Name: 通过二级粘附法从大鼠骨骼中分离单核细胞 - 巨噬细胞谱系细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: 了解二级粘附法分离大鼠骨髓单核-巨噬细胞的技术流程。该方法可高效获得破骨细胞前体细胞，为体外研究破骨细胞分化和骨质疏松症发病机制提供稳定的细胞模型。

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本工作由浙江省自然科学基金（资助号：LY19H060001）和浙江省中医药科学技术计划项目（编号：2022ZB093）资助。

本研究中的所有实验均按照浙江中医药大学实验动物研究中心的动物实验指南进行（批准号：IACUC-20181029-11）。
1. 细胞提取
<ol>
	<li>将 Sprague-Dawley 大鼠（SD 大鼠，1-10 日龄，雄性或雌性）放入充满 CO2 的安乐死箱中，以每分钟 30%-70% 容器体积的平衡速率通入气体。待大鼠失去意识（20-60 分钟）后，通过颈椎脱位法处死大鼠，以确保无痛死亡。</li>
	<li>将大鼠浸入 75% 酒精中消毒 10 分钟。</li>
	<li>使用剪刀和镊子小心去除大鼠的所有四肢，用移液器吸取 PBS 冲洗，并冲洗掉附着在四肢上的血液。</li>
	<li>将 5 mL 青霉素/链霉素溶液加入 500 mL DMEM 培养基中，充分混匀。取一个 50 mL 无菌离心管，加入 5 mL FBS 和 45 mL DMEM 培养基，彻底混匀，得到含 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。取 2 mL 上述培养基加入一个 5 mL 离心管中。</li>
	<li>将四肢骨骼转移至该 5 mL 离心管中。用剪刀在管内将骨骼剪成小块（1-3 mm），混匀匀浆液，使骨髓细胞重新悬浮于培养基中。静置 5 分钟，直至组织碎片沉降至管底。</li>
	<li>向 100 mm 培养皿中加入 10&#160;mL 含 10% FBS 的 DMEM 培养基，然后将上清液转移至该培养皿中。吸取上清液时，避免将组织碎片转移至培养皿中。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下培养约 24 小时。培养结束后，大部分间充质干细胞将贴附于培养皿壁并缓慢生长，而大多数骨髓来源巨噬细胞（BMMs）仍悬浮于培养基中。</li>
	<li>将 100 mm 培养皿中的细胞悬液转移至新的 25 cm2 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 24 小时。BMMs 通常在培养 24-48 小时后贴附于瓶壁。待 BMMs 完全贴壁后，小心移除旧培养基，并更换为新鲜培养基。</li>
	<li>当培养瓶中细胞融合度达到 80%-90% 时进行传代培养。 
	&#8203;注意：所有细胞均在 37 °C、5% CO2 条件下培养。培养过程中，细胞形态逐渐趋于均一，表现为体积较大、形状不规则、呈放射状生长，并以盘状贴附于培养瓶表面，可观察到多个细胞核。</li>
</ol>
2. 细胞的FACS染色
<ol>
	<li>使用1-2 mL商品化胰蛋白酶在37 °C、5% CO2条件下消化5分钟，收集继代贴壁细胞，并进行细胞计数以确保每样本终末细胞数为100,000个（使用Neubauer血细胞计数板计数细胞）。</li>
	<li>将细胞分为三组（每500 µL PBS中含100,000个细胞）：(1) 空白对照组，不进行染色的细胞；(2) 同型对照组；(3) 实验组（CD11b/c染色）。</li>
	<li>将一抗（空白对照组不加抗体；同型对照组加入抗CD11同型对照抗体，每样本0.6 µL，1 µg/样本；实验组加入抗CD11b/c抗体，每样本1 µL，1 µg/样本）置于冰上避光孵育30分钟。</li>
	<li>以300-350 × g离心5分钟，弃上清，加入500 µL PBS重悬细胞。重复上述步骤一次，以确保未结合的一抗被充分洗去。</li>
	<li>加入相应的二抗（空白对照组不加抗体；同型对照组和实验组均加入羊抗兔IgG，每样本0.25 µL抗体，稀释比例1:2,000），置于冰上避光孵育30分钟。</li>
	<li>以300-350 × g离心5分钟，弃上清，加入500 µL PBS重悬细胞。重复上述步骤一次，以确保未结合的二抗被充分洗去。</li>
	<li>通过流式细胞术检测CD11b/c阳性细胞（每样本检测10,000个细胞），并使用软件（例如FlowJo 7.5）分析数据。 
	&#8203;注意：计算CD11b/c+细胞最终百分比时，采用以下公式：实验组中CD11b/c+细胞百分比减去同型对照组中CD11+细胞百分比。</li>
</ol>
3. 瑞氏-吉姆萨染色
<ol>
	<li>将已传代三次的贴壁继代细胞接种于35 mm2的细胞爬片上（每孔1 × 106个细胞），在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>弃去培养基，用PBS洗涤三次。</li>
	<li>向细胞爬片中加入瑞氏-吉姆萨染液（0.5 mL–0.8 mL），染色1分钟。</li>
	<li>用棉签将染液与蒸馏水（0.5 mL–0.8 mL）混合，静置10分钟。</li>
	<li>用蒸馏水洗去染液，干燥1–3分钟，显微镜下观察。</li>
</ol>
4. TRAP 染色
<ol>
	<li>将已传代三次的贴壁继代细胞接种至35 mm2的细胞爬片上（每孔1 × 106个细胞），在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>弃去旧培养基，更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基或添加了50 ng/mL核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）和30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的破骨细胞诱导培养基，在37 °C、5% CO2条件下继续培养7天。</li>
	<li>按照试剂盒说明书使用TRAP染色试剂盒对细胞进行染色，并在显微镜下观察。 
	&#8203;注意：TRAP阳性细胞定义为破骨细胞，在光学显微镜下呈紫色。使用ImageJ软件计数TRAP阳性细胞数量。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹
<ol>
	<li>将已传代三次的贴壁继代细胞接种于35 mm2的细胞爬片上（每孔1 × 106个细胞），培养24小时。</li>
	<li>弃去旧培养基，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基或破骨细胞诱导培养基（含50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF），在37 °C、5% CO2条件下继续培养7天。</li>
	<li>使用RIPA裂解液提取总细胞蛋白，经10% SDS-PAGE分离后，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜18,19。</li>
	<li>用5%脱脂奶粉（25 mL）封闭2小时，随后用TBS-Tween 20（TBST）洗涤3次，每次10分钟。</li>
	<li>加入一抗（抗β-actin、抗TRAP和抗组织蛋白酶K抗体；所有一抗均按1:1,000稀释，每条带加入10 mL稀释后的抗体），4 °C孵育过夜，然后用TBST洗涤3次。</li>
	<li>室温下加入二抗（辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，按1:2,000稀释，每条带加入10 mL稀释后的抗体）孵育2小时，再用TBST洗涤3次，最后使用显色液显影蛋白条带。 
	注意：上述蛋白的表达水平均以β-actin作为内参进行标准化处理。</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争利益。

破骨细胞是参与骨疾病发生与发展的最重要细胞类型之一，也是骨疾病研究的主要对象之一20单核细胞/巨噬细胞可分化为破骨细胞。由于单核巨噬细胞（RAW264.7细胞）购买成本较高，且在培养过程中易于被激活，因此难以进行 体外 使用该细胞系进行分化实验。尽管已有多种方法用于从骨髓中分离单核细胞/巨噬细胞，包括密度梯度离心、胶原酶消化、微球富集和流式细胞术表1），这些方法耗时较长，且需要较大的样本量和昂贵的设备。因此，本研究旨在提出一种简单快速的方法，从骨髓样本中提取单核细胞/巨噬细胞。
骨髓中存在多种细胞群体，除骨髓单核细胞（BMMs）外，还包括骨髓间充质干细胞（BMSCs）、内皮细胞和免疫细胞。众所周知，BMSCs可分化为成骨细胞，而这一过程将影响BMMs向破骨细胞的分化。21均匀且稳定的BMMs是诱导破骨细胞分化的关键因素 体外因此，在分离和提取BMMs时，尤其需要考虑这些限制因素。同时，BMMs向破骨细胞分化的潜能也会随...

据报道，存在于骨髓中的单核-巨噬细胞系细胞可分化为血液单核细胞和组织巨噬细胞1,2上述细胞可分化为破骨细胞，以平衡骨的生长与发育，常被用作诱导破骨细胞的细胞模型 体内3,4骨髓是一种特殊的组织，包含多种不同类型的细胞，包括但不限于骨髓间充质干细胞、骨髓单核-巨噬细胞（BMMs）、造血干细胞、内皮细胞和免疫细胞。事实上，已有若干先前研究表明，从长骨骨髓腔中迁移出的贴壁细胞可分化为成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。5,6,7,8尽管已采用不同的分离和培养方法来获得不同的同质细胞群体，但从多种不同细胞类型中分离和培养BMMs仍面临巨大挑战。
目前已开发出多种提取骨髓单个核巨噬细胞（BMSCs）的方法。然而，大多数这些方法较为复杂9,10,11。例如，密度梯度离心法需要使用专用试剂盒，且操作耗时、繁琐。该方法适用于从大体积血液样本中分离BMMs，但不适用于骨髓样本9,12,13。此外，采用胶原酶消化法提取组织样本是一种复杂且耗时的过程；该方法不推荐用于从骨髓样本中分离BMMs14,15。另外，尽管流式分选可以获得高纯度的单核细胞/巨噬细胞群体，但其需要非常大的样本量，并对仪器设备有较高要求10,16。此外，磁珠富集法成本极高，在普通实验室中难以实现17。
因此，本研究提出了一种简便、快速且经济的方法，用于从骨髓中分离单核巨噬细胞。通过将骨髓细胞分别贴壁不同时间，采用二次贴壁法分离骨髓源性巨噬细胞（BMMs）。利用上述方法提取的BMMs可诱导破骨细胞的形成 体外从而为未来骨质疏松症的研究提供了一种简单且便捷的细胞模型 体外.

<table><tbody><tr><td>35 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 细胞爬片</td><td>NEST 生物技术</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>抗组织蛋白酶 K 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>抗 CD11 同型对照抗体</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &amp;mu;g/次，1.675 mg/mL</td></tr><tr><td>抗 CD11b/c 抗体</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&amp;nbsp;1&amp;mu;g/次，1 mg/mL</td></tr><tr><td>抗 TRAP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>抗&amp;beta;-actin 抗体</td><td>碧云天</td><td>&amp;nbsp;AF5003</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>细胞爬片</td><td>NEST 生物技术</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>用于免疫荧光，1:2,000</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>用于 Western blot，1:2,000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD 大鼠</td><td>上海斯莱克实验动物有限公司</td><td></td><td>1–10 日龄</td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP 染色试剂盒</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>瑞氏-吉姆萨染液</td><td>凯基生物</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

通过二次贴壁法从大鼠骨骼中分离单核-巨噬细胞系细胞

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

随着骨矿物质密度的降低，骨骼更易发生骨折，从而对患者的生活质量产生负面影响。骨的生长和发育主要由成骨细胞和破骨细胞调控。目前普遍认为，破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞（BMMs）。BMMs 与其他造血干细胞均位于骨髓腔内。因此，从不同且异质的细胞群体中分离出单一稳定的 BMMs 是一项巨大挑战。本文介绍了一种从 SD 大鼠中分离 BMMs 的方案，称为二次贴壁法。在原代培养中贴壁培养 24–48 小时后收集贴壁细胞。流式细胞术分析显示，约 37.94% 的细胞为 CD11b/c+（单核-巨噬细胞表面抗原）。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及蛋白质印迹分析表明，BMMs 可在体外分化为破骨细胞in vitro。上述结果提示，二次贴壁获得的细胞可作为破骨细胞分化研究的合适细胞模型。

继代贴壁细胞群体稳定且均一。随着细胞持续增殖，大部分细胞体积增大，形态不规则，并生长成放射状贴壁圆盘（图2C，D）。流式细胞术结果显示，表达单核-巨噬细胞系表面分子标志物CD11b/c的细胞比例约为37.94%（图2A，B）。为进一步验证CD11b/c阳性细胞属于单核-巨噬细胞系，采用RANKL和M-CSF处理细胞，诱导继代贴壁细胞向破骨细胞分化。TRAP染色结果显示，与对照组相比，经RANKL和M-CSF诱导的细胞内紫红色颗粒数量显著增加（图2E，F）。此外，破骨细胞特异性蛋白TRAP和组织蛋白酶K（cathepsin K）的表达水平也显著升高（图2G，H）。
<p class="jove_c...

本文介绍了一种从SD大鼠分离BMMs的方案，称为二次贴壁法。

随着骨矿物质密度的降低，骨骼更易发生骨折，从而对患者的生活质量产生负面影响。骨骼的生长与……

本方案中，采用二次贴壁法提取骨髓单核-巨噬细胞。骨髓单核-巨噬细胞可成功分化为破骨细胞，为体外研究破骨细胞提供了稳定的细胞模型。该方法适用于少量骨髓样本，无需高端实验设备，即可简便、快速地从骨髓中分离骨髓单核-巨噬细胞。破骨细胞数量的增加可能是骨质疏松症的潜在发病机制。骨髓单核-巨噬细胞作为破骨细胞的前体细胞具有一定的研究价值。首先，将处死的大鼠浸入75%酒精中10分钟以进行消毒。用剪刀和镊子仔细去除大鼠的所有四肢后，使用移液管以 PBS 吸取并冲洗附着在四肢上的血液。然后向一个 5 毫升离心管中加入 2 毫升含 10% FBS 的 DMEM 培养基。将四肢骨骼转移至该 5 毫升离心管后，用剪刀在管内将骨骼剪成小块，并混匀匀浆，使骨髓细胞重悬于培养基中。静置五分钟，直至组织碎片沉降至管底。随后，在100毫米培养皿中加入10毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，然后将上清液转移至该培养皿中。于37°C、5%二氧化碳条件下孵育约24小时。经过此孵育时间后，大部分间充质干细胞将贴附于培养皿壁并缓慢生长，而大多数骨髓单核-巨噬细胞仍悬浮于培养基中。将100毫米培养皿中的细胞悬液转移至新的25平方厘米培养瓶中，在37°C、5%二氧化碳条件下继续培养24小时。待骨髓单核-巨噬细胞贴附于培养瓶壁后，小心移除旧培养基，并更换为新鲜培养基。流式细胞术结果显示，表达CD11b和c（单核-巨噬细胞系细胞表面的分子标志物）的细胞比例约为37.94%。随着细胞持续增殖，大多数细胞体积增大，形态不规则，并逐渐形成放射状贴壁的盘状结构。TRAP染色结果表明，与对照组相比，经核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子诱导的细胞内紫色红颗粒数量显著增加。Western blot分析显示，与对照组相比，处理组细胞中破骨细胞特异性蛋白TRAP和组织蛋白酶K的表达水平显著升高。该操作中最关键的步骤是在原代培养24至48小时内收集次级贴壁细胞，此时骨髓单核-巨噬细胞已基本完成贴壁。通过本方法分离的骨髓单核-巨噬细胞可在体外诱导分化为破骨细胞，为骨质疏松症的研究提供稳定的细胞模型。

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通过二级粘附法从大鼠骨骼中分离单核细胞 - 巨噬细胞谱系细胞

本文介绍了一种从大鼠肝细胞原代培养中获取巨噬细胞的新方法。该方法利用巨噬细胞在培养过程中的增殖特性，随后通过振荡培养瓶并利用巨噬细胞对塑料培养皿的特异性贴附能力进行纯化。该技术无需复杂设备和操作技能，即可高效地获得肝脏巨噬细胞。...

一种从成年肝细胞混合原代培养物中分离巨噬细胞的简单高效方法

我们介绍一种简单高效的生成人巨噬细胞的方案。通过双密度梯度离心法处理血沉棕黄层，分离单核细胞，随后在特氟龙涂层细胞培养袋中将其分化为巨噬细胞。该方法可最大化巨噬细胞产量，并便于后续实验的细胞收获。...

通过双梯度离心法分离人单核细胞及其在特氟龙涂层细胞培养袋中向巨噬细胞的分化

双梯度离心法，人单核细胞，巨噬细胞分化，特氟龙涂层培养袋，细胞培养，外周血单个核细胞，Ficoll密度梯度，Percoll梯度，单核细胞分离，巨噬细胞

本文介绍一种从小鼠异质性骨髓中大量生成单核细胞的实验方案，适用于转化医学研究。与其他方法相比，该新方法通过避免使用高梯度磁性细胞分选（MACS）等昂贵技术，减少了实验动物的使用数量并降低了成本。...

小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射

本方案描述了一种通过酶消化、密度梯度分离、贴壁筛选以及CD146+磁珠分选技术，从大鼠中分离获取原代肺组织驻留型间充质基质细胞的方法。...

从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

破骨细胞是来源于造血干细胞单核-巨噬细胞系的组织特异性多核巨噬细胞。本方案描述了如何分离骨髓细胞，以获得大量破骨细胞，同时降低传统方法中存在的事故风险。...

从大鼠骨髓中分离、纯化及诱导破骨细胞前体细胞分化

本文介绍了一种结合全骨髓贴壁法与流式细胞术分选的方法，用于分离、培养、分选和鉴定大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞。...

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养

本文介绍了一种利用聚双膦酸盐化学方法将肽CD47（pepCD47）偶联到金属支架上的实验方案。使用pepCD47对金属支架进行功能化修饰可防止炎性细胞的黏附与活化，从而提高其生物相容性。...

通过固定CD47衍生肽减少血液来源细胞在金属植入物上的黏附

本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。...

从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

本研究概述了两种从大鼠骨髓中分离大量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的技术。一种方法结合使用商业化的中性粒细胞分离试剂盒与密度梯度离心法，另一种方法仅采用密度梯度离心法。这两种方法获得的功能性NETs均优于外周血中性粒细胞来源的NETs。...

分离大鼠骨髓中性粒细胞的独到方法及其功能可比性

本方案描述了一种非酶解且简便的方法，用于分离7至9日龄新生小鼠的骨髓细胞，并利用L929细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子（M-CSF）来源，诱导生成分化的巨噬细胞。进一步对骨髓来源的巨噬细胞进行了表面抗原F4/80、CD206、CD11b以及功能活性的分析。...

新生小鼠骨髓分离及骨髓来源巨噬细胞的制备

下颌骨骨髓来源的间充质干细胞在多种分化、自我更新及免疫调节方面具有重要功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的关键来源。本文介绍一种从大鼠下颌骨骨髓中分离间充质干细胞的独特方法。...

大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞的分离与培养技术

了解二级粘附法分离大鼠骨髓单核-巨噬细胞的技术流程。该方法可高效获得破骨细胞前体细胞，为体外研究破骨细胞分化和骨质疏松症发病机制提供稳定的细胞模型。

通过二次贴壁法从大鼠骨骼中分离单核-巨噬细胞系细胞

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