毫秒氢/氘交换质谱法用于生理条件下α-突触核蛋白结构动力学的研究

单体α-突触核蛋白的结构集合影响其生理功能和理化性质。本方案描述了如何进行毫秒氢/氘交换质谱和随后的数据分析，以确定在生理条件下这种内在无序蛋白质的单体的构象信息。

所有生物体的蛋白质组都有紊乱，估计高达33%这些区域可以通过氢/氘交换质谱观察到，但只能在毫秒内。我们的协议将向您展示如何成功执行此操作。这是一种全自动分析技术。

您只需设置所有内容，对所需的时间测量进行编程，然后按"开始"即可离开。这项技术开辟了筛选化合物的令人兴奋的机会，这些化合物可以稳定内在无序蛋白质（如α-突触核蛋白）的特异性确认。要开始肽图的样品制备，首先从零下80摄氏度的冰箱中取出一小瓶储存的α-突触核蛋白原液。

一旦解冻，使用0.22微米注射器过滤器进行过滤。然后测量溶液在218纳米处的吸光度，以使用Beer-Lambert定律确定蛋白质浓度，并用平衡缓冲液将蛋白质稀释至最终浓度为5微摩尔。接下来，要设置自动进样机器人，将50微升的五微摩尔蛋白溶液加入到总回收小瓶中，并将小瓶放置在与质谱仪一致的氢/氘交换或HDX机器人的右室中的样品位置。

然后将一瓶平衡缓冲液和两小瓶胃蛋白酶洗涤缓冲液放入左侧腔室的试剂位置，并将一小瓶淬灭缓冲液放入HDX右腔室中的试剂位置，并使用帕尔贴温度控制器将温度设置为20摄氏度。然后分别在HDX左室和HDX右室的相同反应位置添加等量的总回收小瓶和最大回收小瓶。接下来，在调度软件中使用适当的LC和MS方法设置示例列表并启动调度。

要获得最终的肽覆盖图谱，请在 DynamX HDX 数据分析软件中手动整理同位素分配。清洁快速 HDX 原型仪器后，打开兼容 HDX 软件的图形用户界面以初始化系统。分别输入20摄氏度和0.5摄氏度作为样品室和淬火室温度，然后单击设置以应用新温度。

要清洁和准备仪器，请在所有入口处用LC / MS级水设置离心管，然后在滴定仪管道输送选项卡中检查左右注射器，并继续单击Prime，直到管中所有潜在的气泡消失。要选中注射器的所有框，首先转到宏选项卡并单击校准注射器主位置，然后首先单击洗涤注射器负载循环，然后洗涤所有混合循环体积。如果缓冲注射器中有任何气泡，请断开注射器的连接，然后通过垂直弹出气泡对其进行脱气。

在重新校准到零位置之前，请更换注射器。要为 HDX 实验设置快速 HDX 原型仪器，首先将左侧滴定进样管插入整个回收瓶中。为了防止温度诱导的齐聚和聚集，请将管子放在桌面冰箱中。

接下来，将50毫升平衡，标记，淬灭和胃蛋白酶洗涤缓冲液加入到仪器左右腔室的相应缓冲液入口中，然后在胃蛋白酶洗涤入口中加入50毫升柱洗缓冲液。要启动蛋白质和色谱柱清洗线，请在滴定仪管道输送选项卡中检查左右注射器，然后单击一次启动。如前所述，选中注射器的所有框后，转到手动淬火流选项卡以输入所需的设置。

对于时程实验，请使用符号点按钮以毫秒为单位输入时间。然后将陷阱时间设置为三，并等待HPLC捕获时间加上运行时间加1.5分钟。如果在样品运行之间运行空白实验，请在确保每次样品运行后在采集软件中输入空白运行后，单击运行空白框。

一旦示例列表准备就绪并突出显示了相应的条目，请在软件中单击播放和快速 HDX 开始运行。对于数据处理，请打开肽图分析实验中光谱分配的肽文件的文件菜单，在 DynamX 软件中单击"打开"，然后将原始文件导入 DynamX 软件。打开数据菜单后，单击MS文件。

要为正在研究的每种蛋白质状况创建状态，请单击新状态。要添加每个 HDX 时间点，请单击"新曝光"，然后单击"新建原始"。要导入原始文件，请将每个文件拖动到正确的位置，并在完成后单击"确定"。

自动分配同位素后，手动管理同位素分配以确保高数据质量。将集群数据导出为csv文件中，并按照手稿中所述的列顺序。打开质量测量软件中的数据菜单，然后单击导出集群数据。

对于数据分析，首先将导出的聚类数据加载到 HDX 分析软件 HDfleX 中。要拟合所有实验和状态的实验数据，请选择适当的反向交换校正方法，以获得HDX反应的观测速率常数。然后使用HDfleX中的首选方法计算全局显著性阈值，并执行混合显著性测试以确定所比较状态之间的显着差异。

α-突触核蛋白的映射实验生成了一个肽覆盖图谱，覆盖了100%的蛋白质序列，平均冗余度为3.79。此外，该协议能够为不同的α-突触核蛋白肽生成氘摄取曲线，然后将其表示为拟合和反向交换校正图。很明显，α-突触核蛋白中的大多数氢/氘交换都是在一秒钟内完成的。

α-突触核蛋白A和B状态A和B之间的构象差异也从B状态在肽和氨基酸水平上较高的氘吸收中明显可见。对于这种敏感技术，在比较数据时使用稳健的统计显著性检验非常重要。在这里，我们使用了我们的软件 HDfleX。