Name: 在定制灌注生物反应器中获取和灌注-脱细胞猪血管化皮瓣 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学习使用定制灌注生物反应器对猪血管化皮瓣进行外科获取和灌注脱细胞处理的技术。该方法可广泛应用于多种血管化皮瓣，为组织工程和重建手术提供可靠的脱细胞支架制备方案。

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所有涉及动物实验的操作均经大学健康网络机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循大学健康网络动物资源中心的方案与程序以及加拿大动物护理委员会指南。所有实验共使用五只约克夏猪（35-50 kg；年龄约12周）。
1. 灌注生物反应器的制备
<ol>
	<li>参见图1了解灌注生物反应器使用的所有组件。组织培养室的制备可采用市售的聚丙烯快锁容器，容器需带有防水、防气密封盖，并内置硅胶密封圈。确保容器可耐受高压灭菌。</li>
	<li>在容器两侧各钻一个1/4英寸的孔，穿入一段较短的L/S-16铂涂层硅胶管。其中一根用于输送灌注液流入，另一根用于流出。</li>
	<li>对于流入管路，在其内侧端部连接一个雄性鲁尔接头，用于连接组织插管；在外侧端部连接一个雌性鲁尔接头，用于连接三通旋塞阀。</li>
	<li>在培养室盖上钻一个1/4英寸的孔，穿入另一段较短的L/S-16铂涂层硅胶管，作为排气管。</li>
	<li>制备流入和流出管路时，取长约50 cm的L/S-16铂涂层硅胶管，一端连接黄色三滚泵管，另一端连接无菌的2 mL移液管，用于将灌注液从洗涤剂储液罐输送至生物反应器腔室。</li>
	<li>将所有组件（腔室和管路）分别用无菌包装纸包裹后进行高压灭菌。</li>
</ol>
<img alt="流体动力学系统示意图；用于平衡研究的带管路和容器的水流装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64068/64068fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：灌注生物反应器的制备。灌注生物反应器由以下部分组成：（A）一个塑料聚丙烯组织室（B），其侧壁钻有孔洞，用于安装灌注管路，并配有密封防漏的盖子；（C）在管路上连接旋塞阀，以便连接灌注管路，使脱细胞试剂从洗涤剂储液罐单程流至废液收集处；（D）使用匹配的泵用管路盒将三通管路连接至蠕动泵。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64068/64068fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 脱细胞溶液的制备
<ol>
	<li>通过将1.5 mL的1000 I.U./mL肝素储备液加入100 mL生理盐水中，配制含肝素的生理盐水溶液（15 IU/mL）。</li>
	<li>将9 g十二烷基硫酸钠（SDS）粉末缓慢加入18 L经高压灭菌的去离子蒸馏水中，配制0.05% w/v十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。使用大容量聚丙烯（PP）塑料瓶盛装SDS溶液。待溶液完全溶解后即可使用。室温保存。</li>
	<li>制备DNase I工作液。首先，用5 mM CaCl₂将冻干的DNase I重悬，配制成10 mg/mL的储存液。2 在无菌 dH₂O 中2O. 将重悬的DNase I贮存液分装后于−20 °C 冷冻保存直至使用。使用当天，用 Mg 将 DNase I 储液按 1:100 稀释++（1.29 mM）和 Ca++(1.98 mM) 于无菌 dH₂O 中2O至终浓度为0.1 mg/mL。 
	注意：DNase 活性若不冷冻保存会降解。室温下进行DNA酶消化时，应仅使用新鲜配制的工作浓度DNase溶液。</li>
	<li>在聚丙烯试剂瓶中，用无菌高压灭菌水将10倍浓度PBS贮存液按1:10比例稀释，配制成终体积为5 L的1倍浓度PBS溶液。室温保存。</li>
	<li>在 PBS 中配制 1% 抗生素/抗真菌素（A/A）。将 100 倍浓度的抗生素/抗真菌素用无菌 1×PBS 溶液按 1:100 比例稀释，定容至 1 L。室温保存。</li>
	<li>将3.13 mL过氧乙酸（PAA）与40 mL 100%乙醇（EtOH）及956 mL无菌去离子水混合，配制0.1%（v/v）过氧乙酸（PAA）/4%（v/v）乙醇（EtOH）溶液。2将终体积定容至 1,000 mL，室温保存。</li>
</ol>
3. 获取猪皮瓣
注意：此为终末性操作步骤。获取全部三个皮瓣时使用一头猪。在获取所有皮瓣后，人道处死动物。
<ol>
	<li>术前护理
	<ol>
		<li>术前至少禁食猪 12 小时。通过肌肉注射给予氯胺酮（20 mg/kg，IM）、阿托品（0.04 mg/kg，IM）和咪达唑仑（0.3 mg/kg，IM）进行镇静。</li>
		<li>通过面罩吸入 5% 异氟烷（流速为 22–44 mL/kg/min）诱导麻醉，用于外周静脉置管和气管插管。以 0.5%–2% 异氟烷（22–44 mL/kg/min）维持麻醉。通过监测血流动力学稳定性，并观察角膜/足底回缩反射消失或下颌肌张力降低，判断麻醉深度是否足够。术中持续静脉输注瑞芬太尼（10–20 µg/kg/h）以提供镇痛。</li>
		<li>使用合适尺寸的气管导管（7–8 mm）为猪进行气管插管，并将导管连接至呼吸机，设定潮气量为 8 mL/kg，呼气末正压（PEEP）为 5 cm H2O，吸入氧浓度（FiO2）为 0.5，呼吸频率为 14 次/分钟。</li>
		<li>在耳缘静脉插入 22 G 血管套管。建立静脉通路后，全程以 5–10 mL/kg/h 的速度输注温热的 0.9% 生理盐水，以维持平均动脉压在 60 mmHg 至 90 mmHg 之间。</li>
		<li>持续监测心率、脉搏血氧饱和度及呼气末二氧化碳（CO2）。每 5 分钟评估一次血压和体温。</li>
		<li>使用眼药膏防止麻醉期间角膜干燥。用聚维酮碘对整个手术区域进行消毒，并以无菌毛巾覆盖手术野。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大网膜瓣
	<ol>
		<li>将猪置于仰卧位，行剑突至脐部的腹正中切口开腹。</li>
		<li>进入腹腔后，将胃向头侧牵拉以显露大网膜。小心将大网膜移入手术视野，并识别沿胃大弯走行的胃网膜血管（图 2A）。</li>
		<li>从胃大弯左侧开始，即左胃网膜动脉与脾动脉汇合处。使用直型 Stevens 腱膜剪，游离左胃网膜动脉和静脉，分别以结扎线或血管夹结扎后切断。</li>
		<li>沿胃大弯从左向右继续操作。结扎并切断起源于大网膜、供应胃大弯的短小血管分支。此步骤中需注意避免损伤大网膜主干的胃网膜血管蒂。</li>
		<li>继续游离大网膜，直至遇到右胃网膜血管与胃十二指肠动脉的汇合处。使用血管夹或结扎线分别结扎并切断右胃网膜动脉和静脉，以完全游离大网膜瓣。</li>
		<li>游离后，可沿中线将大网膜分为两半，每半各保留一条对应的胃网膜动脉和静脉。由此可在一次动物手术中获取两个大网膜游离瓣。分别以 20–22 G 套管插入胃网膜血管，并用 3-0 丝线固定。</li>
		<li>通过胃网膜动脉套管灌注肝素化生理盐水（15 I.U./mL），直至观察到清晰的静脉流出液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>阔筋膜张肌瓣 
	注：本方案基于 Haughey 等人先前对猪阔筋膜张肌瓣的描述19。本研究进行了修改，仅分离阔筋膜张肌瓣的筋膜部分。
	<ol>
		<li>将猪置于侧卧位，双侧上后肢全部剃毛。按常规无菌操作进行皮肤准备和铺巾。</li>
		<li>以一条从髂前上棘（ASIS）指向髌骨外侧的连线标记皮瓣的前界。血管蒂的位置大约位于该线上距 ASIS 6–8 cm 处。</li>
		<li>沿股骨轴线，在前切口后方约 8–10 cm 处标记一条平行的后界线，以确定皮瓣宽度。在髌骨外侧标记皮瓣的远端边缘。</li>
		<li>从髌骨远端边缘开始，使用手术刀做锐性切口切开皮肤。用电凝刀继续切开皮下组织，直至暴露股直肌表面的筋膜。</li>
		<li>沿上述标记的前后边界向 ASIS 延伸皮肤切口。为仅分离筋膜瓣，需将覆盖其上的皮肤组织从下方筋膜层剥离。结扎或电凝任何通向皮肤的小穿支血管。</li>
		<li>返回皮瓣远端边缘，切开深筋膜，以便游离下方的股外侧肌。将筋膜向 ASIS 方向游离。</li>
		<li>在游离过程中，识别从股外侧肌与股直肌之间发出的血管蒂（图 2B）。操作中应避免过度牵拉，以防损伤血管蒂。</li>
		<li>在保护血管蒂的前提下，从 ASIS 处开始向近端解剖。继续游离，直至皮瓣在其血管蒂周围充分松解。</li>
		<li>沿血管蒂向深部股血管方向追踪。游离供应筋膜瓣的旋股外侧动脉和静脉，分别在其汇入深股血管处近端结扎并切断。</li>
		<li>使用 20 G 至 24 G 血管套管分别插入血管蒂，并以 3-0 丝线固定。通过皮瓣动脉套管灌注肝素化生理盐水（15 I.U./mL），直至观察到清晰的静脉流出液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>桡侧前臂瓣 
	注：以下方案基于 Khachatryan 等人发表的猪桡侧前臂瓣模型描述20。
	<ol>
		<li>将猪置于手术台，采取侧卧位，使依赖侧的前肢位于手术野内。</li>
		<li>在桡侧前臂标记一个约 3 cm × 3 cm 的方形皮肤瓣。在近端皮瓣边缘中点与肘窝之间画一条线，以标示桡动脉血管蒂的大致走行。通过触诊确认动脉走行。 
		注：在猪模型中，桡血管位置较人类更深，位于桡侧腕屈肌与肱桡肌之间。</li>
		<li>使用手术刀在远端切开皮肤，深度达前臂筋膜。用腱膜剪钝性分离，直至暴露远端桡动脉及其两条伴行静脉。分别以结扎线结扎动脉和静脉后切断。</li>
		<li>继续沿标记皮肤方块的桡侧和尺侧边缘延长皮肤切口。使用手术刀从桡侧向尺侧方向游离皮瓣，同时将皮肤瓣从桡骨表面抬起，并向近端肘窝方向掀起。 
		注：应保持筋膜下分离平面，以确保桡动脉血管蒂与上方皮层保持连接。</li>
		<li>在近端边缘，使用自动牵开器牵开肱桡肌与桡侧腕屈肌之间的间隙，以暴露近端桡动脉及其伴行静脉（图 2C）。</li>
		<li>使用腱膜剪在肘窝处向上游离桡动脉及其伴行静脉，直至其分别汇入肱动脉和静脉。将血管从周围纤维脂肪组织中分离，获得约 5–6 cm 的足够血管蒂长度。分别结扎并切断动脉和伴行静脉，以完全游离桡侧前臂瓣。</li>
		<li>使用 20 G 至 24 G 血管套管插入血管蒂，并以 3-0 丝线固定。通过皮瓣动脉套管灌注肝素化生理盐水（15 IU/mL），直至观察到清晰的静脉流出液。</li>
		<li>皮瓣获取后，将其置于 4 °C 的冷生理盐水中保存，直至进行脱细胞处理。在深度异氟烷麻醉下，通过静脉注射氯化钾（100 mg/kg，IV）处死动物。通过生命体征消失确认死亡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="动物解剖设置中的手术解剖图，标注的组织和结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64068/64068fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：获取三种猪的带血管化皮瓣。（A）大网膜。在大网膜皮瓣（iii）中，右（i）和左（ii）胃网膜动脉被插管。（B）阔筋膜张肌皮瓣。皮瓣的血管蒂（iv）为旋股外侧动脉的升支（v）。（C）桡动脉前臂皮瓣。桡动脉前臂皮瓣（vi）的获取以桡动脉及其伴行静脉（vii）作为血管蒂（注：为演示目的，省略了手术巾）。比例尺：3 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64068/64068fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
脱细胞系统的设置
<ol>
	<li>在层流生物安全柜内的无菌条件下组装带有皮瓣的组织腔室。</li>
	<li>在生物反应器的进液口和出液口分别连接三通旋塞阀。在组织腔室盖的通气口上安装一个 0.2 µm 滤器。用无菌肝素化生理盐水预冲进液管路，以排除气泡。</li>
	<li>将皮瓣放入腔室内。使用无菌止血钳，通过公型鲁尔接头将皮瓣连接至进液管路。将每个皮瓣相应的动脉插管旋紧到公型鲁尔接头上，并确保密封严密。</li>
	<li>通过旋塞阀冲洗肝素化生理盐水，检查鲁尔连接处是否无泄漏，并确认皮瓣可被灌注且有静脉流出液出现。关闭组织腔室盖。</li>
	<li>将带有黄色三停泵管的进液管路连接至组织腔室的进液三通旋塞阀。同时，在进液三通旋塞阀上连接一个管路内压力传感器换能器，以便监测灌注压力。</li>
	<li>打开进液蠕动泵。在初始界面中，使用箭头键进入第三个选项卡，将管路内径设置为 1.85 mm。然后进入第二个选项卡以设置灌注速率。选择“速率”作为输送模式，并设定为 2 mL/min。确保屏幕上显示的流动方向正确。将黄色三停泵管装入匹配的盒式卡匣，并装载到蠕动泵上。</li>
	<li>对出液蠕动泵重复上述类似操作。将出液泵的设置调整为 4 mL/min 的速率。将带有黄色三停泵管的出液管路连接至组织腔室的出液三通旋塞阀。将三停泵管通过匹配的盒式卡匣装入蠕动泵。按下 Power 按钮，启动两台泵的流动。 
	注意：出液泵较高的流速是一项关键的安全措施，可防止组织腔室溢出，确保在脱细胞过程中腔室的出液量始终大于进液量。完整的脱细胞装置组装示意图见 图3。</li>
</ol>
<img alt="用于组织腔室流体流动调节和压力监测的蠕动泵系统示意图和设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64068/64068fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：组装完成的灌注脱细胞系统。（A）灌注脱细胞系统的示意图。流入管路以单程方式将灌注液从去污剂储液罐输送至组织腔室，并通过压力传感器进行监测。流出管路通过主动抽吸将灌注液从组织腔室排入废液容器中。黑色箭头表示灌注流动方向。使用左侧的蠕动泵控制流入，流出则通过另一台蠕动泵经相应管路主动抽出。图示使用 BioRender.com 制作。（B）在实验台面上组装好的灌注脱细胞系统照片，其中流入端的蠕动泵（i）连接至组织腔室（ii），再连接至流出端的蠕动泵（iii）。在灌注液进入组织腔室之前，通过管路内压力传感器（iv）监测其流入压力。本图中，三个瓣膜正在平行进行脱细胞处理。去污剂储液罐和废液储液罐均位于实验台下方，未在照片中显示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64068/64068fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 猪皮瓣的脱细胞处理
<ol>
	<li>在室温下进行以下所有灌注脱细胞步骤。有关灌注速率和持续时间的总结，请参见表1。使用蠕动泵以2 mL/min的流速开始肝素化生理盐水的灌注，并在组织腔室中对皮瓣进行15分钟的肝素化生理盐水灌注，以清除残留的血凝块。</li>
	<li>完成肝素化生理盐水灌注后，吸除组织腔室中的残余盐水。向组织腔室中加入约500 mL的SDS脱细胞溶液，确保完全浸没皮瓣。</li>
	<li>将进液管路转移至SDS脱细胞溶液中，并以2 mL/min的流速对组织进行灌注。灌注持续时间根据皮瓣类型而异：大网膜皮瓣灌注SDS 2天，阔筋膜张肌皮瓣灌注3天，桡动脉前臂筋膜皮瓣灌注5天。</li>
	<li>完成SDS脱细胞后，吸除组织腔室中现有的SDS灌注液。将进液管路转移至1x PBS溶液中，并以2 mL/min的流速对皮瓣灌注1天。</li>
	<li>移除先前的PBS溶液，并将进液管路转移至DNase工作溶液中。以2 mL/min的流速灌注2小时。随后从组织腔室中移除DNase溶液，并将进液管路置于1x PBS溶液中。在腔室内用1x PBS溶液浸没组织，并以2 mL/min的流速继续灌注1x PBS溶液1天。</li>
	<li>使用PAA/EtOH溶液对皮瓣进行灭菌。将进液管路转移至含dH2O的PAA/EtOH溶液中，并将组织完全浸没于相同溶液中。以2 mL/min的流速灌注PAA/EtOH溶液3小时。PAA/EtOH灭菌完成后，断开三通旋塞上的管路连接。</li>
	<li>采用无菌技术取出皮瓣，并将无菌器械置于含有1%抗生素/抗真菌剂（A/A）的PBS中。将皮瓣分别在PBS + 1% A/A中浸泡洗涤两次，每次15分钟，以充分中和残留酸。将皮瓣保存于PBS + 1% A/A中，并置于4 °C冰箱中，直至准备进行再细胞化。</li>
	<li>通过在琼脂平板上进行拭子培养来验证支架的无菌性，并观察是否有微生物生长。用拭子从每块皮瓣表面取样后接种琼脂平板。将琼脂平板在37 °C下培养最多2周。无菌性的标准为无微生物菌落生长。</li>
</ol>
表1：灌注-脱细胞方案参数汇总。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64068/Xu%20et%20al%20JOVE%20Table%201.png" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
6. 脱细胞效果的评估
<ol>
	<li>使用穿孔活检针从皮瓣上获取厚度为 3 mm 至 10 mm 的组织样本。</li>
	<li>用于组织学分析时，将活检组织置于组织学包埋盒中，用中性缓冲甲醛溶液在室温下固定 24 小时。</li>
	<li>将活检包埋盒用清水或 PBS 洗涤 15 分钟，然后转移至 70% 乙醇中保存，直至进行组织处理。按照标准操作程序将包埋盒放入组织处理机中进行处理。</li>
	<li>将活检组织包埋于石蜡中，并在冷台上冷却 10–15 分钟使石蜡凝固。使用切片机将石蜡块切成 5 µm 厚的切片。按照标准操作程序对切片进行苏木精-伊红（H&amp;E）染色。采用光学显微镜对组织切片进行成像。</li>
	<li>用于 DNA 含量定量时，将组织活检样本置于 60 °C 烤箱中过夜干燥后称量干重。将样本在木瓜蛋白酶提取缓冲液中 65 °C 条件下消化过夜。将消化后的样本在 10,000 x g 条件下离心，取上清液转移至新的微量离心管中。按照生产商说明书，使用商用 DNA 提取试剂盒检测 DNA 含量。</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Forearm+Flap+Donor-Site+Complications+and+Morbidity%3A+A+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).</li>
<li>Edsander-Nord, Å, Jurell, G., Wickman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-site+morbidity+after+pedicled+or+free+TRAM+flap+surgery%3A+A+prospective+and+objective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).</li>
<li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+of+free-style+flaps%3A+Risk+analysis+of+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651(2018).</li>
<li>Issa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allograft-specific+characteristics+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses.</a> Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).</li>
<li>Kueckelhaus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+composite+allotransplantation%3A+Current+standards+and+novel+approaches+to+prevent+acute+rejection+and+chronic+allograft+deterioration%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration.</a> Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).</li>
<li>Iske, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+tissue+allotransplantation%3A+Opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges.</a> Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).</li>
<li>Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+implications+for+extracellular+matrix-based+technologies+in+vascularized+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation.</a> Stem Cells International. 2016, 1541823(2016).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-based+materials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).</li>
<li>Colazo, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applied+bioengineering+in+tissue+reconstruction%2C+replacement%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).</li>
<li>Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization in tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skin%2Fadipose+tissue+flap+matrix+for+engineering+vascularized+composite+soft+tissue+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps.</a> Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).</li>
<li>Jank, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+bioengineered+skin+flap+scaffold+with+a+perfusable+vascular+pedicle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle.</a> Tissue Engineering - Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).</li>
<li>Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+large-volume+human-derived+adipose+acellular+allogenic+flap+by+perfusion+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization.</a> Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+skeletal+muscle+as+a+three-dimensional+scaffold+with+a+vascular+network+template%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template.</a> Biomaterials. 89, 114-126 (2016).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+the+porcine+ear+generates+a+biocompatible%2C+nonimmunogenic+extracellular+matrix+platform+for+face+subunit+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering.</a> Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularization+of+human+ear+grafts+enables+ECM-based+scaffolds+for+auricular+vascularized+composite+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).</li>
<li>Duisit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+human+face+graft%3A+The+matrix+of+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a human face graft: The matrix of identity.</a> Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).</li>
<li>Haughey, B. H., Panje, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porcine+model+for+multiple+musculocutaneous+flaps%5BTitle%5D)+AND+%22The+Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">A porcine model for multiple musculocutaneous flaps.</a> The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).</li>
<li>Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhachatryan%2C+A+%22Microsurgery+Manual+for+Medical+Students+and+Residents%3A+A+Step-by-Step+Approach%22">Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach</a>. , Springer. Denmark. 177-181 (2021).</li>
<li>Hammouda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+nanostructure+of+SDS+micelles+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+of+the+National+Institute+of+Standards+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water.</a> Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).</li>
<li>Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+a+fasciocutaneous+flap+for+use+as+a+perfusable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold.</a> Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).</li>
<li>Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+tissue+decellularization+used+for+preparation+of+biologic+scaffolds+and+in+vivo+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance.</a> Methods. 84, 25-34 (2015).</li>
<li>Mendibil, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+decellularization+methods%3A+Rationale+and+strategies+to+achieve+regenerative+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447(2020).</li>
<li>Lupon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+allografts+using+natural+scaffolds%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B+Reviews%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review.</a> Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).</li>
<li>Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+composite+tissues+by+perfusion+decellularization%2Frecellularization%3A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Transplantation+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review.</a> Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).</li>
<li>Adil, A., Xu, M., Haykal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularization+of+bioengineered+scaffolds+for+vascular+composite+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Surgery%22%5BJournal%5D)">Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation.</a> Frontiers in Surgery. 9, 843677(2022).</li>
<li>Phelps, E. A., García, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+more+than+a+cell%3A+Vascularization+strategies+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering.</a> Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).</li>
<li>Pozzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reliable+porcine+fascio-cutaneous+flap+model+for+vascularized+composite+allografts+bioengineering+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (181), e63557(2022).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), e2394(2011).</li>
<li>Uzarski, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+repopulation+and+preparation+of+rodent+extracellular+matrix+scaffolds+for+renal+tissue+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53271(2015).</li>
<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).</li>
<li>Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+systems+and+devices%3A+State-of-the-art%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularization systems and devices: State-of-the-art.</a> Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).</li>
<li>Schilling, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+an+automatable%2C+3D+printed+perfusion+device+for+tissue+infusion+and+perfusion+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案采用低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）灌注法对多种猪源皮瓣进行脱细胞处理。通过该方法，可成功对大网膜、阔筋膜张肌和桡动脉前臂皮瓣进行脱细胞处理，且该方案优先使用低浓度SDS。初步优化实验结果表明，当使用组织学技术进行分析时，0.05%的低浓度SDS在2至5天内即可有效去除大网膜、阔筋膜张肌及桡动脉前臂皮瓣中的细胞成分（补充图1、补充图2、补充图3）。该方法操作简便，可在较短时间内以合理成本实现脱细胞。根据我们的经验，猪源皮瓣的脱细胞与灭菌过程通常需要2至5天，组织密度越高，所需脱细胞时间越长（例如前臂皮肤需5天，而大网膜仅需2天）。此外，本方案选择低浓度SDS的依据在于，0.05%的SDS浓度低于其临界胶束浓度（约0.2%21），因此该表面活性剂可有效溶解细胞膜，同时保留重要的生物活性细胞外基质（ECM）成分。本方案中低浓度SDS的使用，与既往研究者报道的在血管化筋膜皮瓣灌注脱细胞过程中使用相对较高浓度SDS（如1%）的方法形成对比13,22</su...

创伤性损伤和肿瘤切除可能导致大面积且复杂的软组织缺损。这些缺损会损害患者的生活质量，导致功能丧失，并引发永久性残疾。尽管自体组织皮瓣移植等技术已被广泛应用，但皮瓣来源有限以及供区并发症仍是主要局限性1,2,3。血管化复合组织异体移植（VCA）是一种有前景的替代方案，可将多种复合组织（如肌肉、皮肤、血管等）作为一个整体单位移植给受者。然而，VCA需要长期使用免疫抑制剂，可能导致药物毒性、机会性感染以及恶性肿瘤的发生4,5,6。
组织工程脱细胞支架可能是解决这些局限性的潜在方案7。脱细胞组织支架可通过脱细胞方法获得，该方法可去除天然组织中的细胞成分，同时保留其原有的细胞外基质（ECM）微观结构。与在组织工程中使用合成材料不同，使用生物来源的支架可提供一种仿生的ECM基质，具有良好的生物相容性，并具备临床转化潜力8。脱细胞处理后，再以受体特异性细胞对支架进行重新接种，即可生成具有功能且带血管化的组织，其免疫原性极低甚至无免疫原性9,10,11。通过建立有效的灌注脱细胞技术方案以获取脱细胞组织，可实现多种类型组织的工程化构建。在此基础上进一步优化该技术，还可将其应用于更复杂的组织。迄今为止，血管化软组织的灌注脱细胞已在多种简单血管化组织模型中开展研究，例如啮齿类12、猪13和人类模型中的全层筋膜皮瓣14，以及猪腹直肌骨骼肌组织15。此外，复杂血管化组织的灌注脱细胞也已有报道，例如在猪和人类耳部16,17模型以及人类全脸移植模型中实现的脱细胞处理18。
本文所述方案介绍了利用生物来源的细胞外基质（ECM）支架对带血管的游离皮瓣进行脱细胞处理的方法。我们展示了三种临床相关皮瓣的脱细胞过程：1）大网膜，2）阔筋膜张肌，3）桡动脉前臂皮瓣；这些皮瓣均属于重建外科中常规使用的主力皮瓣，但在动物研究中尚未在组织脱细胞背景下被系统研究过。这些生物工程化皮瓣提供了一个多功能且易于获取的平台，在大面积软组织缺损修复与重建领域具有潜在的临床应用价值。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 孔径 Acrodisk 滤器</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠溶液（生理盐水）</td><td>Baxter</td><td>JF7123</td><td></td></tr><tr><td>20 L 聚丙烯大容量瓶</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-62507-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Sofsilk 非吸收性外科结扎线</td><td>Covidien</td><td>&amp;nbsp;LS639</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-30600-04</td><td></td></tr><tr><td>Adson 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液，100X</td><td>Wisent</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>硫酸阿托品 15 mg/30ml</td><td>Rafter 8 Products</td><td>238481</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 20 号导管</td><td>VWR</td><td>BD381134</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 22 号导管</td><td>VWR</td><td>BD381123</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath 24 号导管</td><td>VWR</td><td>BD381112</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>DNA酶辅因子</td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>DNA 定量检测（Quant-iT PicoGreen 双链 DNA 检测试剂盒）</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>DPBS，10X</td><td>Wisent</td><td>311-415-CL</td><td>&amp;nbsp;不含 Ca++/Mg++</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito 止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>肝素，1000 I.U./mL</td><td>Leo Pharma A/S</td><td>453811</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮&amp;nbsp;5000 mg/50 ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>612316</td><td></td></tr><tr><td>Ismatec 泵用 Tygon 三通管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td>内径：&amp;nbsp;1.85 mm</td></tr><tr><td>Ismatec REGLO 四通道泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>78001-78</td><td></td></tr><tr><td>Ismatec 管路卡盒</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-78016-98</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷 99.9%，250 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>2231929</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂 Lennox</td><td>Bioshop Canada</td><td>LBL406.500</td><td>无菌检测用琼脂平板</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>DNA酶辅因子</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>咪达唑仑 50 mg/10 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>2242905</td><td></td></tr><tr><td>单极电凝笔</td><td>Valleylab</td><td>E2100</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>N&amp;deg;11 手术刀片</td><td>Swann Morton</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶（源自木瓜乳胶）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>过氧乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269336</td><td></td></tr><tr><td>用于 1/4&quot; 转 1/8&quot; 管内径的塑料带齿接头</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K61</td><td></td></tr><tr><td>塑料带齿管路 90&amp;deg; 弯头连接器</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K76</td><td></td></tr><tr><td>塑料快旋式管路堵头</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td>雄性鲁尔接头</td></tr><tr><td>塑料快旋式管路插座</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td>雌性鲁尔接头</td></tr><tr><td>活检打孔工具</td><td>Integra Miltex</td><td>3332</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾 40 mEq/20 ml</td><td>Hospira Healthcare Corporation</td><td>37869</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘，10%</td><td>Rougier</td><td>833133</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，2mL</td><td>Fisher Science</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>带扣盖密封容器</td><td>SnapLock</td><td>142-3941-4</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>外科金属结扎夹，小型</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Stevens 肌腱剪，115 mm，直型</td><td>B. Braun</td><td>BC004R</td><td></td></tr><tr><td>TruWave 压力监测套件</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX260</td><td></td></tr></tbody></table>

定制灌注生物反应器中猪带血管皮瓣的获取与灌注脱细胞处理

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

大体积软组织缺损可导致功能障碍，并显著影响患者的生活质量。尽管可通过自体游离皮瓣移植或带血管复合组织异体移植（VCA）进行手术重建，但这些方法也存在局限性。供区并发症及可用组织量有限等问题制约了自体游离皮瓣移植的应用，而VCA则受到免疫抑制治疗这一显著限制。在重建外科中，采用脱细胞/再细胞化方法制备的工程化组织代表了一种潜在解决方案。脱细胞组织通过特定方法去除原有细胞成分，同时保留其下方的细胞外基质（ECM）微观结构。这些无细胞支架随后可接种受者特异性细胞，实现再细胞化。
本方案详细描述了在猪模型中获取并进行脱细胞处理以获得无细胞支架的方法。此外，还介绍了灌注生物反应器的设计与组装。所涉及的皮瓣包括猪大网膜、阔筋膜张肌和桡侧前臂皮瓣。脱细胞处理通过灌注方法进行 通过离体实验 在定制的灌注生物反应器中，依次进行低浓度十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤剂灌注、脱氧核糖核酸酶（DNase）酶处理以及过氧乙酸灭菌。
成功的组织脱细胞化在宏观上表现为瓣膜呈现白色不透明外观。组织学染色显示无细胞瓣膜中无细胞核，且DNA含量显著降低。本方案可高效用于制备保留细胞外基质（ECM）和血管微结构的脱细胞软组织支架。此类支架可用于后续的再细胞化研究，并在重建外科的临床转化中具有应用潜力。

该血管化猪皮瓣脱细胞方案依赖于通过定制的灌注生物反应器，将基于离子型的去垢剂SDS经皮瓣血管系统进行灌注。在脱细胞处理前，根据主要供血血管，从猪模型中获取三个血管化的皮瓣并进行插管。获取皮瓣后立即进行冲洗，以维持血管通畅，确保后续脱细胞过程中的有效灌注。采用密封的带扣盖容器，设计了一种定制的生物反应器，使皮瓣可在封闭环境中完成灌注。在生物反应器内，通过连接至组织腔室的两台蠕动泵，实现皮瓣的单程灌注。灌注压力由内置压力传感器实时监测。
在脱细胞过程中，SDS 处理时间取决于所处理组织的类型。采用所述的灌注脱细胞技术，大网膜、阔筋膜张肌和桡动脉前臂皮瓣分别使用 0.05% SDS 脱细胞 2 天、3 天和 5 天。脱细胞后成功灭菌通过以下方式证实：对皮瓣进行拭子取样，并将拭子在琼脂平板上培养 14 天后未观察到微生物菌落生长。在整个脱细胞过程的所有阶段，三种皮瓣在 2 mL/min 的流速下监测灌注压力，压力范围为 20–60 mmHg。脱细胞完成后，在手动控制下对皮瓣进行冲洗，可见血液从留置用于自由引流的静脉套管流出（补充视频 1，补...

该方案描述了通过定制的灌注生物反应器，将十二烷基硫酸钠洗涤剂经皮瓣血管系统灌注，从而对手术获取的带血管猪皮瓣进行脱细胞处理的过程。

大面积软组织缺损可导致功能障碍，并显著影响患者的生活质量。尽管外科重建……

本方法描述了三种带血管的猪皮瓣的手术获取及其后续的灌注脱细胞过程。该方法可为利用组织脱细胞与再细胞化策略再生猪皮瓣的研究提供支持。该技术的主要优势在于其具有良好的通用性，可在结构简单的生物反应器装置中，实现多种带血管猪皮瓣的充分脱细胞。此处所述技术可广泛应用于其他带血管瓣膜，作为重建手术中使用猪瓣膜的一种潜在组织工程解决方案。首先，取约50厘米长的LS16铂涂层硅胶管，制备流入和流出管路。将一端连接至黄色三通泵管，另一端连接无菌2毫升血清移液管，用于将灌注液从洗涤剂储液罐输送至生物反应器腔室。将腔室和管路分别用无菌包装包裹后进行高压灭菌。进行大网膜瓣取材时，将一只12周龄的麻醉约克夏猪置于仰卧位，常规无菌准备腹部。行剑突至脐部的剖腹切口进入腹腔，将胃向上游离，并将大网膜置于手术视野中。从大弯左侧开始，此处胃网膜左动脉与脾动脉相连接，使用直头 Stevens 腱膜剪沿胃网膜左动脉和静脉进行游离。随后分别使用结扎线或结扎夹将其结扎并切断。沿胃大弯从左向右依次结扎并切断由大网膜发出、供应胃大弯的短小血管分支。继续游离大网膜，直至遇到胃网膜右血管与胃十二指肠动脉的汇合处。随后结扎并切断胃网膜右动脉和静脉，以游离网膜瓣，为后续瓣膜插管创造条件。对于阔筋膜张肌瓣的切取，将猪置于侧卧位。从髂前上棘（ASIS）向髌骨外侧标记皮瓣的内侧边界，并向尾侧约8至10厘米处标记后界。使用手术刀在髌骨远端边缘做一锐性切口。逐层加深切口，穿过皮下组织，到达股直肌表面的筋膜，并沿已标记的边界继续向髂前上棘方向延伸切口。仅分离筋膜瓣时，需去除覆盖于其上的皮肤组织，暴露下方的筋膜层。随后结扎或电凝通往皮肤的小穿支血管。回到皮瓣的远端边缘，切开深筋膜。将筋膜从下方的股外侧肌表面游离，向髂前上棘（ASIS）方向牵拉。沿血管蒂向股深动静脉方向追踪，解剖出供应筋膜瓣的旋股外侧动脉及伴行静脉，并将其骨骼化。随后在血管蒂近端、即其汇入股深血管处结扎并切断筋膜瓣的动静脉，以备后续插管操作。进行前臂桡侧皮瓣切取时，在猪的前臂桡侧延长部分标记一个 3 厘米 × 3 厘米的正方形区域。在皮瓣近端边缘中点与肘窝之间画一条线，以标示桡动脉蒂的大致走行。通过触诊确认动脉的走行路径。接下来，使用手术刀在远端切开皮肤，深度达前臂筋膜。用肌腱剪进行钝性分离，直至暴露桡动脉及其伴行静脉。然后使用结扎线或结扎夹结扎并切断动脉和静脉。沿标记皮肤方块的桡侧和尺侧边缘继续进行皮肤切口。然后使用手术刀或电凝设备，从尺侧向桡侧方向分离皮瓣，将其从下方的桡骨表面游离，并向近端肘窝方向掀起皮瓣。使用肌腱剪，在肘窝处近端解剖桡动脉及其伴行静脉，使其骨骼化，此处桡动脉及其伴行静脉分别汇入肱动脉和肱静脉。从周围纤维脂肪组织中解剖出血管，以游离血管蒂。随后分别结扎并切断动脉和静脉，以游离桡动脉前臂皮瓣。接着用20至24号套管针穿刺血管蒂血管，并以3-0丝线固定。将肝素化生理盐水冲注入皮瓣动脉套管，直至观察到清晰的静脉流出液。在超净工作台内操作时，将皮瓣放入生物反应器的组织腔室中。使用无菌肝素化生理盐水预冲流入管路以排除残留空气，并调整皮瓣位置，使皮瓣动脉套管与雄性鲁尔接头相连。然后使用无菌止血钳将动脉套管旋紧在连接器上。接着通过三通阀冲洗肝素化生理盐水，检查鲁尔接头是否无泄漏，并确认灌注液能够流入组织且有静脉流出液出现。关闭组织室盖后，将带有黄色三通泵管的流入管路连接至组织室的流入三通阀。同时，将一个内置压力传感器换能器连接到灌流入口的三通旋塞阀，用于监测灌流压力。接着，打开入口蠕动泵，在初始界面中使用箭头切换至第三个选项卡，将管路内径设置为1.85毫米。然后从第二个选项卡设置灌流速率。输入速率作为输送模式设定为每分钟2毫升。确保屏幕显示的流向正确。将三停泵管路装载到与之匹配的蠕动泵卡匣中。将流出泵的流速设置为每分钟4毫升。使用黄色三通泵管将流出管路连接至组织腔室的流出旋塞。然后将三通泵管装入蠕动泵，并通过按下两台泵上的电源按钮启动两台泵的流动。在组织腔室中使用肝素化生理盐水对皮瓣进行灌注脱细胞，持续15分钟，以清除残留的血凝块。完成后，将残余的生理盐水替换为500毫升十二烷基硫酸钠（SDS）脱细胞溶液，完全浸没皮瓣。接着，将进液管转移至SDS溶液中，对组织进行充分灌注。SDS 脱细胞后，在用 PBS 灌注皮瓣一天之前，吸除残留的 SDS。SDS 灌注脱细胞后，依次将皮瓣在 DNA 酶溶液中灌注两小时，然后在 PBS 中灌注一天，随后将进液管转入含蒸馏水的过氧乙酸和乙醇溶液中，灌注三小时以对皮瓣进行消毒。完成后，无菌取出皮瓣，并将其浸入含 1% 抗生素和抗真菌剂的 PBS 中洗涤两次，每次 15 分钟。将皮瓣储存在 4 摄氏度直至准备进行再细胞化。使用 3 至 10 毫米的打孔活检工具获取组织样本，以评估脱细胞皮瓣。在手动控制下冲洗的脱细胞皮瓣显示出从大网膜、阔筋膜张肌和桡前臂皮瓣的自由引流静脉套管中有流出液的证据。原生大网膜、阔筋膜张肌和桡侧前臂皮瓣的宏观形态在获取后立即呈现粉红色。相比之下，脱细胞组织则表现为特征性的白色或不透明外观。对原生组织进行苏木精和伊红染色的组织学检查显示存在蓝色细胞核。在脱细胞皮瓣中，组织学染色显示细胞成分消失，无蓝色细胞核染色，表明形成了无细胞的组织支架。对DNA含量的进一步定量分析显示，与天然组织相比，无细胞支架中的DNA含量显著减少。最重要的考虑因素是在获取过程中采用的外科技术，需注意避免对皮瓣蒂部造成损伤，以便后续进行灌注脱细胞处理。灌注脱细胞后，可利用特定组织的细胞群体对所得皮瓣进行再细胞化，以再生原有的组织区室。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

在定制灌注生物反应器中获取和灌注-脱细胞猪血管化皮瓣

灌注脱细胞是一种新型技术，可用于制备保留肝脏细胞外基质成分和微结构的全肝支架。本文描述了利用灌注脱细胞法制备全器官支架并随后接种肝细胞的方法。通过该技术可生成具有功能且可移植的肝脏移植物。...

全肝脱细胞与再细胞化

本文描述了一种通过逆行灌注快速且完全去除完整猪心脏中细胞成分的方法。该方法可获得具有部位特异性的心脏细胞外基质支架，具有多种临床应用的潜力。...

通过逆行冠状动脉灌注法对猪心脏进行脱细胞处理的步骤

全器官脱细胞技术可制备天然生物支架，用于再生医学。本文介绍了一种非人灵长类动物肺再生模型，其中完整肺脏在生物反应器中进行全器官脱细胞处理，随后接种成体干细胞和内皮细胞，该生物反应器可支持血管循环和液体培养基通气。...

非人灵长类动物肺脏脱细胞与再细胞化：基于专用大型器官生物反应器的方法

本文介绍一种制备功能性组织工程血管移植物的方案，该移植物可用于小鼠体内移植。该方法通过在脱细胞血管支架生物反应器上共接种部分诱导多能干细胞（PiPSC）来源的平滑肌细胞和PiPSC来源的内皮细胞来实现。...

在小鼠模型中组织工程血管的构建与移植

迄今为止，厚层组织缺损通常通过自体组织瓣或工程化组织进行重建。在本方案中，我们介绍一种新的方法，用于构建带有自体蒂的血管化工程组织瓣，以作为自体组织瓣的替代方案。...

工程化带血管化肌瓣

采用我们专有设备进行大鼠肝脏收获、插管和灌注的技术，可实现复杂的灌注系统，从而改进肝脏脱细胞和再细胞化实验。...

振荡压力灌注装置中大鼠肝脏脱细胞操作步骤

该方法通过基于渗透冲击和离子型去污剂灌注的简单方案，实现对复杂实体器官的脱细胞处理，同时最大程度减少对器官基质的破坏。该技术包含一种新颖的人类心脏脱细胞方法，将心脏置于加压袋内，并对流动动力学和细胞碎片流出进行实时监测。...

在加压袋内以倒置方向对完整人类心脏进行脱细胞处理

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一种可靠的用于血管化复合异体移植生物工程研究的猪筋膜-皮瓣模型

我们描述了大鼠后肢复合体的手术技术及脱细胞处理过程。脱细胞采用低浓度十二烷基硫酸钠通过灌注进行 离体 机器灌注系统...

大鼠后肢的获取与脱细胞化方法 离体 基于灌注的生物反应器用于带血管复合组织异体移植

本方案介绍了新开发的3D打印生物反应器的组装与操作方法 离体 灌注条件下血管的培养。该系统设计易于被其他用户采用，具有实用性、经济性，并可适应不同的实验应用，如基础生物学和药理学研究。...

体外 3D打印生物反应器中大血管的灌注培养

本方案描述了一种基于腹壁下深动脉蒂的人体穿支皮瓣模型的手术切取技术，旨在用于实验研究。...

一种用于研究血管化复合异体移植物和游离皮瓣保存策略的实验性人体DIEP皮瓣模型

学习使用定制灌注生物反应器对猪血管化皮瓣进行外科获取和灌注脱细胞处理的技术。该方法可广泛应用于多种血管化皮瓣，为组织工程和重建手术提供可靠的脱细胞支架制备方案。

定制灌注生物反应器中猪带血管皮瓣的获取与灌注脱细胞处理

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