测量 秀丽隐杆线虫 对乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑的敏感性
June 7th, 2022
本方案描述了一种测定以确定对左旋咪唑的反应，左旋咪唑是一类 秀丽隐杆线虫乙酰 胆碱受体的药理激动剂。在这种液体左旋咪唑游泳测定中，研究人员目视观察和定量在24孔板中培养的动物的时间依赖性麻痹。
该协议允许研究人员观察C-elgans如何对乙酰胆碱受体激动剂左旋米索作出反应。左旋咪唑敏感性改变可能提示其神经肌肉接头或肌肉功能的信号传导缺陷。一个主要的优点是，C-elgans在左旋咪唑溶液中的剧烈游泳使研究人员能够在短短一小时内定量数百种蠕虫的时间依赖性麻痹。
每五分钟计算一次每口井中的蠕虫数量可能会让人不知所措。分析的孔数，或时间点可以根据需要进行调整。开始制备线虫生长培养基，将3克氯化钠，2.5克Pep音调和17克琼脂与1升去离子水混合在带有搅拌棒的烧瓶中。
高压灭菌后，将培养基放在设置为70摄氏度的热板上，以中等速度搅拌一小时。滴加一毫升每毫升五毫克胆固醇，以防止沉淀。将一毫升一摩尔氯化钙、一毫升一摩尔硫酸镁和25毫升一摩尔pH 6.0磷酸钾缓冲液加入培养基中。
用无菌血清移液管将两毫升线虫生长培养基转移到24孔板的每个孔中。让盘子在工作台上干燥两天，然后与细菌一起坐下。将单个 op 50 菌落挑入 B 肉汤中，并将培养物在 37 摄氏度下振荡过夜。
使用无菌移液管，将30微升OP50悬浮液滴到每个孔中间的琼脂上。让板在就座后在室温下放置至少两天，以形成细菌草坪。在六厘米的平板上生长野生型 unc-63 Lev10 和 unc-49 C-elgan 至成年，每个菌株至少准备八个板。
在同步当天在引擎盖下准备漂白溶液。在 50 毫升编年史管中混合 10 毫升漂白剂、2.5 毫升氢氧化钠和 37.5 毫升去离子水。使用塑料转移移液器用M9缓冲液从至少四个板上洗涤妊娠成虫，并将它们转移到15毫升慢性管中。
在室温下将716 G旋转一分钟，然后使用移液管除去超级清液。加入10毫升漂白液。轻轻摇动管子四分钟，直到大部分但不是所有的蠕虫尸体都溶解了。
以 716 G 离心一分钟。一次性倒出漂白剂溶液。只要此时不摇动试管，鸡蛋就会在 15 毫升 M9 缓冲液下粘在试管的侧面并倒置。
以 716 G 离心一分钟，然后以一个平稳的动作倒出 M9 缓冲液。用缓冲溶液重复洗涤三次。最后一次洗涤后，加入 10 毫升新鲜 M9，并在 15 摄氏度的旋转器上放置过夜，以分离饥饿的第一幼虫阶段动物的同步种群。
打印出到24孔板并将菌株分配到随机位置。漂白剂制备后约24小时，在室温下以716 G离心孵化的饥饿L1蠕虫一分钟。用塑料移液管取出约9毫升M9缓冲液，然后将饥饿的第一幼虫阶段蠕虫轻轻混合在剩余的M9缓冲液中。
立即将三微升蠕虫和M9缓冲液移液到显微镜载玻片上，并确定L1的数量。所需数量为三微升中的 20 至 30 L1。根据预制板图将三微升L1移入每孔中，让蠕虫在20摄氏度下生长至成年三天。
打印空白数据表，该数据表将用于记录每五分钟在一小时内在每个孔中移动的蠕虫数量。检查24孔板中的蠕虫。使用记号笔，在任何有污染、饥饿或蠕虫过多的孔上的板盖上做一个 X，这将使计数变得困难。
通过将 200 微升 100 毫摩尔左旋咪唑原液加入 50 毫升 M9 中，制成 0.4 毫摩尔左旋咪唑溶液。启动一个计时器，然后使用移液管向前两个孔中加入一毫升0.4毫摩尔左旋咪唑，使动物自由游泳。继续将左旋咪唑添加到相邻孔中，根据要测定的孔数错开时间。五分钟后，从第一口井开始，仅手动计算每个孔中移动蠕虫的数量，并将该数字记录在数据表上。
继续每五分钟计算一次每个孔中移动蠕虫的数量，持续一小时。在测定结束时或时间允许的情况下，记录每个孔中的蠕虫总数。获取板，映射并记录对应于每个孔的菌株。
将数据输入电子表格，从每个孔中的蠕虫总数开始，并按基因型进行组织。结合来自井的数据，确定每个时间点移动的蠕虫数量。使用它来计算在每个时间点瘫痪的数字。
创建一个数据表，使左侧列指示时间，后续列包含每个菌株的数据。对于在前五分钟内瘫痪的每只动物，创建一行并输入一行五分钟。对每个时间点重复此操作。
对于所有在测定结束时没有瘫痪的动物，输入零60分钟。使用这些数据在此处使用的特定统计软件中创建生存曲线，以直观地显示人群的时间依赖性瘫痪。所有检测菌株的数据必须输入到同一个数据表中，并根据需要留出空格。
左旋咪唑乙酰胆碱受体亚基的突变，以及突触后左旋咪唑敏感乙酰胆碱受体聚集所需的基因突变，分别在unc-63和Lev-10突变体中观察到对左旋咪唑诱导的麻痹产生抵抗力。GABA门控离子通道unc-49的丢失由于胆碱能和GABA能信号传导的适当平衡被破坏而引起左旋咪唑超敏反应。正确制备 24 孔板至关重要。
如果在发现L1之前细菌草坪不干燥，则左旋咪唑溶液在测定过程中会变得浑浊，从而抑制观察。通过修改24孔板，该协议可以用RNAi敲除动物进行。这使得研究人员能够研究C-elgan的基因，而这些基因没有突变体。
概述
本协议描述了一种液体游泳测定法，用于评估秀丽隐杆线虫对乙酰胆碱受体激动剂左旋咪唑的反应。研究人员可以在24孔板中培养的蠕虫中直观地观察并量化时间依赖性的麻痹。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 药理学
- 行为生物学
背景
- 左旋咪唑用于研究秀丽隐杆线虫的神经肌肉信号传导。
- 对左旋咪唑的敏感性改变可能表明神经肌肉接点信号传导缺陷。
- 该测定法允许以高通量方式观察麻痹。
- 秀丽隐杆线虫是神经生物学研究中广泛使用的模式生物。
研究目的
- 量化秀丽隐杆线虫对左旋咪唑的麻痹反应。
- 调查基因突变对左旋咪唑敏感性的影响。
- 提供一种高通量分析神经肌肉功能的方法。
使用的方法
- 线虫培养基的制备和秀丽隐杆线虫的同步。
- 在24孔板格式中测定对左旋咪唑的反应。
- 在指定的时间间隔计算移动蠕虫的数量。
- 根据时间对麻痹进行数据分析以创建存活曲线。
主要结果
- 秀丽隐杆线虫对左旋咪唑的麻痹反应的定量数据。
- 识别影响左旋咪唑敏感性的基因突变。
- 证明该测定法用于高通量筛选的效率。
结论
- 液体游泳测定法可用于研究秀丽隐杆线虫的神经肌肉功能。
- 特定基因的突变可能导致对左旋咪唑诱导的麻痹的抗性。
- 该协议为未来关于神经肌肉信号传导的研究提供了一个稳健的框架。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of neuromuscular function in Caenorhabditis elegans using levamisole-induced paralysis provides a scalable platform for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This assay enables high-throughput evaluation of genetic or pharmacological perturbations affecting cholinergic signaling, supporting predictive confidence in neuromuscular target selection. Integration of robust, time-resolved phenotypic data informs portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuromuscular signaling pathways through pharmacological and genetic perturbation.
- Supports functional validation of acetylcholine receptor subunits and associated synaptic proteins.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying phenotypic consequences of target modulation.
- Provides comparative data across wild-type and mutant strains for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, scalable assay format suitable for high-throughput screening of genetic or chemical modifiers.
- Generates reproducible, quantitative outputs (paralysis curves) for robust compound or gene function evaluation.
- Enables rapid assessment of assay readiness and platform reuse across multiple genotypes or interventions.
- Supports downstream screening workflows by establishing validated biological response metrics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic outputs with disease-relevant neuromuscular dysfunction models.
- Provides continuity from discovery-stage target validation to preclinical mechanistic studies.
- Enables risk-adjusted advancement of targets with demonstrated functional impact in vivo.
- Supports translational biomarker development by linking genetic perturbations to quantifiable phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This liquid levamisole assay positions within the early discovery to lead identification continuum, enabling hypothesis testing and functional screening prior to preclinical model selection.
- Discovery Biology: Quantifies neuromuscular response to receptor agonists, clarifying pathway function and target relevance.
- Screening: Provides reproducible, time-resolved paralysis data for comparative analysis across strains or interventions.
- Analytics: Supports statistical analysis of survival curves and phenotype penetrance for robust decision-making.
- Translational Research: Bridges discovery findings to disease-relevant neuromuscular phenotypes in vivo.
- Enterprise Reuse: Adaptable for RNAi or mutant screening, enabling broad application across genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuromuscular target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes phenotypic screening with scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of functionally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, phenotypic scoring, and data analysis.
- Needs access to 24-well plate infrastructure and manual or automated counting capabilities.
- Demands cross-team standardization of assay timing, scoring criteria, and data management.
- Adaptable to RNAi or mutant strains, but may require optimization for specific genetic backgrounds.
- Observation quality can be affected by plate preparation and bacterial lawn consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Preparation of Plates for the Levamisole Assay
2:03
Synchronizing C. elegans
3:42
Plating Synchronized C. elegans
4:36
Performing the Levamisole Assay
5:47
Data Analysis
6:52
Results: Levamisole-Induced Paralysis in Wild Type and Representative Mutant C. elegans
7:28
Conclusion
