测量 秀丽隐杆线虫 对乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑的敏感性

本方案使研究人员能够观察秀丽隐杆线虫（C. elegans）对乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑（Levamisole）的反应。左旋咪唑敏感性的改变可能提示其神经肌肉接头信号传导或肌肉功能存在缺陷。该方法的主要优势在于，秀丽隐杆线虫在左旋咪唑溶液中剧烈游动，使研究人员能够在短短一小时内对数百条线虫的时间依赖性麻痹进行定量分析。

每五分钟统计每个孔中的线虫数量可能会非常繁琐。如有必要，可调整检测的孔数或时间点。首先，在烧瓶中加入搅拌子，将3克氯化钠、2.5克蛋白胨和17克琼脂与1升去离子水混合，制备线虫生长培养基。

高压灭菌后，将培养基置于设定为 70 摄氏度的加热板上，以中等速度搅拌一小时。逐滴加入 1 毫升浓度为 5 毫克/毫升的胆固醇溶液，以防止沉淀。向培养基中加入 1 毫升 1 摩尔的氯化钙溶液、1 毫升 1 摩尔的硫酸镁溶液以及 25 毫升 pH 6.0 的 1 摩尔磷酸钾缓冲液。

用无菌血清移液管将两毫升线虫生长培养基转移至24孔板的每个孔中。将培养板在实验台上干燥两天，然后接种细菌。挑取单个OP50菌落接种于B肉汤中，并在37摄氏度下振荡培养过夜。

使用无菌移液器，将 30 µL OP50 菌悬液滴加到每个孔的琼脂表面中央。接种后，将培养板在室温下静置至少两天，以形成细菌菌苔。在 6 厘米培养板上将野生型 unc-63 Lev10 和 unc-49 C-elegans 培养至成虫期，每种品系至少准备八块培养板。

在同步化的当天，在通风橱内配制漂白液。取10毫升次氯酸钠溶液、2.5毫升氢氧化钠溶液和37.5毫升去离子水，加入50毫升离心管中混匀。使用塑料移液管，用M9缓冲液冲洗至少四个培养板上的成年 gravid 线虫，并将其转移至15毫升离心管中。

在室温下以 716 ×g 离心一分钟，然后使用移液管去除上清液。加入 10 毫升漂白溶液。轻轻振荡试管 4 分钟，直至大部分但并非全部的线虫尸体溶解。

以716 ×g离心1分钟。一次性倒出漂白液。只要此时不晃动离心管，虫卵将黏附在管壁上，并加入15 mL M9缓冲液后倒置。

在716 ×g下离心1分钟，并以流畅动作倒出M9缓冲液。用缓冲液重复洗涤三次。最后一次洗涤后，加入10毫升新鲜M9缓冲液，置于15°C旋转仪上过夜，以获得同步化的饥饿状态的一龄幼虫群体。

将菌株打印至24孔板，并将其分配到随机位置。在漂白处理约24小时后，在室温下以716 ×g离心孵化并处于饥饿状态的L1期线虫1分钟。使用塑料移液管移除约9毫升M9缓冲液，然后轻轻混匀剩余M9缓冲液中的饥饿一期幼虫线虫。

立即用移液器吸取3微升线虫和M9缓冲液，转移到显微镜载玻片上，计数L1期幼虫数量。理想数量为每3微升中含有20至30条L1期幼虫。根据预先设计的孔板图，向每个孔中加入3微升L1期幼虫，于20摄氏度培养3天，使其生长至成虫阶段。

打印空白数据表，用于记录每5分钟每个孔中移动线虫的数量，持续一小时。检查24孔板中的线虫。使用记号笔在培养板盖上标记“X”，标出任何有污染、已饥饿或虫体过多而难以计数的孔。

通过将200微升100毫摩尔的左旋咪唑储备液加入50毫升M9培养基中，配制0.4毫摩尔的左旋咪唑溶液。启动计时器，然后使用移液管向头两个孔中各加入1毫升0.4毫摩尔的左旋咪唑溶液，使线虫处于自由游动状态。继续向相邻的孔中依次加入左旋咪唑，根据待检测孔的数量依次错开加药时间。在加药5分钟后，从第一个孔开始，手动计数每个孔中活动线虫的数量，并将该数值记录在数据表上。

每五分钟记录一次每个孔中移动的线虫数量，持续一小时。在实验结束或时间允许时，记录每个孔中的线虫总数。取出培养板，对照记录表，标注每个孔对应的品系。

从每个孔中线虫的总数开始，按基因型将数据录入电子表格。整合各孔的数据，确定每个时间点能够运动的线虫数量，并据此计算每个时间点发生麻痹的线虫数量。

建立一个数据表，其中左侧第一列为时间，后续各列分别填写每种菌株的数据。对于在前五分钟内出现瘫痪的每只动物，创建一行，并在五分钟对应的位置填入数字“1”。对每个时间点重复此操作。

对于在检测结束时未发生麻痹的所有动物，记录为60分钟时的数值为零。使用这些数据，在此处所用的特定统计软件中绘制生存曲线，以直观展示群体随时间变化的麻痹情况。所有检测品系的数据必须录入同一数据表中，必要时留出空白。

左旋咪唑乙酰胆碱受体亚基的突变，以及突触后左旋咪唑敏感型乙酰胆碱受体簇集所需基因的突变，会导致对左旋咪唑诱导的麻痹产生抗性，这分别在 unc-63 和 Lev-10 突变体中被观察到。由于胆碱能和 GABA 能信号传递的正常平衡被破坏，GABA 门控离子通道 unc-49 的缺失导致对左旋咪唑的超敏感性。正确制备 24 孔板至关重要。

如果在点样L1之前细菌菌苔未干燥，左旋咪唑溶液在检测过程中可能变浑浊，从而影响观察。通过改造24孔板，本方案可用于RNAi敲低的线虫。这使得研究人员能够研究那些尚无突变体可用的秀丽隐杆线虫基因。