Name: 研究鞘氨醇1-磷酸受体结构和信号通路的管道 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 探索鞘氨醇1-磷酸受体结构和信号通路的研究方法，利用蛋白质纯化和冷冻电镜技术解析S1PRs激活机制。该流程为靶向药物开发提供重要结构基础。

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S1PRs-Gi 复合物的数据采集在四川大学华西冷冻电镜中心和南方科技大学（SUSTech）冷冻电镜中心完成，并在四川大学杜宇高性能计算中心进行处理。本研究受到国家自然科学基金（32100965 资助 L.C.，32100988 资助 W.Y.，31972916 资助 Z.S.）和四川大学全职博士后研究基金（2021SCU12003 资助 L.C.）的支持。

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</ol>

作者无利益冲突。

本方案描述了通过冷冻电镜（cryo-EM）测定S1PRs结构以及通过Gi介导的cAMP抑制实验测定S1PRs激活效力的主要流程。其中某些步骤对实验成功至关重要。
为了纯化S1PRs-Gi复合物，应更加关注病毒的质量和sf9细胞的健康状态。在状态不佳的sf9细胞中，受体的表达水平会显著降低。通过测量细胞直径来评估sf9细胞的健康状况，健康的sf9细胞直径约为15 µm。S1PRs-Gi复合物的产量受到受体、Gi和Gβγ病毒体积比的影响，这一问题可通过体外组装S1PRs-G蛋白复合物来克服in vitro42。此外，GPCR-G蛋白复合物并不总是稳定的，因此开发了NanoBiT策略，并已被频繁用于稳定该复合物43。
样品的质量是冷冻电镜实验中一切工作的基础。在样品筛选过程中，经常观察到样品发生聚集或解离的现象。某些方法可能有助于G蛋白偶联受体（GP...

鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是细胞膜鞘脂类的一种代谢产物，是一种普遍存在的溶血磷脂酸信号分子，参与多种生物学活动，包括淋巴细胞迁移、血管发育、内皮完整性以及心率调节1,2,3。S1P通过五种S1P受体亚型（S1PR1-5）发挥其多样的生理作用；这些受体分布于多种组织中，并对下游G蛋白表现出独特的偏好性4,5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，进而抑制cAMP的生成；S1PR2和S1PR3可与Gi、Gq及G12/13蛋白偶联，而S1PR4和S1PR5则通过Gi和G12/13蛋白传导信号6。
S1P-S1PR 信号通路是多种疾病的關鍵治療靶點，包括自身免疫性疾病7、炎症8、癌症9以及新型冠狀病毒病（COVID-19）10。2010年，芬戈莫德（fingolimod，FTY720）被批准作為首個靶向S1PRs的藥物，用於治療復發型多發性硬化症（MS）11。然而，該藥物可結合除S1PR2外的所有S1PR亞型，其對S1PR3的非特異性結合會導致大腦皮層水腫、血管和支氣管收縮以及肺上皮滲漏12。為提高治療選擇性，研究人員已開發出針對該受體的亞型特異性配體。西波尼莫德（siponimod，BAF312）於2019年獲批用於治療復發型MS13；其可有效靶向S1PR1和S1PR5，但對S1PR3無親和力，因此在臨床應用中副作用更少14。2020年，美國食品藥品監督管理局（FDA）批准了奧扎尼莫德（ozanimod）用於MS治療15。據報導，奧扎尼莫德對S1PR1的選擇性比對S1PR5高出25倍16。值得注意的是，在當前COVID-19大流行的背景下，研究發現靶向S1PRs的激動劑藥物可通過免疫調節療法技術用於治療COVID-1917。與芬戈莫德相比，奧扎尼莫德在減輕COVID-19患者症狀方面表現出更優越的效果，目前正處於臨床試驗階段10。闡明S1PRs的結構基礎與功能，為開發選擇性靶向S1PRs的藥物奠定了重要基礎18。
研究生物大分子结构信息的方法有多种，包括X射线晶体学、核磁共振（NMR）和电子显微镜（EM）。截至2022年3月，蛋白质数据库（PDB）中已收录超过180,000个结构，其中大多数是通过X射线晶体学解析的。然而，自2013年程亦凡（Yifan Cheng）和大卫·朱利叶斯（David Julius）报道了TRPV1的首个近原子分辨率结构（分辨率为3.4 Å）以来19，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为解析蛋白质结构的主流技术，EM解析的PDB结构总数已超过10,000个。关键的技术突破主要集中在新型成像相机（即直接电子探测相机）和新型图像处理算法的发展上。在过去十年中，冷冻电镜技术彻底改变了结构生物学和基于结构的药物发现领域20。由于理解大分子复合物如何在活细胞中执行其复杂功能是生命科学的核心课题之一，冷冻电镜有望揭示动态分子复合物的构象变化，尤其适用于跨膜蛋白的研究21。G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的跨膜蛋白超家族，也是目前超过30%市售药物的作用靶点22。冷冻电镜技术的发展推动了大量高分辨率GPCR-G蛋白复合物结构的解析，使得那些在药物设计中仍无法通过X射线晶体学分析的“难处理”靶点得以进行结构解析23。因此，冷冻电镜的应用为在接近天然条件下以近原子分辨率解析GPCR的三维结构提供了可能24。冷冻电镜技术的进步使得人们能够可视化GPCR激活或抑制的分子机制，并进一步有助于发现靶向GPCR的新药物结合位点25。
得益于冷冻电镜（cryo-EM）技术的巨大进步，我们近期解析了激动状态下S1PR1-、S1PR3-和S1PR5-Gi信号复合物的结构26,27。在人体中，S1PRs分布于多种组织，并对下游G蛋白表现出独特的偏好性4,5。S1PR1主要与Gi蛋白偶联，进而抑制3′,5′-环磷酸腺苷（cAMP）的生成。S1PR3和S1PR5也能够与Gi蛋白偶联6,28。由于Gi偶联受体的激活会降低cAMP的产生29，因此引入了一种基于Gi抑制的cAMP检测方法，用于测量cAMP的抑制效应，从而捕捉功能变化26,27。该cAMP检测方法采用一种经过改造的Photinus pyralis荧光素酶，其结构中插入了一个cAMP结合蛋白结构域，因而可通过细胞内cAMP浓度的变化，简便而可靠地监测GPCR活性30。该方法是一种灵敏且非放射性的功能性检测手段，可用于实时监测多种GPCR的下游信号通路，在药物发现中具有广泛应用前景31。
本文总结了解析S1PRs激活机制及药物识别模式的关键方法，主要包括冷冻电镜操作和Gi抑制型cAMP检测。本文章旨在为深入探索G蛋白偶联受体（GPCRs）的结构与功能提供全面的实验指导。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;M 滤膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa 截留分子量浓缩管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88533</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>Cat# 43016</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>Cat# 3917</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>apyrase</td><td>NEB</td><td>Cat# M0398S</td><td></td></tr><tr><td>杆状病毒转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10362100</td><td>用于制备 P0 代杆状病毒</td></tr><tr><td>苯甲脒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., 等, 2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态大肠杆菌</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 细胞培养基</td><td>Expression Systems</td><td>Cat#&amp;nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F12 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Box</td><td>Cat# SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>Flag 树脂</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# A4596</td><td></td></tr><tr><td>福斯科林</td><td>APExBIO</td><td>Cat# B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&amp;nbsp;https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr><tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤柱</td><td>GE healthcare</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP 检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>Cat# E1291</td><td>Gi 抑制型 cAMP 检测试剂盒</td></tr><tr><td>GloSensor 质粒</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>传感器质粒</td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 培养基</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME 试剂</td><td>Polyplus Transfection</td><td>Cat# 114-15</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>嘉纳霉素</td><td>Solarbio</td><td>Cat# K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 12780052</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Cat# NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td><td>(Zheng 等, 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&amp;alpha;&lt;sub&gt;i&lt;/sub&gt;</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&amp;beta;1&amp;gamma;2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure 质粒小提试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>用于质粒和 P0 代杆状病毒的制备</td></tr><tr><td>Q5 定点突变试剂盒</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>用于质粒制备</td></tr><tr><td>Quantifoil 载网</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448</td><td></td></tr><tr><td>RELION-3.1</td><td>(Zivanov 等, 2018)</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</td><td></td></tr><tr><td>S1PRs cDNA</td><td>addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Expression Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>西波尼莫德</td><td>Selleck</td><td>Cat# S7179</td><td></td></tr><tr><td>胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1254</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 微孔板读板仪</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>合成 T4L DNA（序列）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg&lt;br/&gt; cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg&lt;br/&gt; ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca&lt;br/&gt; aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga&lt;br/&gt; actggacaaagccattggtcgcaacaccaac&lt;br/&gt; ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac&lt;br/&gt; tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg&lt;br/&gt; catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt&lt;br/&gt; atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt&lt;br/&gt; gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg&lt;br/&gt; agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc&lt;br/&gt; agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga&lt;br/&gt; atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc&lt;br/&gt; taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg&lt;br/&gt; tactggaacttgggacgcttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 77720</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>Solarbio</td><td>Cat# T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

研究鞘氨醇-1-磷酸受体结构与信号通路的实验流程

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

溶血磷脂（LPLs）是一类具有生物活性的脂质，包括鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、溶血磷脂酸等。S1P 是细胞膜中鞘脂类物质的代谢产物，是目前研究最为清楚的 LPL 之一，可通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）介导的信号通路调控多种细胞生理反应。via 该通路的作用表明，S1P-S1PRs 信号系统在多种疾病中具有重要的治疗潜力，这些疾病包括多发性硬化症（MS）、自身免疫性疾病、癌症、炎症，甚至包括 COVID-19。S1PRs 属于 A 类 G 蛋白偶联受体（GPCR）家族中的一个小亚类，包含五个亚型：S1PR1、S1PR2、S1PR3、S1PR4 和 S1PR5。然而，由于缺乏详细的结构信息，靶向 S1PRs 的药物研发受到阻碍。本文中，我们采用冷冻电子显微镜技术解析了 S1P-S1PRs 复合物的结构，并结合基于细胞的功能实验，阐明了其激活机制、药物选择性识别以及 G 蛋白偶联的分子基础。该策略也可用于研究其他溶血磷脂受体（LPLRs）及 G 蛋白偶联受体（GPCRs）。

在冷冻S1PRs-Gi复合物样品之前，需要通过尺寸排阻色谱法（SEC）对纯化后的样品进行分离，并利用凝胶过滤色谱进行分析。图2以S1PR3-Gi复合物为例进行展示。均一的GPCR-G蛋白复合物的主峰组分通常出现在尺寸排阻色谱的约10.5 mL处（图2A）。S1PR3-Gi复合物的SDS-PAGE分析结果（图2B）显示四条条带，分别对应S1PR3、Gαi、Gβ和scFv16的理论分子量，表明该复合物已成功纯化。受不同程度修饰（如糖基化或棕榈酰化）的影响，受体条带常呈现弥散状，而Gγ条带则未被检测到。
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S1P 通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）亚家族发挥其多种生理作用。本文描述了一种用于阐明 S1PRs 结构与功能的研究流程。

溶血磷脂（LPLs）是一类具有生物活性的脂质，包括鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、溶血磷脂酸等。S1P 是鞘氨醇的代谢产物……

我们通过机组人员、电子显微镜操作以及胃肠道抑制状态下的AMP A，研究了S1PRS的激活状态及药物重新计算模式，并为开发能够稳定靶向S1PRS的药物提供了较次要的基础。相关技术的进步使得揭示GP ZR刺激或栖居状态下磁性底层的病毒化成为可能，并进一步有助于发现TB细胞受体（T BCR）靶向药物开发中的正常结合位点。样本质量是所有工作的基础，对于正确的电子显微镜实验而言尤为如此。简单制备的关键因素包括SF产线的各种产物状态以及N g浓度。本实验操作将由我课题组的研究生Heli Wang进行演示。进行蛋白质纯化时，将S1P受体或S1PR-SG蛋白复合物溶液上样至预先用SEC缓冲液在4°C、0.5毫升/分钟流速下平衡好的尺寸排阻色谱（SEC）凝胶过滤柱。若收集的组分需用于冷冻电子显微镜分析，可使用截留分子量为100千道尔顿的浓缩管，在4°C、1,300 × g条件下进行浓缩。在数据处理阶段进行2D分类时，针对颗粒的初步分类，应在Relion软件中选择2D分类功能，并在IO选项中点击“输入图像star文件”右侧的“浏览”按钮。然后选择 particles.star 文件。接下来，在优化选项中，将类别数量设置为 100，掩膜直径 A 设置为 140。在计算选项中，将合并的粒子数量设置为 10，并在“复制粒子到临时目录”字段中输入来自快速本地硬盘的目录路径。为了加快处理速度，请选择“是”以启用GPU加速。若要从良好的2D结果中选择子集作为模板，请进入子集选择功能的IO选项，点击“select classes from model.star”右侧的浏览按钮，然后选择 run_it025_model。将星号作为输入，在弹出窗口中点击运行，勾选“排序图像”并选择反向排序。然后点击显示。在选择出良好且具有代表性的二维结果作为自动挑选功能的参考后，右键单击并选择保存选定类别。要使用模板进行第二轮自动挑选，请转至自动挑选功能的 IO 选项。在“用于自动挑选的输入显微照片”右侧点击“浏览”，并选择 micrographs.star。然后在“2D 参考图像”右侧点击“浏览”，并选择 class_averages.star。此外，选择“否”或在高斯函数中使用 leplossian。接下来，使用 cord_underscore_suffix_underscore_auto_pick.star 进行颗粒提取。利用颗粒进行二维分类。星号，接着使用 run_undescore it 020 five_optimizer 进行子集选择。星号：进行颗粒提取时，在 IO 选项中点击微图星号文件右侧的浏览按钮，选择微图。星号：对于重新提取优化后的颗粒，选择“是”。在点击“精修粒子 star 文件”右侧的浏览按钮后，选择 particles.star 以生成初始 3D 模型和参考图谱。接着，在“输入图像 star 文件”的 IO 选项中，点击“3D 初始模型”右侧的浏览按钮，并选择之前的 particles.star 文件。然后在优化选项中，将类别数设置为 1，掩膜直径（A）设置为 140。在选择颗粒后，进行三维分类并生成初步的三维图谱。如前所述，点击参考图谱右侧的“浏览”按钮，选择 initial_model.mrc 文件。然后，在优化选项中，将类别数量设置为四到六个，掩膜直径 A 设置为 140。在生成掩膜时，首先在IO选项中选择一个合适的3D图谱作为输入，将初始二值化阈值设为0.05，并将二值化图谱向外扩展三个像素。接着进入掩膜选项进行设置，添加八像素的柔化边缘。进行下一步处理时，打开 Trino Spark 软件，创建一个新的工作区，然后点击作业构建器以创建第一个作业。要导入粒子堆栈，请在粒子元数据路径字段中输入粒子路径，在粒子数据路径字段中输入电影路径。接下来，通过在体积数据路径中输入之前生成的最佳三维体积的路径，并选择“mask”作为要导入体积的类型，来导入三维体积。进行非均匀精修时，将先前生成的导入下划线颗粒作为非均匀精修颗粒的输入，将导入下划线体积_1作为非均匀精修体积的输入，将导入下划线掩模_1作为非均匀精修掩模的输入。接下来，单击 Q 开始处理，并重复该步骤以获得良好的分辨率。S1PRGI 三维图谱。在质粒构建并制备用于瞬时转染后，将两微克制备好的 DNA 加入 200 微升转染试剂缓冲液中。涡旋振荡混合 10 秒，短暂离心后即可使用。加入4 µL转染试剂，通过涡旋振荡并离心混匀，操作方式如前所述。将离心管在室温下孵育15分钟后，缓慢将200 µL转染混合物滴加到每个含有CHOK1细胞的六孔板孔中，并轻轻振荡培养板以充分混匀。转染4至6小时后，将转染培养基更换为细胞生长培养基（由F12培养基和10% FBS组成），然后将培养板放回培养箱继续孵育。细胞截断后24至48小时进行收获，将细胞悬浮于3毫升含D-荧光素钾盐的SA缓冲液中。然后使用多通道移液器将90微升细胞悬液加入96孔板的各孔中，轻轻混匀，并在室温下孵育40分钟。进行荧光信号检测时，首先在DMSO中配制10毫摩尔的西波尼莫德储备液，然后在含有25微摩尔佛司可林的HBSS缓冲液中进行系列稀释，并加入10微升不同浓度的激动剂溶液刺激细胞30分钟。接下来，在微孔板读板仪中选择发光检测模式，检测方法选择“发光法”，读数类型选择“终点法”，光学类型选择“发光光纤”，并在配套软件中将光学增益设为255。然后将获得的荧光信号值导入电子表格程序，并使用非线性回归曲线拟合剂量反应函数处理数据。S1PRS GI 复合物可通过尺寸排阻色谱法成功纯化，并经 SDS-PAGE 验证。此外，本研究采用的电子显微镜方案能够有效区分具有清晰且定义明确的二维分类的 S1PRSGI 颗粒与低质量颗粒。此外，通过非均匀 refinement 的傅里叶壳层相关方法，能够获得分辨率较高的 S1PR3-Gi 电子显微镜图谱。在结构分析之后，通过将受体质粒和传感器质粒共转染至 CHO-K1 细胞中，对 S1P 受体 3 进行了功能检测，结果显示受体质粒与传感器质粒的比例为 1:3 时可获得最佳效果。然而，在 HEK 293 细胞中的结果真实性较低。在此类处理过程中，粒子筛选所用算法以及二维和三维分类方法的选择，对于解析 S1P-G 蛋白复合物结构尤为重要，特别是在建模泄漏区域和细胞外片段（ecfs）时。

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科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

研究鞘氨醇1-磷酸受体结构和信号通路的管道

对暴露于亲脂性染料FM1-43的细胞进行活体成像，可精确测定孔形成毒素从质膜上被清除的动力学过程。该方法是一种灵敏的检测手段，可用于评估Ca2+、鞘磷脂酶及其他因素在质膜修复过程中的作用需求。...

活体成像实验用于评估Ca2+和鞘磷脂酶在孔形成毒素损伤修复中的作用

磷脂酰肌醇是一类信号脂质，其相对丰度会因各种刺激而迅速发生变化。本文介绍了一种通过代谢标记法使用3H-myo-肌醇标记细胞，随后进行提取和去酰化，以测定磷脂酰肌醇丰度的方法。提取的甘油-肌醇脂质随后通过高效液相色谱分离，并通过流动闪烁法进行定量。...

放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

利用新型荧光探针对质膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸进行单分子超分辨率成像

磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，质膜，单分子成像，超分辨率显微镜，荧光探针

本文介绍了一种利用多反应监测和串联质谱/三级质谱模式分别对每种鞘磷脂组分进行定量和定性分析的实验方案。...

利用两种稳定同位素标记的鞘磷脂物种通过液相色谱-质谱法测定鞘磷脂的定量与定性方法

本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.

基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

鞘脂是一类具有生物活性的代谢物，在人类疾病中具有明确的作用。通过质谱技术对组织中的鞘脂变化进行表征，有助于揭示其在疾病发病机制中的作用，或发现潜在的治疗靶点。然而，生物样本库中用于冷冻保存组织的OCT包埋剂会干扰质谱分析。本文阐述了利用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）分析嵌入OCT中的人体组织内鞘脂的实验方法。...

用于质谱分析的包埋于最佳切割温度化合物中的人体组织制备

本方案利用琼脂糖溶胀技术，作为一种强大且具有广泛适用性的方法，将整合膜蛋白（IMPs）包封入巨型单层脂质囊泡（GUVs）中。文中以人源5-羟色胺1A受体蛋白（5-HT1AR）的重建为例，该蛋白属于药理学上重要的G蛋白偶联受体类别之一。...

构建含G蛋白偶联受体（GPCRs）的模型脂质膜

我们提出了一种经济高效的方法，用于评估脂质体膜通透性，其灵敏度和分辨率优于传统技术。该方法利用一种新型的包封配体取代反应，可检测磷脂酶A2诱导的模型膜变化。此方法易于与标准分析整合，是一种便捷的技术，可提高研究膜生物物理学及毒素相互作用的分辨率。...

一种用于研究磷脂酰肌醇磷酸基团对毒液PLA2膜向性作用影响的脂质体膜通透性检测方法

我们提出了设计合成“化学转导剂”的指南，这类转导剂能够诱导原本不相关的天然蛋白质之间产生相互作用。此外，还提供了合成和测试一种特定“转导剂”的详细实验方案，该转导剂可使生长因子激活一种解毒酶，从而调控抗癌前体药物的裂解过程。...

模拟信号蛋白的功能：迈向人工信号转导治疗

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

探索鞘氨醇1-磷酸受体结构和信号通路的研究方法，利用蛋白质纯化和冷冻电镜技术解析S1PRs激活机制。该流程为靶向药物开发提供重要结构基础。

研究鞘氨醇-1-磷酸受体结构与信号通路的实验流程

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