Name: 一种稳定建立的溶血磷脂酰胆碱诱导的小鼠局灶性脱髓鞘模型的两点注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 学习利用立体定位框架对小鼠进行两点溶血磷脂酰胆碱注射，建立稳定的胼胝体脱髓鞘模型。该方法适用于研究多发性硬化等脱髓鞘疾病的发病机制及潜在治疗策略。

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本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82071380，81873743）的资助。

所有动物实验程序均经中国华中科技大学同济医学院动物护理委员会批准。本研究使用成年C57BL/6雄性和雌性小鼠（野生型，WT；20–25 g；8–10周龄），小鼠购自商业来源（见 材料表）。小鼠饲养于特定病原体阴性（SPF）动物实验设施中，提供水和食物 随意摄取在22 °C温度和55%-60%相对湿度的标准条件下，保持12小时光照与12小时黑暗交替的循环。
1. 溶血磷脂酰胆碱（LPC）溶液的配制
<ol>
	<li>取25 mg LPC粉末（见材料表），加入250 µL氯仿与甲醇混合溶液（1:1），溶解配制成10%的LPC溶液，并转移至500 µL离心管中。 
	注意：若LPC未完全溶解，可将离心管置于超声清洗仪中，在40 kHz条件下超声处理约1小时，以获得均匀溶液。</li>
	<li>将溶液分装为每管3 µL，并于−80 °C保存。 
	注意：该溶液可保存约2年。</li>
	<li>手术前，将溶液（步骤1.2）用27 µL 0.9% NaCl溶液稀释，并置于37 °C恒温水浴中保温。 
	&#8203;注意：应在开始注射前立即配制该溶液。</li>
</ol>
2. 手术准备
<ol>
	<li>使用32 G、2英寸针头连接5 µL注射器（参见材料表）。确保微量注射器无堵塞。抽取5 µL LPC溶液以备注射。</li>
	<li>将小鼠置于与异氟烷挥发罐相连的诱导室中进行麻醉，使用3%异氟烷与100%氧气混合，流速约为0.3 L/min。</li>
	<li>通过夹捏脚趾无反射且呼吸平稳来确认麻醉深度。</li>
	<li>使用&#160;电动剃毛器剃除小鼠两耳之间的头部毛发。术中滴加润滑性眼药水，以防角膜干燥。</li>
	<li>随后将小鼠背侧朝上固定于立体定位仪（参见材料表）中，用鼻模和门齿夹固定头部，并通过鼻部持续给予1.2%–1.6%异氟烷以维持麻醉。 
	&#8203;注意：可根据小鼠的呼吸状态调整异氟烷浓度。</li>
</ol>
3. 手术步骤
注意：所有操作过程中，动物均置于加热垫上。
<ol>
	<li>将小鼠用双侧耳杆固定于立体定位仪上。确保耳杆处于水平位置，头部保持水平且稳定。</li>
	<li>对头部皮肤进行消毒&#160;用碘伏以环形方式多次擦拭，随后用酒精擦拭。然后使用手术刀&#160;沿头皮中线切开一个约1.5 cm的小切口，以暴露颅骨。</li>
	<li>用浸有1%过氧化氢的棉签擦拭颅骨，直至前囟、后囟和枕囟暴露清晰。将注射器置于立体定位仪上。 
	注意：使用过氧化氢时需谨慎，避免接触周围组织。</li>
	<li>确保动物头部处于水平位置（前后及左右方向）。
	<ol>
		<li>调节立体定位仪的Z轴旋钮，使针尖与颅骨刚好接触而不发生弯曲，然后测量Z轴坐标。记录前囟和后囟的Z坐标。</li>
		<li>调整耳杆，使前囟和后囟的Z坐标差异不超过0.02 mm。然后采用相同方法测量中线左右两侧对应位置的Z坐标，调节耳杆以确保左右两侧处于同一水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位胼胝体。将XYZ坐标原点设在前囟。 
	注意：第一个注射位点位于前囟外侧1.0 mm、深度2.4 mm、前囟前方1.1 mm处。第二个注射位点位于前囟外侧1.0 mm、深度2.1 mm、前囟前方0.6 mm处。例如，前囟的坐标为(0,0,0)。测量相应标记位置的Z坐标，记为(-1, 1.1, X)和(-1, 0.6, Y)。由此可确定胼胝体的第一个注射位点坐标为(-1, 1.1, −[X + 2.4])，第二个注射位点坐标为(-1, 0.6, −[Y + 2.1])。</li>
	<li>确定注射位点后，使用无菌标记笔在颅骨上做标记，并记录坐标。</li>
	<li>用颅骨钻轻轻钻开标记的部位（参见 材料表）。注意避免任何出血。</li>
	<li>缓慢将针头移动至指定坐标，开始注射。为诱导胼胝体脱髓鞘，以0.4 µL/min的速度在每个注射位点（步骤3.5）注入2 µL LPC溶液（步骤1）。</li>
	<li>注射后，将针头在每个注射部位保留额外10分钟。 
	&#8203;注意：确保两次注射的间隔不超过 20 分钟。</li>
	<li>用4-0缝线缝合皮肤，并在10分钟内等待动物苏醒。给予镇痛药物&#160;根据机构的动物护理规定在术后进行。 
	注意：安乐死的推荐时间可根据实验目的确定。&#160;</li>
</ol>
4. 局灶性脱髓鞘样本提取
注意：有关此步骤的详细信息，请参见先前发表的报告14。
<ol>
	<li>将中性红染料（参见材料表）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成1%溶液。</li>
	<li>在处死小鼠前数小时（具体细节参见先前文献10），通过腹腔注射方式，每只小鼠注射500 µL 1%的中性红染料PBS溶液。</li>
	<li>用预冷至4 °C的0.1% PBS溶液进行心脏灌注12，灌注量为30 mL。</li>
	<li>使用脑组织切片模具（参见材料表）将脑组织切成1 mm厚的切片。</li>
	<li>在显微镜下观察经中性红染色的病灶区域，并分离病灶组织。 
	&#8203;注意：尽可能去除周围正常组织，以提高后续分析的准确性。病灶组织可用于RT-PCR、电子显微镜和蛋白质印迹分析。</li>
</ol>
5. 组织学染色与免疫荧光
<ol>
	<li>进行组织学染色和免疫荧光检测12时，在心脏灌注（步骤4.3）后取出脑组织10，用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C下固定过夜，并在30%蔗糖溶液中完全脱水。</li>
	<li>使用恒温冷冻切片机10（−20 °C）将脑组织切成20 mm冠状切片。</li>
	<li>将切片用于Luxol快蓝（LFB）染色、免疫荧光染色以及蛋白质印迹（western blot）10。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，是导致青壮年神经功能障碍最常见的病因之一20。临床上，约60%–80%的MS患者在发展为继发进展型MS之前，会经历反复发作与缓解的病程21,22，并随着时间推移最终导致运动功能障碍和认知缺陷的累积23。目前尚无单一的实验模型能够涵盖该疾病在临床表现、病理特征或免疫学特性上的全部多样性24。为了模拟MS在不同阶段的病理过程和发病机制，现有三种常用的脱髓鞘动物模型，各有其优势与局限性，分别为实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型、喂饲环己亚硝脲（CPZ）动物模型以及LPC诱导的脱髓鞘模型。
在小鼠中，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）由注射髓鞘抗原后引发的免疫反应所诱导，导致小胶质细胞活化以及血管周围T和B淋巴细胞浸润，伴随的髓鞘损伤常与疾病复发相关<sup class='...

受体介导的溶血磷脂信号通路几乎参与了所有器官系统的多种生理过程1。在中枢神经系统（CNS）中，该信号通路在多发性硬化症（MS）等自身免疫性神经系统疾病的发病机制中发挥着关键作用。多发性硬化症是一种慢性免疫介导性疾病，其特征为病理性脱髓鞘和炎症反应，导致神经功能障碍和认知损害2,3。在疾病早期经历反复发作与缓解后，大多数患者最终会进展至继发进展型阶段，可能导致大脑不可逆损伤并引发残疾4。目前认为，继发进展型病程的病理学特征是由炎性病灶引起的脱髓鞘斑块5。现有的多发性硬化症治疗方法可显著降低复发风险，但对于进展型多发性硬化所导致的长期脱髓鞘损伤，仍缺乏有效的治疗手段6。因此，需要建立一种稳定且易于重复的模型，用于研究针对白质变性的临床前治疗策略。
脱髓鞘和髓鞘再生是多发性硬化症发展过程中的两个主要病理过程。脱髓鞘是指小胶质细胞在促炎表型作用下诱导轴突周围髓鞘丢失的过程7，其导致神经冲动传导减慢，并引发神经元丢失及神经系统功能障碍。髓鞘再生是一种由少突胶质细胞介导的内源性修复反应，该过程若发生障碍，可能导致神经退行性变和认知功能损害8。炎症反应在整个过程中至关重要，影响着髓鞘损伤与修复的程度。
因此，构建稳定的持续性炎症性脱髓鞘动物模型对于进一步探索多发性硬化症（MS）的治疗策略具有重要意义。由于MS的复杂性，目前已建立多种动物模型以模拟脱髓鞘病变 体内，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）、中毒性脱髓鞘模型、环己酮（CPZ）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）9. LPC 是一种内源性溶血磷脂，与炎症相关，可对髓鞘脂质产生快速毒性损伤，导致局灶性脱髓鞘。根据以往的报道和研究10,11，提供了一种两点注射的详细方案并做了一些修改。通常，经典的单点LPC注射模型仅在注射部位产生局部脱髓鞘，且常伴随自发性再髓鞘化12,13然而，两点注射LPC模型可以证明LPC能够直接诱导小鼠胼胝体脱髓鞘，并导致更持久的脱髓鞘，且髓鞘再生极少。

<table><tbody><tr><td>L-&amp;alpha;-卵黄来源的溶血磷脂酰胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>32号针头</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l 注射器</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>高速颅骨钻</td><td>中国台湾，韩国</td><td>strong204</td><td></td></tr><tr><td>钻孔</td><td>Hager &amp;amp; Meisinger，德国&amp;nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Matrx 动物麻醉呼吸机</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>用于小鼠的便携式立体定位仪</td><td>奖励</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>奖励</td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷&amp;nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL 快速蓝</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>缝合</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>脑模具</td><td>奖励</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜固定液</td><td>Servicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>中性红（C.I. 50040），用于显微镜检查，Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>抗髓鞘碱性蛋白抗体&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr><tr><td>抗GST-P多克隆抗体</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 单克隆抗体（SolA15）</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;科学的</td><td>14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>β-肌动蛋白单克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-Ig&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>髓鞘碱性蛋白多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 多克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&amp;nbsp;AffiniPure&amp;nbsp;驴抗兔&amp;nbsp;IgG（H+L）</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure 驴抗大鼠 IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&amp;nbsp;AffiniPure 驴抗兔IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗兔 IgG（H+L）</td><td>abclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）&amp;nbsp;</td><td>abclonal</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>成年C57BL/6雄性和雌性小鼠</td><td>湖南赛诺杰生物科技有限公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种稳定建立的溶血磷脂酸胆碱诱导小鼠局灶性脱髓鞘两点注射模型

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

受体介导的溶血磷脂信号通路参与多种神经系统疾病的病理生理过程，尤其是多发性硬化症（multiple sclerosis, MS）。溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）是一种内源性溶血磷脂，与炎症反应相关，可快速损伤髓鞘脂质并产生毒性作用，导致局灶性脱髓鞘。本文详细介绍了一种立体定位双点LPC注射技术，通过手术方式直接在小鼠脑内诱导严重脱髓鞘，快速且稳定地建立实验性脱髓鞘损伤模型。因此，该模型与脱髓鞘疾病（特别是多发性硬化症）高度相关，有助于推动具有临床相关性的科学研究进展。此外，采用免疫荧光染色和Luxol快蓝染色方法，描绘了LPC注射后小鼠胼胝体脱髓鞘的时间进程变化。同时，利用行为学方法评估了造模后小鼠的认知功能。总体而言，溶血磷脂酰胆碱双点注射 通过 立体定位仪是一种稳定且可重复的方法，用于在小鼠中建立脱髓鞘模型，以供进一步研究。

两次注射LPC可导致更持久的脱髓鞘 
LPC主要引起髓鞘的快速损伤，并对轴突完整性产生毒性作用并导致其断裂15。注射当天记为第0天。小鼠饲养时间为10至28天（10 dpi和28 dpi）。采用Luxol快蓝（LFB）染色法10评估在这些时间点小鼠的脱髓鞘面积。在两次注射模型中，与假手术组相比，10 dpi时出现显著的脱髓鞘，表明LPC的局部注射可成功诱导胼胝体脱髓鞘。至28 dpi时仍存在较高程度的脱髓鞘，提示两次注射LPC可导致持续且稳定的脱髓鞘状态（图1D-E）。
为了进一步评估髓鞘的丢失情况，选择10天作为关键时间点，此时脱髓鞘现象相对明显。通过免疫荧光染色检测降解的髓鞘碱性蛋白（dMBP），在注射LPC后第10天，dMBP在注射组中显著增加（图1F），表...

本方案描述了一种溶血磷脂酰胆碱的两点注射法 通过 使用立体定位仪在小鼠中建立稳定且可重复的脱髓鞘模型。

受体介导的溶血磷脂信号通路参与多种神经系统疾病的病理生理过程，尤其是多发性硬化症（MS）。

我们的模型与脱髓鞘疾病高度相关，尤其是多发性硬化症，并且有助于推动相关临床研究的发展。该方案是一种详细的实验操作流程，可通过手术方法在小鼠中快速、稳定地直接诱导严重的脱髓鞘病变。初次尝试该技术时，请保持耐心，并确保坐标准确。首先将一根32号针头连接至5微升注射器上。抽取5 µL LPC溶液用于制备注射液。接着，通过轻捏脚趾无反射且呼吸平稳来确认小鼠的麻醉深度。将小鼠置于立体定位仪中，背侧朝上，用鼻罩和门齿夹固定头部，并使用双侧耳杆将小鼠固定在立体定位装置上。确保耳杆水平，头部保持水平且稳定。用碘伏擦拭头部皮肤进行消毒。然后使用手术刀沿头皮正中线切开一个约1.5厘米的小切口，暴露颅骨。用浸有1%过氧化氢的棉签擦拭颅骨表面，直至暴露前囟、人字缝和后囟。将注射器置于立体定位仪上。确保动物头部处于水平位置，并定位胼胝体。确定注射位点后，记录坐标，并用记号笔在颅骨上做标记。使用颅骨钻轻轻钻开标记部位，注意避免出血。缓慢将针头移动至指定坐标。为诱导胼胝体脱髓鞘，以每分钟0.4微升的速度在每个注射位点注入2微升LPC溶液。注射完成后，将针头在每个位点额外留置10分钟。最后，使用4-0缝线缝合皮肤，并在10分钟内等待动物苏醒。代表性图像显示了通过劳克坚牢蓝（Luxol fast blue）染色检测到的白质病灶。结果显示，在注射后10天和28天均可观察到胼胝体稳定的脱髓鞘现象。不同时间点脱髓鞘区域的定量分析结果如图所示。通过免疫荧光染色检测降解的髓鞘碱性蛋白，可见LPC注射组在注射后第10天dMBP显著增加，表明胼胝体出现髓鞘丢失。对髓鞘碱性蛋白（MBP）表达的Western blot分析显示，注射LPC后MBP显著减少。以β-actin作为上样对照，用于测定基础表达水平。透射电子显微镜图像证实，假手术组和LPC注射组的胼胝体均存在髓鞘的超微结构。GST-pi是少突胶质前体细胞（OPC）分化成熟过程的标志物。鞘内注射 LPC 10 天后，GST-pi 较假手术组减少。同时，少突胶质细胞的增殖能力可通过增殖的少突胶质细胞与总少突胶质细胞系细胞的比例来反映。注射后第 10 天，该比例越高，表明少突胶质细胞的增殖越多。代表性图像显示了各组小鼠在平台存在时以及移除平台后的游泳路径。结果表明，在两点LPC注射模型中，脱髓鞘小鼠的空间记忆能力显著受损。在进行该操作时，务必确保注射速率准确，并在每个注射位点额外留针10分钟。

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一种稳定建立的溶血磷脂酰胆碱诱导的小鼠局灶性脱髓鞘模型的两点注射

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了在麻醉动物中通过手术暴露视神经并精确递送溶血卵磷脂以诱导局灶性脱髓鞘的过程，从而为后续研究建立神经病理学条件。...

使用溶血卵磷脂在视神经中诱导局部脱髓鞘

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本视频演示了使用两点溶血磷脂酰胆碱（LPC）注射法建立局灶性脱髓鞘小鼠模型的技术。首先暴露麻醉小鼠的颅骨，确定注射坐标后钻孔，以便在靶向位点进行LPC注射。LPC通过引发炎症反应导致神经元局灶性脱髓鞘，而两点注射可确保脱髓鞘效应的持续性。...

通过溶血磷脂酰胆碱两点注射建立局灶性脱髓鞘小鼠模型

本视频展示了使用溶血卵磷脂注射在小鼠脊髓神经元中诱导脱髓鞘的方法，随后通过少突胶质前体细胞的迁移与分化实现再髓鞘化。该过程会暂时损害神经元信号传导，并随后逐步恢复。...

小鼠脊髓神经元的脱髓鞘与再髓鞘化

来源：Wang, X. et. al.，基于渗透泵的药物递送用于中枢神经系统体内再髓鞘化研究。J. Vis. Exp.

基于渗透泵的神经治疗药物递送在脱髓鞘小鼠模型中的应用

一种用于小鼠脊髓成像的新型ex...

双光子成像技术观察小鼠脊髓中的细胞动态

通过将溶血卵磷脂局部施用于中枢神经系统，可以在动物体内建立脱髓鞘疾病的模型。向小鼠脊髓单次注射溶血卵磷脂可产生一处病灶，该病灶会随时间推移自发修复。本研究的目的是探讨参与脱髓鞘及再髓鞘化过程的相关因素，并测试能够促进修复的干预手段。...

小鼠脊髓局灶性注射溶血卵磷脂诱导脱髓鞘与再髓鞘化的实验方法

本文所述方案可在成年雄性Dark...

通过脑内注射促炎性细胞因子诱导广泛性大脑皮层脱髓鞘的大鼠模型

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎是目前最常用的多发性硬化小鼠模型之一。在本方案中，对两种性别的C57BL/6J小鼠使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽进行免疫，主要导致尾巴和肢体的上升性轻瘫。本文将讨论EAE的诱导与评估方案。...

在两种性别中建模多发性硬化症：MOG35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎

学习利用立体定位框架对小鼠进行两点溶血磷脂酰胆碱注射，建立稳定的胼胝体脱髓鞘模型。该方法适用于研究多发性硬化等脱髓鞘疾病的发病机制及潜在治疗策略。

一种稳定建立的溶血磷脂酸胆碱诱导小鼠局灶性脱髓鞘两点注射模型

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