毫秒级氢/氘交换质谱法用于生理条件下α-突触核蛋白结构动力学研究

所有生物体的蛋白质组中都存在无序区域，其比例估计高达33%。这些区域可通过氢/氘交换质谱法检测，但仅限于毫秒时间范围内。本实验方案将指导您如何成功完成该操作。这是一种完全自动化的分析技术。

您只需完成所有设置，设定所需的时间测量程序，点击开始后即可离开。该技术为筛选能够稳定内在无序蛋白（如α-突触核蛋白）特定构象的化合物提供了令人振奋的机会。开始进行肽图谱分析的样品制备时，首先从-80摄氏度冰箱中取出一管储存的α-突触核蛋白原液。

待其解冻后，使用 0.22 微米针头滤器过滤。然后在 218 纳米处测定溶液的吸光度，利用比尔-朗伯定律确定蛋白质浓度，并用平衡缓冲液将蛋白质稀释至终浓度为 5 微摩尔。接下来，设置自动进样机器人：将 50 微升 5 微摩尔的蛋白质溶液加入一个完全回收小瓶中，并将该小瓶置于氢/氘交换（HDX）机器人右侧腔室的样品位置，与质谱仪联用。

然后将一管平衡缓冲液和两管胃蛋白酶洗涤缓冲液分别放入左侧腔室的试剂位1、4和5，将一管淬灭缓冲液放入HDX右侧腔室的试剂位1，并使用帕尔帖温度控制器将温度设置为20摄氏度。接着，在HDX左侧腔室和HDX右侧腔室的相同反应位中，分别加入相同数量的总回收管和最大回收管。接下来，在调度软件中设置包含适当液相色谱和质谱方法的样品列表，并启动运行程序。

为了获得最终的肽段覆盖图，需在 DynamX HDX 数据分析软件中手动校正同位素峰归属。在清洗 Fast HDX 原型仪器后，打开兼容的 HDX 软件图形用户界面以初始化系统。将样品室和淬灭室的温度分别设置为 20 °C 和 0.5 °C，然后点击“设置”以应用新的温度参数。

为清洁和准备仪器，将所有进样口连接装有液相色谱-质谱级水的离心管，然后在滴定仪管路输送选项卡中检查左右两侧的注射器，并持续点击“启动”直至管路中所有残留气泡完全排出。为完成注射器的各项检查，请先转至宏选项卡，点击“校准注射器初始位置”，随后依次点击“清洗注射器加载环”和“清洗所有混合环体积”。若缓冲液注射器中存在气泡，应断开注射器连接，并通过垂直排出气泡的方式进行脱气处理。

在重新校准至零位之前，更换注射器。为设置用于HDX实验的Fast HDX原型仪器，首先将左侧滴定进样管插入总回收小瓶中。为防止温度诱导的寡聚化和聚集，将该管置于台式冰箱中。

接下来，将50毫升的平衡缓冲液、标记缓冲液、淬灭缓冲液和胃蛋白酶洗涤缓冲液分别加入仪器右侧和左侧腔室的相应缓冲液入口，随后向胃蛋白酶洗涤入口加入50毫升柱洗涤缓冲液。为启动蛋白质和柱洗涤管路，进入滴定仪管路输送选项卡，检查右侧和左侧的注射器，然后点击“启动”一次。按照之前演示的方法，勾选所有注射器对应的复选框后，转至手动淬灭流选项卡，输入所需的设置参数。

对于时间进程实验，使用符号点按钮以毫秒为单位输入时间。然后将捕获时间设置为3，将等待HPLC的时间设置为捕获时间加上运行时间再加1.5分钟。如果在样品运行之间进行空白实验，请确保在每次样品运行后，采集软件中已设置空白运行的条目，然后勾选“运行空白”复选框。

当样本列表准备就绪并已选中相应条目后，在软件中单击“播放”和“Fast HDX”以开始运行。进行数据处理时，打开肽图谱实验中已进行光谱归属的肽段文件的文件菜单，在 DynamX 软件中单击“打开”，然后将原始文件导入 DynamX 软件。打开数据菜单后，单击“MS Files”。

为研究的每种蛋白质条件创建状态，请点击“新建状态”。为添加每个氢氘交换时间点，请点击“新建曝光”，然后点击“新建原始数据”。要导入原始文件，请将每个文件拖动到正确位置，完成后点击“确定”。

在自动分配同位素后，需手动校正同位素分配，以确保数据质量。按照论文中描述的列顺序，将簇数据导出为 csv 文件。在质谱分析软件中打开数据菜单，然后点击导出簇数据。

进行数据分析时，首先将导出的聚类数据载入氢氘交换分析软件 HDfleX。为拟合所有实验及状态的实验数据，需选择适当的回补交换校正方法，以获得氢氘交换反应的观测速率常数。然后在 HDfleX 中使用首选方法计算全局显著性阈值，并进行混合显著性检验，以确定各状态间的显著差异。

α-突触核蛋白的作图实验生成了覆盖蛋白质序列100%的肽段覆盖图，平均冗余度为3.79。此外，本方案能够生成α-突触核蛋白不同肽段的氘代摄取曲线，并以拟合后并经反向交换校正的图示形式呈现。显然，α-突触核蛋白中大部分氢/氘交换在1秒内完成。

α-突触核蛋白在状态A与状态B之间的构象差异在肽段和氨基酸水平上均表现为状态B具有更高的氘代摄取量。对于此类高灵敏度的技术，在比较数据时采用可靠的统计显著性检验至关重要。本研究中，我们使用了软件HDfleX。