脂肪垫的深色边界，以实现此分割。</li>
	<li>为了分割脂肪垫（与小鼠不同，由于Hounsfield单位相似，该解剖区域与腹膜腔、股部肌肉和皮肤之间的边界不易区分），其中包含目标导管树，需进行选择 &#34;样条轨迹&#34; 从手动菜单中选择选项是创建渲染的第一步。</li>
	<li>每隔三个切片，用样条曲线追踪脂肪垫轮廓。点击 扩增对象 从半自动菜单中选择该选项。此操作将所有切片传播并连接成一个单一的分割目标对象。 
	注意：调整分割区域内阈值可实现仅在特定亨氏单位（HU）范围内可视化信号；对于其他对比剂或成像参数，该范围可能需要相应调整。可使用软件包或人工智能分析方法进行其他测量和图像处理，以显示导管树的充填程度。</li>
	<li>在半自动菜单的阈值体积选项卡下，将HU值设置为低点300和高点3,000。这将生成仅显示对比剂（TaO）的图像x导管树内</li>
	<li>将该版本设为主要版本 &#34;查看&#34; 按钮。这将更改显示内容，仅显示导管树的三维渲染图像。 
	注意：对导管树进行重建以供进一步分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

如图所示，在小鼠中，通过ID途径递送70%乙醇可优先消融乳腺上皮细胞，同时对周围间质和血管系统的附带损伤有限4。在小鼠模型中，局部消融导管树可有效预防肿瘤形成4。在此，我们证明该消融操作可扩展应用于大鼠。
这是将这种消融手术作为高风险个体预防乳腺癌的预防性乳房切除术替代干预措施进行转化的下一步。在消融溶液中添加TaOx纳米颗粒作为X射线对比剂，可评估该溶液在防止肿瘤形成方面的有效性，因为可以通过成像判断手术是否成功完全填充了导管树。使用透视成像观察注射后的乳腺组织，模拟了未来临床实践中引导该导管内（ID）手术的可能方法。通过影像引导确定溶液对导管树的填充程度以及何时停止输注，将是临床实施中的关键环节，以确保每棵导管树达到最大程度的填充。常见问题及实用建议见表1。该消融手术的有效性依赖于灌注溶液与所有上皮细胞的直接接触，以最大化细胞杀伤效率。若一个或多个导管树中残留存活的上皮细胞，则可能成为乳腺癌（BC）发生发展的潜在来源。其他研究团队已报道在小鼠4,19,21,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45、大鼠21,33,46,47,48和/或家兔18,49,50,51,52,53中通过导管内递送病毒颗粒（如Cre/LoxP和/或Cas9/CRISPR系统组分）、激素及激素拮抗剂（如催乳素、氟维司群）、化疗药物（如顺铂）、siRNA和/或抗体或其他靶向试剂。已有独立临床研究报道，在单侧人乳中成功插管多达八棵导管树，用于局部递送化疗药物47,54,55。对于旨在预防肿瘤或用于局部治疗的其他溶液，采用影像引导输注同样可最大化其疗效。
本文展示了该方法从小鼠到大鼠导管树的可扩展性和优化效果。TaOx 纳米颗粒在小鼠4,19以及大鼠（未发表数据）的导管树中均能实现高分辨率成像，其成像效果优于美国食品药品监督管理局（FDA）批准的含碘X射线造影剂。据我们所知，目前尚无其他针对小鼠40,41或其他动物模型18的导管树成像技术能够达到与TaOx相当的分辨率。在临床转化方面，重要的是，乙基纤维素（EC）在中等体型大鼠模型中产生的凝胶化效应是一种关键的配方优化，有助于最大限度减少对邻近组织的损伤。随着我们进一步评估这种消融性导管内（ID）治疗在预防乳腺癌（BC）方面的潜力，我们将能够更精确地确定，在化学诱导及其他大鼠乳腺癌模型中，通过ID给药后的成像信息揭示出乳腺癌究竟起源于哪些腺体。这些数据将评估该治疗方法的安全性，并明确部分治疗或治疗失败的导管树是否可能使高风险女性更易发生乳腺癌，从而发现潜在问题或不足之处。

对于美国的女性1，乳腺癌（BC）仍然是诊断人数最多的癌症类型，其致死人数仅次于肺癌。2022年的预测数据显示，将有51,400名女性被诊断为癌瘤 原位 将有287,850名女性被诊断为浸润性癌，其中43,600名女性将死于乳腺癌1尽管膀胱癌的发病率和死亡率较高，但目前可用于初级预防的措施十分有限，且针对新型干预手段的转化研究也较少，因为联邦机构并未将初级预防列为优先事项。2预防性乳房切除术是原发性预防最有效的干预措施。然而，由于该手术属于重大外科手术，且会对生活产生深远影响，因此仅建议高风险个体接受。3该手术包括完全切除乳腺上皮细胞以及周围的正常组织，而乳腺癌正是起源于这些上皮细胞。由于该手术可能对个体造成身体、心理及社会层面的负面影响，许多人通常不将其作为首选的初始干预手段。因此，即使是一些高风险个体，也可能选择不接受该手术，转而采取密切观察或类似的监测策略。3在先前的研究中，将70%乙醇（EtOH）直接递送至小鼠模型的导管树中，可有效化学消融乳腺上皮细胞，同时对邻近正常组织造成有限损伤，并能预防乳腺肿瘤的形成4乙醇在多种临床应用中被用作消融剂，以局部治疗某些癌症，或作为硬化剂，用于治疗动静脉肿胀和畸形。5,6,7,8,9,10,11,12,13,14乙醇的低毒性和安全性已得到充分证实，在某些操作中，每次可给予高达50 mL的95%乙醇5,10.
彻底清除乳腺导管上皮细胞——乳腺癌（BC）发生的来源——是预防性乳房切除术和局部递送消融溶液这两种方法中最关键的环节。因此，必须确认导管树的完全充填，以确保消融溶液与所有乳腺上皮细胞直接接触。通过已有的临床操作，可将溶液递送至导管树，并借助影像引导下的荧光透视或导管造影进行可视化观察15,16,17。因此，该方法在临床试验中易于实施和评估。确立导管内（ID）消融作为一种新型一级预防干预手段的有效性和转化可行性，关键一步是证明这种X射线可视化方法在导管树结构日益复杂和体积逐渐增大的动物模型中的可行性4,18,19。本文描述了一种将该消融操作从小鼠20扩展到大鼠模型的实验方案。尽管小鼠和大鼠的导管树具有相似的线性结构和分支模式，但大鼠的导管树相对更大，且被更致密的间质组织所包围。我们在实验室中建立了一种方法，能够在一系列每周一次的治疗中，成功地向大鼠的每个乳腺腺体注射含有造影剂的消融溶液。分次进行治疗是必要的，以确保动物由乙醇（EtOH）引起的副作用最小化（图1 和 图2）。该操作包括使用33 G针头将消融溶液直接注射到异氟烷麻醉大鼠的乳头开口处。该方法的一些关键改进包括延长使用抗炎治疗、每棵导管树注射的体积高于先前建议值21，以及使用耐压气密注射器来处理液体和气体。在导管内注射前后48小时至1周内，给予5 mg/kg的卡洛芬（一种非甾体抗炎药，NSAID）的治疗时长，与临床上用于静脉畸形硬化治疗的抗炎方案相当。临床上对患者在全身麻醉下进行治疗后，通常还需继续使用NSAIDs等抗炎药物2天。根据需要，抗炎治疗可再延长数天，以减轻局部炎症反应及潜在疼痛13。与小鼠模型类似20，腹腔注射5%蔗糖溶液可缓解酒精中毒对大鼠的短期影响。当联合使用该蔗糖溶液时，单次治疗中大鼠可耐受高达1 mL的70% EtOH（最多4棵导管；血液中EtOH浓度达0.2 g/dL），并在导管内注射后4小时内完全恢复。当注射超过4个腺体和/或使用更高浓度的EtOH时，我们采用分次连续治疗，以保证足够的恢复时间。在女性中，酒精中毒的可能性将显著降低：假设双侧乳房共有16条主要导管16,17，每条导管注射2 mL 70% EtOH22,23，血液中EtOH浓度将低于0.1 g/dL，可能仅引起轻微功能受损。
X射线成像可用于确定每个单独腺体中导管内递送的成功程度，以及整个导管树是否被完全填充（图1、图2、图3）。在进行微计算机断层扫描（micro-CT）和/或DICOM文件数据三维重建前，可利用实时透视成像评估溶液在导管树内的递送范围以及是否存在向间质泄漏的情况。使用透视成像有助于限制施加于动物的整体辐射剂量。该透视技术更接近于这种消融治疗在临床应用中的影像引导目标。为进一步优化消融溶液的实用性，已对美国食品药品监督管理局（FDA）批准的含碘造影剂Isovue与氧化钽（TaOx）纳米颗粒进行了比较研究4,19。研究发现，在小鼠导管树初始填充的可视化方面，TaOx作为micro-CT对比剂优于Isovue4,19。本文中，我们证明TaOx同样适用于可视化大鼠导管树的初始填充（图2和图3）。在转化研究及临床实践应用中，已在乙醇（EtOH）溶液中添加凝胶剂乙基纤维素（EC），以最小化溶液从目标区域的扩散13,14,24,25,26,27,28,29。研究表明，在含EtOH的消融溶液中添加高达1.5%的EC仍可与基于TaOx的成像兼容（图3）。这些改进以及其他对消融溶液的进一步优化，可能有助于推动该影像引导技术顺利向临床转化。

<table><tbody><tr><td>AnalyzeDirect&amp;nbsp; v12.0</td><td>Caliper</td><td>n/a</td><td>用于微计算机断层扫描（micro-CT）图像处理</td></tr><tr><td>Carprieve, Carprofen 50 mg/mL</td><td>Allivet</td><td>50647</td><td>用于抗炎治疗</td></tr><tr><td>乙基纤维素</td><td>Acros Organics</td><td>9004-57-3</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>伊文思蓝</td><td>Sigma</td><td>E2129-50G</td><td>用于注射可视化</td></tr><tr><td>热水浴锅</td><td>Toolots</td><td>Yidu_HH-S2</td><td>用于制备卡洛芬药杯</td></tr><tr><td>MediGel Sucralose Cups</td><td>ClearH2O</td><td>74-02-5022</td><td>用于递送卡洛芬</td></tr><tr><td>Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock 注射器, 500&amp;mu;L</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>Photoshop 2021</td><td>Adobe</td><td>n/a</td><td>用于图像处理</td></tr><tr><td>Quantum GX2 microCT 成像系统</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>CLS149276</td><td>用于微计算机断层扫描（micro-CT）图像采集</td></tr><tr><td>金属接头针头，33号规格，定制（30&amp;deg;斜面角，0.4英寸，4型针尖）</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>SZM系列体视显微镜</td><td>AmScope</td><td>SM-4TPZ-144</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>无菌蓝色食用染料</td><td>McCormick</td><td>930641</td><td>用于注射可视化</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td>用于溶液配制</td></tr><tr><td>标签贴纸</td><td>DOT Scientific</td><td>DOTSCI-C50</td><td>用于制备卡洛芬药杯</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Calbiochem</td><td>8550-5KG</td><td>用于导管内注射</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Fisher</td><td>14-826-79</td><td>用于制备卡洛芬药杯</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>10153-834</td><td>用于制备卡洛芬药杯</td></tr><tr><td>加热泵/加热垫</td><td>Braintree Scientific</td><td>HTP-1500 120V; AP-R 26E</td><td>用于导管内注射/术前准备</td></tr></tbody></table>

x射线成像观察乙醇基导管内消融治疗预防大鼠模型乳腺癌

X-Ray Visualization of Intraductal Ethanol-Based Ablative Treatment for Prevention of Breast Cancer in Rat Models

目前，用于乳腺癌预防的初级干预措施仍然有限。对于乳腺癌高风险女性而言，最有效的干预手段是预防性乳房切除术。这是一种激进的外科手术，通过完全切除可能发展为乳腺癌的乳腺上皮细胞及其周围组织来实现预防目的。本方案旨在证明一种微创经导管介入方法的可行性，该方法有望成为一种新的乳腺癌初级预防干预手段。这种局部治疗方法可在乳腺上皮细胞恶变之前优先将其消融。密歇根州立大学及其他机构已在乳腺癌啮齿类动物模型中开发出将溶液直接递送至这些上皮细胞的经导管技术。大鼠乳腺由单一的导管树组成，其结构相较于人类乳房更为简单且呈线性排列。然而，化学诱导的大鼠乳腺癌模型为新预防干预措施的概念验证研究以及从小鼠模型向人类应用的可扩展性提供了有价值的工具。本文描述了一种将含氧化钽纳米颗粒（作为X射线对比剂）和乙基纤维素（作为凝胶剂）的乙醇基消融溶液递送至大鼠乳腺导管树的经导管给药方法。既往已有研究报道通过经导管注射方式在小鼠和大鼠模型中递送水溶性试剂（如细胞毒性化合物、siRNA、AdCre）。本方案重点阐述了与递送消融溶液相关的独特方法学改进和操作步骤、为最小化消融溶液局部及全身副作用而进行的制剂设计考量，以及利用X射线成像对导管树填充情况进行体内评估的方法。由于所用消融溶液中含有钽基对比剂，因此可借助透视成像和显微CT技术来判断消融溶液递送的成功与否以及导管树填充的范围。

雌性大鼠的12个乳腺中，每个乳腺均包含一个导管树结构，其通过乳头开口与外界相通。尽管大鼠与小鼠在体型上存在差异，但两者乳腺发育的时间进程以及达到成年阶段的时间非常相似30,31。以下简要描述了作为两种啮齿类动物代表的大鼠乳腺发育的关键阶段。末端芽（TEB）是位于延伸中导管树顶端的高度增殖性结构，可引导导管分支30,31。TEB的增殖高峰及其密度出现在青春期导管树延伸阶段的3至4周龄时期30。到9至10周龄时，随着导管树已生长并占据整个脂肪垫的长度，残留的TEB数量已显著减少30。此后，导管树的生长和扩展与脂肪垫及动物整体的生长保持同步32。在人类乳腺中，末端导管小叶单元（TDLU）发挥着类似于啮齿类动物TEB的功能。TDLU是乳腺癌发生及进展为乳腺癌（BC）的主要起始部位33,34。我们可将最多300 µL的70%乙醇溶液注入9周龄Sprague-Dawley大鼠的胸腹部乳腺导管树中，以完全填充其导管系统（图1，图2，图3）。与小鼠不同20，Sprague-Dawley大鼠的颈区和腹股沟区乳腺乳头在超过80%的动物中通常适合注射，且填充整个导管树一般需要最多100 μL的70%乙醇溶液（图2）。我们常规对最多10个乳腺导管系统注射待研究的消融溶液。典型的实验设计包括两次独立的每周一次导管内（ID）注射，每次对五个交替分布的乳腺导管系统灌注含有X射线对比剂和/或乙基纤维素（EC）作为凝胶剂的消融溶液（图2）。对于含TaOx（50–200 mM）的消融溶液，在每次注射结束后进行透视成像和/或显微CT扫描，以评估并记录每棵导管树对注入溶液（部分或全部剂量）的灌注成功率（图2）。注射后的即时及纵向影像分析可用于评估配方变化（特别是EC凝胶剂浓度）如何影响消融溶液的向外扩散，并确定其随注射体积变化的扩散限制（图3）。此类影像分析可提供关键信息，以确定实现最大程度消融效果的同时将周围组织损伤降至最低的最佳参数。
<img alt="实验流程图：抗炎治疗、术前处理、注射、显微CT、分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：大鼠导管内注射及图像分析流程示意图。 图中突出展示了导管内注射及图像分析的逐步操作流程。更多细节请参见视频。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="注射技术及结果：皮内注射成功、插管、荧光透视、三维显微CT分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：乳头插管及消融溶液递送至多个乳腺的递送结果示例。（A）Sprague-Dawley大鼠品系乳头形态的典型表现。乳头长度与成功插管的可能性相关。较长的乳头比短乳头更容易插管，而过短或退化的乳头则无法插管。一旦完成插管，无论乳头长短，均可灌注溶液并实现相似的递送成功率。注射溶液中的蓝色食用染料可作为导管树填充和递送成功的in vivo证据（对于失败的脂肪垫注射，最明显的特征是穹顶样结构形成）。实时荧光透视成像（B）以及图像采集后生成的三维显微CT重建图像（C）可提供递送成功的in vivo证据，并对溶液是否到达末端芽体（TEBs）进行更定量的评估。（B）第一对腹侧乳腺（#4，#10）分别接受含1% EC的消融溶液（橙色轮廓）或不含EC的溶液（绿色轮廓）。（C）右侧颈区乳腺（#7）、第二对胸区乳腺（#3，#9）和第一对腹区乳腺（#4，#10）成功递送消融溶液（蓝色轮廓），左侧胸区乳腺（#1）注射失败（白色虚线轮廓）。比例尺在不同放大倍数的图像中均对应1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="喷雾模式分析，橙色和绿色表示乙醇浓度变化；顶视图示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64042/64042fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：消融溶液填充与扩散的三维重建与评估。 将含1%乙基纤维素（EC）（上图）或不含EC（下图）的70%乙醇/100 mM TaOx纳米颗粒溶液经导管注入第二对腹侧乳腺（#4和#10）后，立即通过显微CT成像。每只Sprague-Dawley大鼠接受逐渐增加的溶液注射体积。使用图像分析软件包（样条追踪 + 对象传播 + 阈值渲染）重建各个导管树结构。在含1% EC的条件下，可见溶液到达末端。随着给药体积增加，被填充的末端芽（TEB）数量更加明显。所有图像中的比例尺均对应10 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64042/64042fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>表现</td>
			<td colspan="4">解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乳头过短（图 2）</td>
			<td>乳头低平，难以抓取</td>
			<td colspan="4">有时可尝试固定乳头附近的皮肤，并将针头对准乳头中心。针头可能会刺入皮下。缓慢上提时，可能发现乳头略微位于针尖上方，从而有空间抓取并将其完全拉至针尖上。当针头进入皮下时，需特别注意针头角度。若刺入角度不当，容易无意中将药物注入脂肪垫。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>脂肪垫注射（图 2）</td>
			<td>乳头周围甚至乳头本身出现肿胀——若注射液中添加染色剂则更易观察</td>
			<td colspan="4">若在注射最初几微升后乳头即出现肿胀，应立即拔出针头，重新尝试穿刺，并更加注意进针角度。重新开始注射后，密切观察是否再次出现肿胀。若肿胀持续，应放弃本次注射。一旦发生脂肪垫注射，后续成功完成乳头注射的可能性极低。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>伤口/结痂</td>
			<td>乙醇溶液注射部位附近出现开放性伤口或结痂</td>
			<td colspan="4">大鼠比小鼠更容易在注射区域出现伤口或结痂。若发现开放性伤口，应涂抹三重抗生素软膏；但对已结痂的伤口应保持原状，避免干预。在结痂处涂抹软膏可能增加动物抓挠并去除痂皮的风险。应根据伤口严重程度每1–2天检查一次，直至完全愈合。即使超出常规给药时间窗，也应继续给予卡洛芬直至伤口愈合。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>交替注射腺体</td>
			<td>不适用</td>
			<td colspan="4">由于大鼠注射体积较大，若连续注射相邻腺体，更容易导致皮肤擦伤。为最大程度减少注射区域的创伤，建议在单次操作中交替选择腺体进行注射（例如注射第1、3、4、6对腺体，而非连续注射第1–4对）。第三对（#3和#9）与第四对（#4和#10）腺体之间的间距允许在同一次操作中同时注射这两个腺体。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：实用提示与故障排除

本文描述了一种将化学消融溶液递送至大鼠乳腺导管树以进行影像引导下乳腺癌预防治疗的方法。通过直接将导管插入乳头开口并灌注基于70%乙醇的消融溶液，可靶向乳腺上皮细胞，同时最大程度减少对周围组织的损伤。

X射线成像观察乙醇基导管内消融治疗预防大鼠模型乳腺癌

目前针对乳腺癌预防的初级干预措施仍然有限。对于乳腺癌高风险女性，最有效的……

乳腺癌是一种常见且致命的疾病，目前可用的预防策略有限，且常伴随严重的不良副作用。为了提供一种副作用更小的方法，我们开发了一种将基于乙醇的消融溶液注入大鼠乳腺导管树的技术，该技术可实现活体成像与乳腺癌预防的同步进行。该技术基于此前在小鼠中的研究，即通过直接注入乳头开口，可靶向乳腺上皮细胞，同时最大程度减少对周围组织的损伤。小鼠和大鼠的乳腺均含有一个从乳头开口延伸出的单一导管系统。大鼠体型大于小鼠，可注入更大体积的乙醇，便于研究消融效果，从而验证该模型的可扩展性。对该方法的另一项改进是在消融液中添加乙基纤维素。乙基纤维素此前已用于其他临床方法中，以减少乙醇向靶区以外组织的扩散。这一作用通过该化合物的特性实现，即当其接触组织中的液体时会形成凝胶。这种影像验证的乳腺癌预防方法包含五个关键步骤。首先，我们需要使用实验室制备的含蔗糖素凝胶杯对动物进行口服卡洛芬给药。这种长效抗炎治疗在手术前后均需持续进行。接下来，我们使用脱毛膏去除拟注射乳头周围区域的毛发，以完成动物注射前的准备工作。随后在体视显微镜辅助下进行导管内注射，以清晰观察乳头开口并引导针头插入。注射后，通过微型CT或荧光透视成像对动物进行扫描或评估，以确定注射是否成功。随后可对微型CT扫描图像进行处理，重建出被注入的乳腺导管树的三维结构，用于进一步分析导管充填情况。 首先将卡洛芬储备液用PVS稀释至所需浓度。可向混合物中加入无菌食用染料，以更好地确认药物在杯中蔗糖素中的充分混合。然后将杯子置于60摄氏度的水浴中加热15分钟。取出后将杯子干燥，并用70%乙醇清洁杯盖，可降低污染风险。可以使用注射器刺穿杯盖，将卡洛芬溶液直接注入杯中。在此情况下，我们需要注入500 µL以达到预期效果。在摇动杯子前，先用贴纸封住孔洞，摇动15秒，再涡旋振荡15秒。通过观察是否存在深蓝色团块来判断混合是否均匀。处理后的杯子可冷藏保存，待用时取出。应在注射前两到三天准备动物。使用吸入性异氟烷对动物进行麻醉。将麻醉后的 大鼠 转移至保温垫上的鼻罩中。将大鼠置于鼻罩处时，涂抹眼用润滑剂，然后将动物仰卧位固定。使用棉签蘸取脱毛膏，涂抹于计划注射的乳头区域。在目标区域的皮肤上来回擦拭棉签，可更快地松解毛发。应尽量减少将乳膏留在大鼠身上的时间，以避免灼伤皮肤。大鼠对该操作的敏感性甚至高于小鼠。涂抹后10至30秒，使用温水浸湿的纱布彻底清除乳膏。使用三到四次漂洗以确保彻底清除，然后用干净的纱布擦干皮肤。确认去毛区域的乳头清晰可见且易于接触。如有必要，重复脱毛操作。将大鼠置于装有加热垫的清洁恢复笼中，使其从麻醉状态中恢复。大鼠苏醒后，向其所在的饲养笼中放入一片卡洛芬药杯。首先使用吸入性异氟烷麻醉剂对动物进行麻醉，待其完全诱导后，将大鼠转移至鼻罩。在将动物仰卧放置以进行注射前，应先涂抹眼用润滑剂。可选择用胶带固定住将要注射的乳头附近的腿部，但此步骤并非必需。准备好含有预定注射体积溶液的注射器后，用精细尖头镊子（如果可能）清除乳头表面可见的死皮，以完成乳头的准备工作。最常见的关注区域是乳头开口本身。大鼠的开口处常有栓塞物突出。去除该栓塞物有助于更好地进行插管。在可见针头斜面的情况下，借助尖头镊子的辅助引导，将针头插入乳头尖端。注意沿乳头开口的走向进针。大鼠乳头周围通常有较多脂肪组织，容易误穿入脂肪组织，且因针头推进时有阻力感，可能误认为已成功插管。当针尖斜面完全被乳头包围后，开始缓慢注射溶液。大鼠的推荐注射速率为每分钟约 100 µL。为避免对导管系统造成可能的损伤，切勿以更快的速度注射。注射完成后，用镊子辅助，等待30秒后再将针头从乳头处取出，以减少乳头溢液的可能性。若发生溢液，可用湿润的纱布或乙醇擦拭巾清洁溢出的溶液。对比度和溢出的溶液可能会扭曲所获取的图像。此处我们看到刚才显示的注射过程的放大视频。请注意，动物的呼吸使得难以将乳头保持在单一焦平面上。由于乳头位置不固定，这会使注射更加困难。靠近肋骨以及最上方三对腺体进一步加剧了这一问题。目前乳头开口处的堵塞物已被移除，以利于更好地进行插管。现在可将针头斜面向上，借助镊子将其推进乳头内。一旦斜面完全插入，即可开始注射。如果仔细观察乳头左侧，可能会注意到蓝色加深的区域，此处注射液在导管树中轻微扩散，隐约可见。由于大鼠皮肤较厚，这种情况明显不明显。在此我们可以看到注射完成后30秒拔出针头，以及随之从乳头溢出的溶液。多余的溶液被清理干净，以便观察注射区域，可见乳头无损伤，且无局部隆起，后者可能提示注射进入了脂肪垫。若注射含有乙醇的溶液，需注意避免酒精中毒。这要求明确单次注射可接受的乙醇剂量，并在操作过程中腹腔注射含蔗糖的溶液以抵消其影响。注射后，动物可置于清洁笼具中的加热垫上恢复，或转移至微型CT设备进行成像，以评估注射效果。将注射后的动物转移至微计算机断层扫描（microCT）仪器后，需继续给予异氟烷以在成像过程中维持麻醉状态。由于大鼠体型较大，需要进行额外的体位调整才能获得良好的图像。在将腿部固定于成像部位附近之前，先将其脊柱伸直，有助于获得一致的图像。将腿部固定在伸展位置，可防止骨骼成为图像的焦点。我们还发现，将胶带横跨大鼠腹部固定，有助于减少下部腺体的呼吸伪影。对于导管结构的观察，有多种可接受的扫描参数。然而，在选择参数时应始终考虑辐射剂量。这些扫描所产生的辐射剂量不应超过给定品系大鼠的辐射限值。与图像采集相比，采用透视分析可显著降低总体辐射负担。完成所有扫描或评估后，可将动物放回干净的恢复笼中，并置于加热垫上。应持续监测动物状态，直至其完全恢复后送回饲养笼。卡洛芬药杯应持续提供，至少持续至注射后七天。我们所使用的微计算机断层扫描（microCT）仪器上的软件可生成快速渲染图像，以在不进行正式分析的情况下评估注射效果。该功能配有简单的对比度滑块，可实现合理的信噪比降低。这些渲染图像的主要缺陷在于，必须同时对整幅图像进行阈值分割。这使得饮食中的铁等明显不属于导管树的明亮信号仍保留在图像中。在某些情况下，此处所示的真实信号与背景亮度相近，容易在阈值处理时被排除出图像。使用更复杂的分析软件对感兴趣区域进行分割，可获得更理想的正式图像呈现。为了获得注射后导管树的最佳成像效果，最好将乳腺脂肪垫进行分割，以便进行后续的图像处理。可通过在整个动物体厚范围内以样条曲线追踪乳腺脂肪垫的深色边界来实现此分割。根据我们的经验，每间隔两个切片进行一次轮廓追踪，并将对象进行传播，即可完整捕捉到整个导管结构。此时，可以使用给定的灰度范围对图像进行阈值处理，仅显示乳腺脂肪垫内的对比度。该范围应包括导管树内的造影剂以及邻近区域的任何渗漏。五氧化二钽溶液通常在 300 至 3000 HU 范围内显示良好。在完成导管树的重建后，可进一步进行分析。如果不需要进行纵向成像，可获取更高分辨率的图像，以更好地呈现导管树的复杂结构。不同动物之间的差异可能导致注射操作难度有所不同。由于我们目前仅使用Sprague Dawley大鼠进行实验，因此无法对不同品系之间的变异情况进行讨论。一些动物的乳头较为扁平，如图所示，这会增加操作难度，导致插管难以成功。另一些动物的乳头则较为突出，如图所示，这类乳头更易于进行插管。此处展示的是成功插管后的乳头。插管困难可能导致乳头损伤，如此处所示。注射后立即获取显微CT图像，可帮助研究人员更好地判断注射是否成功，并有助于识别某些溶液的填充特性。此处我们观察到同一只大鼠的腹部腺体不同部位，均注射了相同体积的消融溶液，该溶液含有70%乙醇，并通过100毫摩尔的五氧化二钽提供对比度。上部腺体中使用的溶液还含有1%的乙基纤维素。我们在导管分支的末端观察到类似壁的结构。这些是充满溶液且未溢出的末端芽状结构。在底行图像中，我们观察到导管末端结构较不清晰，表明溶液从导管系统中逸出。结合组织学检查中较局限的附带损伤，这似乎表明含有乙基纤维素的溶液在导管系统中的滞留效果更佳。该方法为乳腺癌预防的微创技术向规模化应用迈出了重要一步，为预防性乳房切除术提供了一种替代选择。在较大的啮齿类动物模型中，已成功实现上皮消融，且对动物的副作用极小。在消融液中添加乙基纤维素可增强溶液在注射部位的滞留性，从而减少对周围组织的损伤。利用已通过临床验证的溶液，并结合常用成像方式可视化递送效果的新颖应用，有助于快速向临床转化。

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JoVE Journal

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