Name: 啮齿动物心肌细胞心脏收缩功能障碍和Ca2+ 瞬变分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习测量大鼠心肌细胞收缩功能的方法，通过检测肌节长度和钙瞬变来研究心力衰竭机制。该方案为心血管疾病研究提供可靠的实验技术平台。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 HL144777（MVW）支持。

在大鼠上进行的研究遵循《公共卫生服务实验动物人道照护与使用政策》，并经密歇根大学机构动物照护与使用委员会批准。本研究中，心肌细胞取自3至34月龄、体重≥200 g的Sprague-Dawley和F344BN大鼠5。实验同时使用了雄性和雌性大鼠。
1. 心肌细胞起搏用于收缩功能研究
<ol>
	<li>每次分离心肌细胞时，均需配制新鲜的基于M199的培养基（材料表。起搏前1天，接种 2 x 104 Ca2+耐受的杆状心肌细胞，置于22 mm2 如前所述，使用层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片（CSs）8.</li>
	<li>准备小室时，将每个小室浸泡于10%次氯酸钠溶液中1小时。随后用流动的自来水冲洗小室30至45分钟，再用蒸馏水每5分钟更换一次，持续30分钟，接着用去离子水每5分钟更换一次，持续30分钟，最后用去离子水彻底冲洗。</li>
	<li>将腔室置于洁净表面干燥 20–30 分钟（补充图 1A-C接下来，在生物安全柜中对培养室进行紫外照射处理，每个方向照射5分钟（总计20分钟）。此步骤不适用于预灭菌的培养室。 
	注意：离开该区域以尽量减少紫外线暴露。</li>
	<li>移除培养室盖子，加入 3 mL M199 基础培养基（参见 材料表) 加入每个孔中（补充图1B），盖上盖子，并将培养箱预热至37 &#176;5% CO₂ 培养箱2 和 20% O₂2.</li>
	<li>在250℃的高温珠灭菌器中对镊子进行灭菌 &#176;在 20–25 秒内完成。将预热的刺激室从培养箱转移至生物安全柜中。</li>
	<li>使用无菌镊子将含有心肌细胞的盖玻片（CS）逐个转移至刺激腔室的各个孔中。每次转移四片CS，随后加热10分钟，再转移剩余的四片CS，以维持培养基温度。</li>
	<li>将香蕉插头一端连接至刺激室补充图 1C）以及另一端的刺激器（补充图1D).</li>
	<li>将刺激器频率设置为 0.2 Hz，并调节电压（约 12 V），使每个孔中约 10%–20% 的杆状心肌细胞产生收缩。为确定收缩心肌细胞的数量，将培养 chamber 置于倒置显微镜下，使用 4 倍至 10 倍物镜进行观察。</li>
	<li>将刺激室置于37℃培养箱中 &#176;C，5% CO₂2 (补充图1E）。每12小时更换一次培养基，使用预先在37℃ &#176;C，5% CO2 孵育20-25分钟。继续电刺激最多3天，每12小时更换一次培养基。</li>
</ol>
2. 成年大鼠心肌细胞收缩功能分析
<ol>
	<li>实验前30分钟，将凝胶包和培养基置于37 °C培养箱中预热。</li>
	<li>启动材料表中列出并在补充图2中展示的收缩功能检测平台各组件，特别注意以下关键部件：配备深红色（590 nm）滤光片的倒置显微镜（补充图2A-1、2A-2,3）、CCD相机（补充图2A-4），该相机连接至CCD控制器（补充图2A-5和补充图2C-5），并与一台PC计算机集成（补充图2B-14）。</li>
	<li>将管路连接至蠕动泵（补充图2A-8；补充图2A-8），将预热后的凝胶包转移至保温管架（补充图2A-9），并开启真空泵（补充图2A-11）以及细胞刺激器的电源（补充图2B-13）。</li>
	<li>将装有培养基的50 mL离心管放入保温管架（补充图2A-9），通过蠕动泵管路以约0.5 mL/min的速度开始灌注（补充图2E-8）。</li>
	<li>取少量预热的培养基加入小称量舟中（约2 mL）。将一个含有心肌细胞的CS从刺激室转移至称量舟中，并将刺激室放回5% CO2培养箱中37 °C保存。</li>
	<li>从称量舟中取出CS，轻轻擦拭其底部。将CS转移至新涂润滑脂的CS室（补充图2A,F-10；黑色箭头），并在CS上轻轻滴加一滴培养基（约200 μL）。</li>
	<li>将铂电极支架置于CS上方（补充图2F；灰色箭头），用镊子将另一片CS覆盖在顶部，再将顶部支架（补充图2F；白色箭头）放置于CS夹层之上，最后安装两到四个#0平头螺丝，完成腔室组装。</li>
	<li>当培养基已充满泵管路后，将管路连接至预热器，再将预热器连接至第2.7步组装好的CS室。以0.5 mL/min开始灌注，并在腔室下方放置吸水纸巾，确保无泄漏。</li>
	<li>将CS室置于显微镜载物台适配器上。灌注后的培养基通过腔室另一端连接的管路被真空系统收集。开启加热系统（补充图2A,D-7），使腔室、物镜和预热器平衡约5–10分钟，以达到稳定的37 °C培养基温度。在此平衡期间，使用显微镜的40倍水浸物镜观察心肌细胞。</li>
	<li>启动起搏刺激器（补充图2B-13），将电压设置为使80%杆状细胞发生收缩所需电压的1.5倍，通常为35–40 V。将刺激频率设为0.2 Hz，以优化心肌细胞的收缩功能和存活率。</li>
	<li>从持续灌注并起搏的心肌细胞中采集收缩缩短和再伸长的轨迹数据。为获取缩短测量值，使用连接至CCD控制器（补充图2B-5,C）的CCD相机（补充图2A-4）及配备I/O控制板的专用计算机（补充图2B-14；见材料表）。该平台可测量大鼠心肌细胞的肌节缩短，尽管从心肌细胞纵向边缘采集的数据也可获得类似结果（参见Ecklerle等14）。</li>
	<li>为采集肌节缩短轨迹，在计算机上打开软件，选择OK，然后选择文件 &#62; 新建。通过选择轨迹 &#62; 编辑用户限值 &#62; 肌节长度，设定最大值和最小值（通常在2.0 μm至1.5 μm之间），以准备屏幕模板。在对心肌细胞进行测量前，使用0.01 mm格栅对CCD相机进行校准（图1D）。</li>
	<li>为记录肌节长度轨迹，选择文件 &#62; 新建。识别一个正在收缩的心肌细胞，并将其沿相机的纵向轴对齐，使横纹图案呈垂直方向（图1B）。</li>
	<li>使用计算机鼠标将感兴趣区域（ROI）框（粉红色框）放置在心肌细胞上（图1C）。选择采集和开始以记录收缩功能。在低刺激频率（≤0.5 Hz）下，从每个心肌细胞记录60秒的缩短数据。</li>
	<li>从每个CS中记录5–10个细胞的肌节缩短数据。若研究涉及激动剂/拮抗剂处理，则每个CS仅测量1个细胞。准备独立的预热培养基和另一根专用的灌注管路，安装于多通道蠕动泵中，并按照步骤2.9–2.14操作，以评估药物或神经激素递送对心肌细胞收缩功能的影响。</li>
	<li>为在一系列频率下测量缩短情况，需在每个频率下对心肌细胞进行起搏，以在记录前达到稳态缩短5。对于此类研究，将灌注速率加倍，并在新频率刺激后15–20秒开始记录，以获得0.2 Hz至2 Hz范围内一致的稳态收缩反应。通常，每个CS最多记录2个心肌细胞在给定刺激频率范围内的缩短数据。</li>
	<li>在分析记录数据时（见步骤3），每个细胞至少记录7次收缩，以获得可靠的信号平均数据。</li>
</ol>
3. 分离心肌细胞收缩功能的数据分析
<ol>
	<li>首先，选择 文件，选择一个已记录的轨迹，然后选择 打开。选择基础轨迹的 选项卡 1（左侧），并将轨迹顶部的黄色面板设置为 Sarc-Length。选择 轨迹 和步骤 2.12 中准备好的屏幕模板。</li>
	<li>为准备分析模板，请在“t0 定义”框中选择 操作 → 单调瞬态分析选项 → TTL 事件标记，并从菜单中选择以下选项：基线（静息肌节长度）、相对于 t0 的起始速度（dep v）、峰值（峰值高度及峰值高度/基线或 bl%peak h）、相对于 tPeak 的返回速度（ret v）、以 t0 为起点的达峰时间 50%（TTP50%），以及以 tPeak 为起点的恢复至基线 50% 所需时间（TTR50%）。通过选择 模板 &#62; 保存分析模板 并指定标识符来保存这些分析选项。在分析每条轨迹之前加载此分析模板。</li>
	<li>开始数据分析时，选择 标记 &#62; 门控 &#62; 添加瞬态 &#62; 从事件标记转换 &#62; 分析范围。现在将时间范围设置为 -0.01 s 至 1.20 s，适用于以 0.2 Hz 刺激的心肌细胞（图 2A，原始轨迹下部的红色标记）。对于以较高频率刺激的心肌细胞，选择较短的时间范围。</li>
	<li>通过选择 操作 &#62; 平均事件 生成信号平均轨迹。信号平均记录将显示在原始基础轨迹下方。</li>
	<li>选择信号平均轨迹的 选项卡 1（屏幕左侧），然后在上方菜单中选择 标记，接着选择 添加瞬态。从顶部菜单选择 操作，然后选择 单调瞬态分析，以在信号平均显示面板中显示基线肌节长度、峰值高度、bl%peak h、dep v、ret v、TTP50% 和 TTR50% 的信号平均值。</li>
	<li>通过选择 导出 &#62; 单调瞬态分析 &#62; 剪贴板当前数据，将每次肌节瞬态分析结果传输到电子表格中，以便对多个心肌细胞进行综合分析。将每条轨迹的数据粘贴至电子表格中。</li>
	<li>要复制信号平均轨迹，请选择 导出 &#62; 当前轨迹 &#62; 剪贴板 &#62; 选项，将小数位数设置为 5，然后选择 制表符分隔符，点击 确定，再点击 确定。将每个心肌细胞记录的信号平均轨迹粘贴到第二个电子表格中。</li>
</ol>
4. 记录大鼠成年心肌细胞中的 Ca2+ 瞬变
<ol>
	<li>在测量 Ca2+ 瞬变之前，启动第 2.2 步中描述的平台组件，以及额外的荧光成像组件（参见材料表中用于 Ca2+ 成像分析的附加组件；补充图 2A-5,6；2B-12）。</li>
	<li>制备含有 1 mM Fura-2AM 和 0.5 M 丙磺舒的 Fura-2AM 储存液，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。丙磺舒可减少 Fura-2AM 的泄漏15。</li>
	<li>将储存液稀释至 5 μM Fura-2AM 和 2.5 mM 丙磺舒，加入 2.5 mL 培养基（参见材料表）至 6 孔板的一个孔中。在板中另外三个孔各加入 2.5 mL 培养基（不含 Fura-2AM），用铝箔覆盖，并将培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>将含有心肌细胞的 CS 从起搏室转移至含 Fura-2AM 的孔中，盖好后将板放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 4 分钟。将灌流泵的管路安装到位，并在 Fura-2AM 负载期间按第 2.4 步所述进行培养基灌流。</li>
	<li>关闭或调暗室内灯光，以减少荧光漂白并优化荧光信号。从培养箱中取出 6 孔板，然后在三个仅含培养基的孔中依次各清洗 CS 10 秒。将 CS 转移至盛有预温培养基（未添加 Fura-2AM）的小型称量舟中。</li>
	<li>轻轻擦拭 CS 底面后，将其固定于新涂油脂的 CS 室中。轻柔地在 CS 上滴加一滴培养基，然后安装电极支架覆盖 CS，接着放置第二个 CS 和顶部支架。使用 #0 平头螺钉完成细胞室的组装，具体操作如第 2.6–2.7 步所述。</li>
	<li>将充满培养基的泵管连接至预加热器，再将预加热器连接至 CS 室，并将其置于载物台适配器中，如第 2.8 步所述。使用真空管路系统收集废液，并开启加热系统（补充图 2A,D-7），使腔室平衡至 37°C，具体操作如第 2.8–2.9 步所述。</li>
	<li>启动起搏刺激器（补充图 2B-13），设置为 35–40 V 和 0.2 Hz，如第 2.10 步所述。</li>
	<li>在记录 Ca2+ 瞬变前，打开靠近计算机键盘的小型手电筒或阅读灯，以便看清键盘。此外，在无心肌细胞的区域记录荧光背景。开始时，选择文件 &#62; 开始 &#62; 新建，如第 2.12 步所述。</li>
	<li>选择一个感兴趣区域（ROI），并在每个标签的上中部定义第一个标签（或迹线栏，左侧）用于原始分子信号，第二个标签用于原始分母信号。记录 10–20 秒的背景信号。右键点击鼠标并拖动一个迹线栏面板，获取原始信号平均后的分子和分母数值。通过选择操作 &#62; 常数输入这些数值，并填入原始值。</li>
	<li>准备一个新的屏幕模板，用于同时采集缩短信号和 Ca2+ 瞬变信号。对于肌节长度，选择标签 1，并采用与第 2.13 步相同的流程。对于 Ca2+ 成像，选择标签 2 &#62; 比值（标签上中部）&#62; 迹线 &#62; 编辑用户限值，设置比值的最小值和最大值，通常设定在 1 至 5 之间。采用相同流程定义标签 3 和 4（左侧）的分子和分母范围。</li>
	<li>将感兴趣区域（ROI）框定位在心肌细胞图像上，如第 2.14 步所述。选择文件 &#62; 新建 &#62; 采集。然后选择开始以采集缩短和比值型 Ca2+ 数据。每细胞至少记录 ≥7 次收缩，用于信号平均分析。</li>
	<li>在记录 2–4 个心肌细胞后，重复第 4.10 步中所述的背景迹线记录。通常每 CS 记录 4–5 个心肌细胞；若背景读数发生显著变化，则减少记录的心肌细胞数量。</li>
</ol>
5. 分离心肌细胞中Ca2+&#160;瞬变的数据分析。
<ol>
	<li>打开需要分析的文件，选择模板 &#62; 屏幕模板，用于分析缩短过程及Ca2+瞬变。接着，选择第1和第2个标签页（左侧），分别显示肌节长度和Ca2+比值。选择操作 &#62; 常量，并从Ca2+背景轨迹中输入分子和分母的数值。</li>
	<li>为缩短过程及Ca2+瞬变数据准备分析模板。选择第1个标签页（左侧），采用与步骤3.2相同的方法设置肌节长度分析模板。</li>
	<li>选择第2个标签页（左侧），在t0定义框中选择操作、单调瞬变分析选项、TTL事件标记，并从菜单中选择以下选项：基线（基础比值）、相对于t0的起始速度（dep v）、峰值（峰值高度及峰值高度占基线的百分比或bl%peak h）、相对于tPeak的衰减速率（ret v）、从t0到峰值50%的时间（TTP50%），以及从tPeak到基线50%的时间（TTR50%）。通过选择模板并使用新的标识名称选择保存分析模板来保存这些分析选项。在分析每条轨迹之前加载此分析模板。</li>
	<li>采用与步骤3.3–3.6相同的方法对信号进行平均，然后分析肌节长度，接着对Ca2+瞬变采用相同的步骤进行分析。分别为肌节长度和Ca2+瞬变比值轨迹设置独立的标记。</li>
</ol>

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</ol>

作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

步骤1中所述的慢性起搏方案延长了研究分离心肌细胞以及评估较长时间处理影响的有效时间。在本实验室中，使用慢性起搏心肌细胞通过肌节长度测量收缩功能时，分离后长达4天仍可获得稳定的结果。然而，若使用存放超过1周的培养基对心肌细胞进行起搏，其收缩功能会迅速下降。
在进行收缩功能研究时，数据采集在 37 °C 下进行，该温度接近大鼠的体温。为了优化心肌细胞的存活率，并获得每种心肌细胞一致的收缩曲线，这些实验的起搏频率需低于大鼠生理心率（约 5 Hz）。这些设置可产生一致的收缩功能数据，但如果在同一处理组心肌细胞的多个收缩系统（CS）中缩短轨迹保持一致，则可调整腔室温度和/或起搏频率。此外，选择无出芽样突起、完全贴附于收缩系统（CS）表面、且在杆状细胞两端均能收缩的心肌细胞可获得最佳结果。仅在一端贴附、具有多个出芽样突起和/或仅在一端收缩的心肌细胞不理想，通常由于背景运动而难以记录。在这些研究中，ROI 内应包含 ≥20 个肌节，以获得尖锐的功率谱峰、可重复的静息肌节长度，以及缩短轨迹的最优信噪比。如果功率谱峰仍保持尖锐，ROI 中可使用少至七个肌节。分离的大鼠心肌细胞的静息肌节长度通常在 2...

分析心脏泵功能通常需要采用多种方法才能获得充分的认识，尤其是在心力衰竭（HF）的动物模型中。超声心动图或血流动力学测量可提供有关体内心脏功能障碍的见解1，而体外方法则常用于判断功能障碍是否源于肌丝结构和/或负责将电兴奋（或动作电位）与收缩功能耦联的Ca2+瞬变（如兴奋-收缩[EC]耦联）的变化。此外，体外方法还可在开展成本高昂和/或耗时费力的体内治疗策略之前，用于筛选神经激素、载体诱导的基因改变以及潜在治疗药物的功能反应2。
有多种方法可用于研究 体外 收缩功能，包括完整小梁的心肌力测定3 或透化的肌细胞4，以及无负荷缩短和 Ca2+ 完整心肌细胞中在有无心力衰竭情况下的瞬时变化5,6每种方法均聚焦于心肌细胞的收缩功能，而心肌细胞的收缩功能直接决定了心脏的泵血功能。2,7然而，对收缩和兴奋-收缩耦联的联合分析，通常通过测量肌肉长度的缩短和Ca2+ 分离细胞中的瞬时钙信号2+ 耐受性成年心肌细胞。本实验室采用已发表的详细方案，从大鼠心脏中分离心肌细胞以完成此步骤。8.
钙离子和cAMP2+ 瞬时钙和肌原纤维在完整心肌细胞的缩短与再伸长过程中发挥作用，并可能导致收缩功能障碍2,7因此，当 体外 功能分析需要含有 Ca 的完整心肌细胞2+ 循环装置以及肌原纤维。例如，在对肌原纤维或钙调控蛋白进行修饰后，完整分离的心肌细胞是研究收缩功能的理想选择2+ 通过基因转移实现的循环功能9此外，建议采用完整心肌细胞方法来分析神经激素的功能影响，特别是在研究下游第二信使信号通路和/或对治疗药物反应时2. 单个心肌细胞中依赖负荷的力的另一种测量方法通常在细胞膜透化（或去膜）后于低温（≤15℃）下进行 &#176;C）以去除 Ca2+ 瞬时贡献并聚焦于肌丝功能10负载依赖性力与钙的测量2+ 完整心肌细胞中瞬时现象的研究较为罕见，主要由于该方法具有较高的技术复杂性和操作难度11，尤其是在需要较高通量的情况下，例如用于检测神经激素信号响应或作为治疗药物的筛选手段。心脏小梁的分析可克服这些技术难题，但也可能受到非心肌细胞、纤维化和/或细胞外基质重塑的影响2上述每种方法均需要含有成年心肌细胞的制备物，因为新生心肌细胞以及由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的心肌细胞尚未表达全套的成年肌原纤维蛋白，通常也缺乏成年杆状心肌细胞所具有的肌原纤维组织水平2迄今为止，iPSCs 中的证据表明，完全转变为成体同工型在培养中需要超过 134 天12.
鉴于本合集重点关注心力衰竭（HF），这些实验方案包括用于区分衰竭与非衰竭完整心肌细胞收缩功能的方法与分析。代表性示例来自大鼠心肌细胞，这些大鼠在肾动脉上方缩窄术后18-20周进行研究，该模型此前已有描述5,13。随后将结果与假手术处理大鼠的心肌细胞进行比较。
此处所述的实验方案与成像平台用于分析和监测心肌细胞缩短及钙瞬变的变化2+ 心力衰竭发展过程中杆状心肌细胞的瞬时变化。本分析采用 2 x 104 Ca2+耐受性良好的杆状心肌细胞接种于22 mm2 经先前所述方法处理的层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片（CSs）并培养过夜8用于构建该成像平台的组件，以及用于最佳成像效果的培养基和缓冲液，详见下文 材料表. 本文还提供了使用软件进行数据分析的指南以及代表性结果。整个实验方案分为若干独立的子部分，前三个部分侧重于分离的大鼠心肌细胞及其数据分析，随后是细胞内钙2+ 心肌细胞中的瞬时实验与数据分析

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;媒体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma（Roche）</td><td>3117057001</td><td>终浓度 = 0.2%（w/v）</td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>终浓度 = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>终浓度 = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 瓶配制 1 L；pH 7.45</td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>终浓度 = 4 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td>终浓度 = 100 U/mL 青霉素，100 &amp;mu;g/mL 链霉素</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;专用于 Ca 的试剂&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>英吉特（Molecular Probes）</td><td>F1221</td><td>50 &amp;mu;g/瓶；&amp;nbsp; 配制1 mM Fura-2AM和0.5 M丙磺舒的DMSO储备液；&amp;nbsp; 培养基中Fura2-AM的最终浓度为&amp;nbsp; 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Invitrogen（Fisher）</td><td>P36400</td><td>将 7.2 mg 丙磺舒（0.5 M）加入 1 mM Fura-2AM 储存液中；培养基中的终浓度为 2.5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;大鼠心肌细胞起搏材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&amp;nbsp; 毫米&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 玻璃盖玻片</td><td>康宁</td><td>2845-22</td><td></td></tr><tr><td>3根36英寸带香蕉插头的电缆</td><td>Pomona Electronics</td><td>B-36-2</td><td>补充图1，C面板</td></tr><tr><td>37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 型培养箱&amp;nbsp; 含95% O₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>形态</td><td>3110</td><td>补充图1，E面板。&amp;nbsp; 多种模型均适用</td></tr><tr><td>II 级 A/B3 型生物安全柜（带紫外灯）</td><td>形态</td><td>1286</td><td>多种模型均适用</td></tr><tr><td>镊子 - Dumont #5 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>低倍倒置显微镜</td><td>Leica</td><td>DM-IL&amp;nbsp;</td><td>将显微镜放置在培养箱旁，以便在开始起搏及更换培养基后观察起搏心肌细胞的收缩情况； &amp;nbsp;推荐使用 4X 和 10X 物镜</td></tr><tr><td>起搏室</td><td>自定义</td><td></td><td>补充图1，图A。Ionoptix C-pace系统是一种可商业获得的替代方案，或参见 &lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>刺激器</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>补充图1，D面板。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于收缩功能和/或钙信号检测的材料&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 成像分析&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>补充图2中的编号 &amp;以及替代方案/推荐选项</td></tr><tr><td>钙的其他组分&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 成像分析</td><td>Ionoptix</td><td>核心系统组件：-- 光子计数系统&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; --&amp;nbsp; 具有双激发光源的氙灯电源&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; --&amp;nbsp; 荧光界面</td><td>&amp;nbsp;- 光子计数系统包含一个光电倍增管（PMT）和一个二向色镜，安装在CCD相机旁边&amp;nbsp; （图 A #4）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 氙灯光源的电源（见图A #5和图C左侧）集成了双激发接口（340/380 nm）&amp;nbsp; 激发和510 nm发射）如A部分#6所示。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 计算机与荧光界面之间的连接&amp;nbsp; 光源如图B中#12所示。</td></tr><tr><td>配备图像采集功能的CCD相机&amp;nbsp; 硬件和软件（240 帧/秒）</td><td>Ionoptix&amp;nbsp;</td><td>Myocam 配 CCD 控制器&amp;nbsp;</td><td>补充图2，A部分#4展示了Myocam和CCD控制器&amp;nbsp; 和&amp;nbsp; 图A第5组 &amp;以及面板 C #5（右侧），分别。&amp;nbsp; 控制器与一台PC计算机系统集成（面板B #14）。&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;腔室刺激器</td><td>Ionoptix&amp;nbsp;</td><td>Myopacer</td><td>图B，#13；替代方案：&amp;nbsp; 草类模型 S48</td></tr><tr><td>盖玻片安装式灌流室</td><td>22 mm 专用培养室&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 盖玻片、硅胶适配器及2-4枚2-4号菲利普斯圆头#0螺钉&amp;nbsp; （箭头，F 面板）</td><td></td><td>图A #10 &amp;和图F；&amp;nbsp;&amp;nbsp; 培养箱温度校准至37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C 使用 TH-10Km 探针和 TC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;BIP 温度控制器（参见温度控制器）。&amp;nbsp; 商业替代方案：&amp;nbsp; Ionoptix FHD 或 C-stim 细胞&amp;nbsp; 腔室；Cell MicroControls 细胞培养刺激系统</td></tr><tr><td>专用计算机 &amp;用于功能/钙瞬变数据采集与分析的硬件和软件</td><td>Ionoptix</td><td>配备 Ionwizard 电路板及软件的 PC</td><td>图B，#14；使用IonWizard软件的SarcLen（肌节长度）或SoftEdge（心肌细胞长度）采集模块测量收缩功能。IonWizard软件还包含用于比率测量的PMT采集软件&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Fura-2AM 负载心肌细胞的成像。&lt;br/&gt; 建议使用四柱式电子机架安装机柜及搁板来放置计算机和细胞刺激器。&amp;nbsp; 钙荧光界面&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 成像设备也放置在此柜中（见下文）。</td></tr><tr><td>镊子 - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>图 F</td></tr><tr><td>用于培养基的绝缘管架</td><td>定制</td><td></td><td>图A #9；该支架可使用泡沫塑料轻松组装 &amp;以及一个预热的凝胶加热包以保持培养基温暖</td></tr><tr><td>倒置明场显微镜</td><td>尼康</td><td>TE-2000S</td><td>安装用于Ca2+成像的落射荧光旋转转盘（图A #2）。&amp;nbsp; &amp;nbsp;建议使用深红色（590 nm）聚光镜滤光片，以尽量减少Ca成像过程中的荧光漂白&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 成像</td></tr><tr><td>隔离台</td><td>TMC 振动控制</td><td>30 x 36 英寸</td><td>图A，#1；理想情况：&amp;nbsp; 高架货架，法拉第屏蔽&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>显微镜目镜 &amp;和目的</td><td>尼康</td><td>10倍CFI目镜，40倍水镜CFI Plan Fluor物镜</td><td>图A #3；40倍物镜：&amp;nbsp; n.a. 0.08；工作距离 2 mm。&amp;nbsp; 在物镜周围安装了 Cell MicroControls HLS-1 物镜加热器（参见下方温度控制器）。&amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;注意：&amp;nbsp; 水浸物镜分配器现在也可用于水基物镜。&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>图A第8组和图E</td></tr><tr><td>小型称量舟</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>细胞微控系统</td><td>TC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;BIP</td><td>图A #7；图D。该温度控制器将盖玻片培养室加热至37&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 建议为此平台配备预加热器和物镜加热器。&amp;nbsp; A Cell MicroControls HPRE2 预加热器和&amp;nbsp; HLS-1物镜加热器由以下方式控制&amp;nbsp; 由TC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;BIP 温度控制器用于我们的研究。</td></tr><tr><td>带运动传感器的橱柜下LED灯&amp;nbsp;</td><td>锡尔瓦尼亚</td><td>#72423 LED 光源</td><td>建议用于 Ca 期间的数据采集&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 在微弱室内光线下进行瞬态成像。&amp;nbsp; 替代方案：&amp;nbsp; 带有柔性颈部的夹式手电筒/书灯——多家供应商可提供。</td></tr><tr><td>带在线锥形瓶的真空管线 &amp;和防护滤光片</td><td>Fisher</td><td>Tygon 管 - E363；&amp;nbsp; 聚丙烯锥形瓶 - 10-182-50B；真空滤器 - 09-703-90</td><td>图A #11</td></tr></tbody></table>

啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与ca2+瞬变的分析

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

收缩功能障碍和 Ca2+ 瞬时反应常在细胞水平进行分析，作为评估心脏损伤和/或重构的综合指标的一部分。一种评估这些功能改变的方法是利用去负荷缩短和Ca2+ 成年大鼠心肌细胞的原代培养及瞬时分析。该方法通过胶原酶消化法分离成年心肌细胞，并使其达到钙2+ 耐受后，贴附于层粘连蛋白包被的盖玻片上，随后在无血清培养基中进行电刺激起搏。该通用方案采用成年大鼠心肌细胞，但可轻松调整用于其他物种的原代心肌细胞。可将损伤心脏来源心肌细胞的功能改变与假手术组心肌细胞和/或 体外 治疗性处理。该方法包含心肌细胞起搏所需的关键要素，以及细胞培养室和平台组件。此方法的详细操作流程包括通过肌节长度检测来测量无负荷缩短，以及细胞内钙离子2+ 使用比例荧光探针Fura-2 AM测量的瞬时信号，以及原始数据分析。

从分离后的第二天（第2天）开始，直至分离后第4天，对大鼠心肌细胞进行收缩功能研究。尽管在细胞分离后的第一天（即第2天）即可进行记录，但在进行基因转导或处理以改变收缩功能时，通常需要更长的培养时间8。对于分离后培养超过18小时的心肌细胞，第1节中所述的起搏方案有助于维持横管结构以及稳定缩短和再伸长的结果。
用于缩短研究的心肌细胞CS样本的代表性部分如图1A所示，图中还显示了在设定感兴趣区域（ROI）之前位置适当的单个心肌细胞（图1B）。一旦确定ROI（图1C；粉色框），位于心肌细胞下方的算法信息也有助于在记录前优化心肌细胞的定位。具体而言，线性光密度（LOD；黑线）可反映肌节的数量和间距，而快速傅里叶变换曲线（FFT，红线）中清晰的功率谱有助于实现最佳对齐，以准确记录细胞的缩短与再伸长过程。用于肌节长度校准（及边缘检测）的标线图案如<strong class=...

本文介绍了一组通过检测分离大鼠心肌细胞的肌节长度并结合钙离子（Ca2+）瞬变测量来评估收缩功能的实验方案。同时包含了该方法在心力衰竭动物模型研究中的应用。

啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca2+瞬变的分析

收缩功能障碍和钙瞬变通常作为心脏损伤综合评估的一部分在细胞水平进行分析……

该方法可检测心力衰竭发展过程中收缩功能的变化。还可用于筛选心肌细胞对神经激素及潜在治疗药物的功能反应。心肌细胞的定位可能需要反复练习，但对于获得稳定的肌节长度成像至关重要。演示该实验步骤的是实验室的副教授兼首席研究员 Margaret Westfall。在开始实验之前，将凝胶包和培养基放入37摄氏度的培养箱中预热30分钟。按照文稿中所述，打开收缩功能平台的各个组件，并将管路装配到蠕动泵中。然后，将预热的凝胶包放入试管架中，并接通细胞刺激仪的电源并开启真空。将装有培养基的50毫升试管放入隔热试管架中，通过蠕动泵管以每分钟0.5毫升的速度开始灌注。接着，向一个小的称量舟中加入2毫升预热的培养基，并将一片含有心肌细胞的盖玻片从刺激室转移至该称量舟中。将刺激室放回 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中。从称量舟上取下盖玻片，轻轻擦拭其底面，然后转移至涂有新鲜润滑脂的盖玻片腔室，并在盖玻片上滴加一滴培养基。将铂电极支架置于盖玻片上方，然后用镊子将一片新的盖玻片覆盖在顶部，再将上部支架放置在盖玻片夹层结构上。安装两个或四个零号平头螺钉以完成腔室的组装。当培养基已充满蠕动泵的管路时，将管路连接至预加热器，再将预加热器连接至盖玻片腔室。随后以 0.5 毫升/分钟的流速开始灌注，并在腔室下方放置一张吸水纸巾，以确保无泄漏。将盖玻片腔室放入显微镜的载物台适配器后，打开加热系统，使装置平衡5到10分钟，以确保腔室中心的培养基温度恒定在37摄氏度。观察通过连接至真空系统的管路在腔室另一端收集到的灌注培养基。在平衡期间，使用显微镜上的40倍水浸物镜观察心肌细胞。启动起搏刺激器时，将电压设置为 35 至 40 伏特，并将刺激频率调节至 0.2 赫兹，以优化收缩功能和心肌细胞存活率。为采集肌节缩短轨迹，打开计算机上的软件，依次选择确定、文件和新建选项卡。通过选择轨迹、编辑用户限值和肌节长度，准备屏幕模板。使用文件和新建选项卡记录肌节长度轨迹，识别一个正在收缩的心肌细胞，并将其沿相机的纵向轴线摆放，使横纹模式呈垂直方向。使用计算机鼠标将感兴趣区域（ROI）框放置在心肌细胞上。选择“采集”并开始记录收缩功能。在0.5赫兹的低刺激频率下，从每个心肌细胞记录60秒的缩短情况。每张盖玻片上记录5至10个细胞的肌节缩短。为测量不同频率下的缩短情况，需将心肌细胞在各个频率下稳定至稳态缩短后再进行记录。将灌注速率加倍，并在以0.2至2赫兹范围内新的频率刺激后15到20秒开始记录，每个盖玻片上针对给定刺激频率范围内的缩短反应记录不超过两个心肌细胞。每个细胞至少记录七次收缩，以获得可靠的信号平均数据。选择文件，选取一条记录的轨迹，然后选择打开。选择基线轨迹的第一个选项卡，然后调节轨迹顶部的黄色面板以获取肌小节长度。在菜单中必要的选项下，通过定义T零框中的单调瞬态分析选项和TTL事件标记，创建一个分析模板。通过选择模板并使用标识符保存分析模板，将这些分析选项保存下来。在分析每条轨迹之前，加载分析模板。要分析数据，请选择标记、设置门控、添加瞬态，然后从事件标记和分析范围进行转换。对于以 0.2 赫兹起搏的心肌细胞，将时间范围设置为 -0.01 至 1.20 秒。对于以较高频率刺激的心肌细胞，选择较短的时间范围。选择相应操作并平均化事件，以在原始基线轨迹下方生成平均信号记录。接着，选择平均信号轨迹的第一个标签，然后在上方菜单中点击“标记”（Marks），随后选择“添加瞬变”（add transient），再选择操作中的“单调瞬变分析”（monotonic transient analysis），以在平均信号显示面板中显示基线肌节参数的平均信号值。选择导出单音瞬态分析，并将电流和传递瞬态肌节分析复制到电子表格中，以进行多个心肌细胞的综合分析。要复制信号平均迹线，请依次选择“导出”、“电流迹线”、“剪贴板”和“选项”标签，并将小数位数设置为五位。选择制表符作为分隔符，然后单击“确定”。将每个心肌细胞记录的信号平均迹线排列到第二个电子表格中。该研究显示，与假手术组相比，压力超负荷（PO）会降低心肌细胞的收缩功能。然而，在心脏肌钙蛋白IT144D（cTnIT144D）基因转导后的第四天，PO心肌细胞的收缩能力恢复至接近假手术组水平，表明心肌细胞功能可被恢复。在早期研究中，与CTnI相比，cTnIT144D的基因转移增强了峰值缩短程度，并提高了舒张期钙水平。通常需要对心肌细胞的位置进行精细调整，以获得清晰的缩短轨迹。此外，该方案还可用于加载了钙敏感荧光染料（如Fura-2 AM）的心肌细胞，以同时检测钙瞬变和细胞缩短。

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医学

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成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

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评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对Ca2+的敏感性

我们介绍了分离小鼠心肌细胞的方法，以及如何利用荧光光度法结合同时进行的数字细胞形态测量，同步获得动作电位或钙瞬变信号与肌节缩短信号。...

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我们提出了一种评估GtACR1激活在兔心肌细胞中机电效应的实验方案。本文详细介绍了细胞分离、培养与腺病毒转导，以及采用膜片钳和碳纤维技术进行的功能实验。...

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本方案介绍了如何使用MyoBLAZER系统测量供体心脏来源的成人原代心肌细胞的收缩力。MyoBLAZER是一种可靠的平台，可用于临床前药物研发阶段评估药物诱导的收缩力变化。...

分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

本方案介绍了对来自野生型及患有儿茶酚胺能多形性室性心动过速的基因敲入型小鼠心脏进行的双染料光学标测，包括以高时间和空间分辨率记录跨膜电压和细胞内Ca2+瞬变的电生理学测量。...

儿茶酚胺能多形性室性心动过速 RyR2R2474S 基因敲入小鼠心脏的双染料光学标测

学习测量大鼠心肌细胞收缩功能的方法，通过检测肌节长度和钙瞬变来研究心力衰竭机制。该方案为心血管疾病研究提供可靠的实验技术平台。

啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca²⁺瞬变的分析

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