通过二级粘附法从大鼠骨骼中分离单核细胞 - 巨噬细胞谱系细胞

在该方案中，通过二级依从性方法提取骨髓单核细胞 - 巨噬细胞。骨髓单核细胞 - 巨噬细胞可以成功分化为破骨细胞，这为体外破骨细胞的研究提供了稳定的细胞模型。该方法适用于小骨髓样品，无需高科技实验室设备即可简单快速地从骨髓中提取骨髓单核细胞 - 巨噬细胞。

破骨细胞的增加可能是骨质疏松症的潜在发病机制。骨髓单核细胞-巨噬细胞作为破骨细胞前体细胞具有一定的研究价值。首先，将安乐死的大鼠浸泡在75%的酒精中10分钟进行消毒。

用剪刀和镊子小心地取出大鼠的所有四肢后，用移液管用PBS吸出并冲洗粘附在四肢上的血液。然后在两毫升的10%FBS DMEM中放入一个五毫升的管中。将肢体骨转入五毫升管中后，用剪刀将管中的肢体骨切成小块，混合匀浆，将骨髓细胞重悬于培养基中。

静置五分钟，直到组织碎片沉降到管的底部。接下来，将10毫升10%FBS DMEM加入100毫米培养皿中，然后将上清液转移到培养皿中。在37摄氏度的5%二氧化碳中孵育约24小时。

在此孵育时间之后，大多数间充质干细胞将粘附在培养皿壁上并缓慢生长，而大多数骨髓单核细胞 - 巨噬细胞仍将悬浮在培养基中。将100毫米培养皿中的细胞悬浮液转移到新的25厘米见方的烧瓶中，并继续在37摄氏度的5%二氧化碳中培养细胞24小时。小心取出旧培养基后，在骨髓单核细胞 - 巨噬细胞粘附在烧瓶壁上后，用新鲜培养基替换。

流式细胞术显示，表达CD11b和c（单核细胞-巨噬细胞谱系细胞表面的分子标志物）的细胞比例约为37.94%，随着细胞的连续增殖，大多数细胞在不规则形状内变大并生长成径向贴壁盘。TRAP染色结果显示，与对照组相比，用核因子kappa B配体受体激活剂和巨噬细胞集落刺激因子诱导的细胞内紫红色颗粒数量显著增加。蛋白质印迹分析表明，与对照组相比，处理细胞中破骨细胞特异性蛋白TRAP和组织蛋白酶K的表达水平显着增加。

在这个过程中最重要的是收集次级贴壁细胞的时间在24至48小时的原代培养物中，骨髓单核细胞巨噬细胞开始完全粘附。通过该方法分离的骨髓单核细胞 - 巨噬细胞可以在体外诱导成破骨细胞，为骨质疏松症的研究提供稳定的细胞模型。