X射线成像观察乙醇基导管内消融治疗预防大鼠模型乳腺癌

乳腺癌是一种常见且致命的疾病，目前可用的预防策略有限，且常伴随严重的不良副作用。为了提供一种副作用更小的方法，我们开发了一种将基于乙醇的消融溶液注入大鼠乳腺导管树的技术，该技术可实现活体成像与乳腺癌预防的同步进行。该技术基于此前在小鼠中的研究，即通过直接注入乳头开口，可靶向乳腺上皮细胞，同时最大程度减少对周围组织的损伤。

小鼠和大鼠的乳腺均含有一个从乳头开口延伸出的单一导管系统。大鼠体型大于小鼠，可注入更大体积的乙醇，便于研究消融效果，从而验证该模型的可扩展性。对该方法的另一项改进是在消融液中添加乙基纤维素。

乙基纤维素此前已用于其他临床方法中，以减少乙醇向靶区以外组织的扩散。这一作用通过该化合物的特性实现，即当其接触组织中的液体时会形成凝胶。这种影像验证的乳腺癌预防方法包含五个关键步骤。

首先，我们需要使用实验室制备的含蔗糖素凝胶杯对动物进行口服卡洛芬给药。这种长效抗炎治疗在手术前后均需持续进行。接下来，我们使用脱毛膏去除拟注射乳头周围区域的毛发，以完成动物注射前的准备工作。

随后在体视显微镜辅助下进行导管内注射，以清晰观察乳头开口并引导针头插入。注射后，通过微型CT或荧光透视成像对动物进行扫描或评估，以确定注射是否成功。随后可对微型CT扫描图像进行处理，重建出被注入的乳腺导管树的三维结构，用于进一步分析导管充填情况。

首先将卡洛芬储备液用PVS稀释至所需浓度。可向混合物中加入无菌食用染料，以更好地确认药物在杯中蔗糖素中的充分混合。然后将杯子置于60摄氏度的水浴中加热15分钟。

取出后将杯子干燥，并用70%乙醇清洁杯盖，可降低污染风险。可以使用注射器刺穿杯盖，将卡洛芬溶液直接注入杯中。在此情况下，我们需要注入500 µL以达到预期效果。

在摇动杯子前，先用贴纸封住孔洞，摇动15秒，再涡旋振荡15秒。通过观察是否存在深蓝色团块来判断混合是否均匀。处理后的杯子可冷藏保存，待用时取出。

应在注射前两到三天准备动物。使用吸入性异氟烷对动物进行麻醉。将麻醉后的 大鼠 转移至保温垫上的鼻罩中。

将大鼠置于鼻罩处时，涂抹眼用润滑剂，然后将动物仰卧位固定。使用棉签蘸取脱毛膏，涂抹于计划注射的乳头区域。在目标区域的皮肤上来回擦拭棉签，可更快地松解毛发。

应尽量减少将乳膏留在大鼠身上的时间，以避免灼伤皮肤。大鼠对该操作的敏感性甚至高于小鼠。涂抹后10至30秒，使用温水浸湿的纱布彻底清除乳膏。

使用三到四次漂洗以确保彻底清除，然后用干净的纱布擦干皮肤。确认去毛区域的乳头清晰可见且易于接触。如有必要，重复脱毛操作。

将大鼠置于装有加热垫的清洁恢复笼中，使其从麻醉状态中恢复。大鼠苏醒后，向其所在的饲养笼中放入一片卡洛芬药杯。首先使用吸入性异氟烷麻醉剂对动物进行麻醉，待其完全诱导后，将大鼠转移至鼻罩。

在将动物仰卧放置以进行注射前，应先涂抹眼用润滑剂。可选择用胶带固定住将要注射的乳头附近的腿部，但此步骤并非必需。准备好含有预定注射体积溶液的注射器后，用精细尖头镊子（如果可能）清除乳头表面可见的死皮，以完成乳头的准备工作。

最常见的关注区域是乳头开口本身。大鼠的开口处常有栓塞物突出。去除该栓塞物有助于更好地进行插管。

在可见针头斜面的情况下，借助尖头镊子的辅助引导，将针头插入乳头尖端。注意沿乳头开口的走向进针。大鼠乳头周围通常有较多脂肪组织，容易误穿入脂肪组织，且因针头推进时有阻力感，可能误认为已成功插管。

当针尖斜面完全被乳头包围后，开始缓慢注射溶液。大鼠的推荐注射速率为每分钟约 100 µL。为避免对导管系统造成可能的损伤，切勿以更快的速度注射。

注射完成后，用镊子辅助，等待30秒后再将针头从乳头处取出，以减少乳头溢液的可能性。若发生溢液，可用湿润的纱布或乙醇擦拭巾清洁溢出的溶液。

对比度和溢出的溶液可能会扭曲所获取的图像。此处我们看到刚才显示的注射过程的放大视频。请注意，动物的呼吸使得难以将乳头保持在单一焦平面上。

由于乳头位置不固定，这会使注射更加困难。靠近肋骨以及最上方三对腺体进一步加剧了这一问题。目前乳头开口处的堵塞物已被移除，以利于更好地进行插管。

现在可将针头斜面向上，借助镊子将其推进乳头内。一旦斜面完全插入，即可开始注射。如果仔细观察乳头左侧，可能会注意到蓝色加深的区域，此处注射液在导管树中轻微扩散，隐约可见。

由于大鼠皮肤较厚，这种情况明显不明显。在此我们可以看到注射完成后30秒拔出针头，以及随之从乳头溢出的溶液。多余的溶液被清理干净，以便观察注射区域，可见乳头无损伤，且无局部隆起，后者可能提示注射进入了脂肪垫。

若注射含有乙醇的溶液，需注意避免酒精中毒。这要求明确单次注射可接受的乙醇剂量，并在操作过程中腹腔注射含蔗糖的溶液以抵消其影响。注射后，动物可置于清洁笼具中的加热垫上恢复，或转移至微型CT设备进行成像，以评估注射效果。

将注射后的动物转移至微计算机断层扫描（microCT）仪器后，需继续给予异氟烷以在成像过程中维持麻醉状态。由于大鼠体型较大，需要进行额外的体位调整才能获得良好的图像。在将腿部固定于成像部位附近之前，先将其脊柱伸直，有助于获得一致的图像。

将腿部固定在伸展位置，可防止骨骼成为图像的焦点。我们还发现，将胶带横跨大鼠腹部固定，有助于减少下部腺体的呼吸伪影。对于导管结构的观察，有多种可接受的扫描参数。

然而，在选择参数时应始终考虑辐射剂量。这些扫描所产生的辐射剂量不应超过给定品系大鼠的辐射限值。与图像采集相比，采用透视分析可显著降低总体辐射负担。

完成所有扫描或评估后，可将动物放回干净的恢复笼中，并置于加热垫上。应持续监测动物状态，直至其完全恢复后送回饲养笼。卡洛芬药杯应持续提供，至少持续至注射后七天。

我们所使用的微计算机断层扫描（microCT）仪器上的软件可生成快速渲染图像，以在不进行正式分析的情况下评估注射效果。该功能配有简单的对比度滑块，可实现合理的信噪比降低。这些渲染图像的主要缺陷在于，必须同时对整幅图像进行阈值分割。

这使得饮食中的铁等明显不属于导管树的明亮信号仍保留在图像中。在某些情况下，此处所示的真实信号与背景亮度相近，容易在阈值处理时被排除出图像。使用更复杂的分析软件对感兴趣区域进行分割，可获得更理想的正式图像呈现。

为了获得注射后导管树的最佳成像效果，最好将乳腺脂肪垫进行分割，以便进行后续的图像处理。可通过在整个动物体厚范围内以样条曲线追踪乳腺脂肪垫的深色边界来实现此分割。根据我们的经验，每间隔两个切片进行一次轮廓追踪，并将对象进行传播，即可完整捕捉到整个导管结构。

此时，可以使用给定的灰度范围对图像进行阈值处理，仅显示乳腺脂肪垫内的对比度。该范围应包括导管树内的造影剂以及邻近区域的任何渗漏。五氧化二钽溶液通常在 300 至 3000 HU 范围内显示良好。在完成导管树的重建后，可进一步进行分析。

如果不需要进行纵向成像，可获取更高分辨率的图像，以更好地呈现导管树的复杂结构。不同动物之间的差异可能导致注射操作难度有所不同。由于我们目前仅使用Sprague Dawley大鼠进行实验，因此无法对不同品系之间的变异情况进行讨论。

一些动物的乳头较为扁平，如图所示，这会增加操作难度，导致插管难以成功。另一些动物的乳头则较为突出，如图所示，这类乳头更易于进行插管。此处展示的是成功插管后的乳头。

插管困难可能导致乳头损伤，如此处所示。注射后立即获取显微CT图像，可帮助研究人员更好地判断注射是否成功，并有助于识别某些溶液的填充特性。此处我们观察到同一只大鼠的腹部腺体不同部位，均注射了相同体积的消融溶液，该溶液含有70%乙醇，并通过100毫摩尔的五氧化二钽提供对比度。

上部腺体中使用的溶液还含有1%的乙基纤维素。我们在导管分支的末端观察到类似壁的结构。这些是充满溶液且未溢出的末端芽状结构。

在底行图像中，我们观察到导管末端结构较不清晰，表明溶液从导管系统中逸出。结合组织学检查中较局限的附带损伤，这似乎表明含有乙基纤维素的溶液在导管系统中的滞留效果更佳。

该方法为乳腺癌预防的微创技术向规模化应用迈出了重要一步，为预防性乳房切除术提供了一种替代选择。在较大的啮齿类动物模型中，已成功实现上皮消融，且对动物的副作用极小。在消融液中添加乙基纤维素可增强溶液在注射部位的滞留性，从而减少对周围组织的损伤。

利用已通过临床验证的溶液，并结合常用成像方式可视化递送效果的新颖应用，有助于快速向临床转化。