在定制灌注生物反应器中获取和灌注-脱细胞猪血管化皮瓣
2022年8月1日
该协议描述了通过在定制的灌注生物反应器中通过皮瓣脉管系统灌注十二烷基硫酸钠洗涤剂来手术获取和随后的血管化猪皮瓣的脱细胞。
该方法描述了三个血管化猪瓣的手术获取及其随后的灌注脱细胞。该方法可以帮助使用组织去细胞化和再细胞化方法再生猪瓣。该技术的主要优点是其多功能性，可以在易于组装的生物反应器设置中实现各种血管化猪瓣的大量脱细胞。
这里描述的技术可以广泛应用于其他血管化皮瓣，作为在重建手术中使用猪皮瓣的潜在组织工程解决方案。首先，通过测量大约 50 厘米的 LS16 铂涂层硅胶管来制作流入和流出管。将一端连接到黄色 3 停止泵管，另一端连接到无菌 2 毫升血清移液管，以将灌注液从洗涤剂储液槽输送到生物反应器室中。
将腔室和管道高压灭菌在单独包装的无菌包装中。对于网膜瓣获取，将一头 12 周龄麻醉的约克夏猪置于仰卧位，然后以通常的无菌方式准备腹部。进行剑脐剖腹进入腹部并活动胃头，并将网膜放入手术区域。
从大曲率的左侧开始，左胃表皮动脉与脾动脉连接，使用直史蒂文斯肌腱切开剪刀将左胃表皮动脉和静脉骨骼化。然后用手术扎带或夹子分别结扎和分割两者。沿着胃的较大曲率从左到右进行，结扎并分开从网膜产生的短血管分支，提供胃的更大曲率。
继续动员大网膜，直到遇到右胃表皮血管和胃十二指肠动脉的交界处。然后结扎并分割右胃表皮动脉和静脉，以释放网膜瓣，并在以后进行皮瓣插管。对于张筋膜张张肌皮瓣的获取，将猪置于侧卧位。
标记从髂前上棘 （ASIS） 到髌骨外侧的内皮瓣边界，以及尾部约 8-10 厘米的后边界。使用手术刀在髌骨远端边缘做一个锋利的切口。通过皮下组织加深切口以到达股直肌上方的筋膜，并沿着标记的边界继续切口朝向ASIS。
要单独隔离筋膜瓣，请从下面的筋膜层中去除覆盖的皮肤成分。然后将小穿支血管结扎或烧灼到皮肤上。返回皮瓣远端边界，切开深筋膜。
将筋膜从下面的股外侧肌向 ASIS 移动。将椎弓根追踪到股深部血管后，将股骨外侧回旋动脉和供应筋膜瓣的静脉骨骼化。然后结扎并分开近端的皮瓣血管，在那里它们连接深股血管并允许以后插管。
对于桡向前臂皮瓣采购，在伸展的猪前臂的桡骨上标记一个 3 x 3 厘米的正方形。在近端皮瓣边缘的中点和肘前窝之间画一条线，以表示桡动脉蒂的大致病程。通过触诊确认动脉病程。
接下来，使用手术刀在远端切开皮肤，深度可达臂前筋膜。用肌腱切开剪刀钝性解剖，直到遇到桡动脉远端及其静脉。然后用手术绑带或夹子结扎并分割动脉和静脉。
继续在标记的皮肤方块的桡骨和尺骨边缘进行皮肤切口。然后用手术刀片或烧灼将皮瓣从下面的桡骨上移开，从尺骨向桡骨方向延伸，同时将皮瓣向肘前窝近端抬起。使用肌腱切开剪刀，将桡动脉和静脉在肘前窝近端骨骼化，分别在那里它们连接肱动脉和静脉。
从周围的纤维脂肪组织中解剖血管以分离血管蒂。然后分别结扎和分割动脉和静脉，以释放桡骨前臂皮瓣。接下来，用 20 至 24 号血管导管插管，血管用 3-0 丝带固定。
将肝素化盐水冲洗至皮瓣动脉插管中，直到观察到清晰的静脉流出。在层流生物安全柜中工作时，将襟翼放入生物反应器组织室中。带有无菌肝素化盐水的灌注管，以去除残留空气并布置瓣，以允许皮瓣动脉套管和公鲁尔连接器之间的连接。
然后使用无菌止血器将动脉插管拧到连接器上。然后通过旋塞阀冲洗肝素化的盐水，以检查鲁尔连接是否没有泄漏，并且翻转器是否可以注入静脉流出的证据。关闭组织室盖后，将带有黄色 3 停止泵管的流入管连接到组织室的流入旋塞阀。
此外，将在线压力传感器传感器连接到流入的 3 通旋塞阀上，以进行灌注压力监测。接下来，打开流入蠕动泵，在初始屏幕上，使用箭头移动到第三个选项卡，将管道 ID 设置为 1.85 毫米。然后从第二个选项卡设置灌注速率。
作为输送方式的输入速率设置为每分钟 2 毫升。确保屏幕上显示的流向正确。使用兼容的盒式磁带将三止泵管装入蠕动泵。
将流出泵设置设置为每分钟 4 毫升的速率。用黄色的3停止泵管将流出管连接到组织室的流出旋塞阀。然后将三停泵管装入蠕动泵，并通过按下每个泵上的电源按钮开始两个泵的流量。
在组织室中开始用肝素化盐水对皮瓣进行灌注脱细胞15分钟，以去除任何残留的血栓。完成后，用500毫升十二烷基硫酸钠或SDS脱细胞溶液替换残留的盐水以浸没皮瓣。接下来，将流入管转移到SDS溶液中并大量组织。
SDS 去细胞化后，吸出剩余的 SDS，然后用 PBS 灌注皮瓣一天。SDS灌注脱细胞后，依次在DNA溶液中灌注瓣两个小时，然后在PBS中灌注一天，然后将流入管转移到蒸馏水中的过氧乙酸和乙醇中，通过灌注三个小时对皮瓣进行灭菌。完成后，无菌取下皮瓣，并将它们浸入两次含有 1% 抗生素抗真菌剂的 PBS 洗涤液中，每次 15 分钟。
将翻盖储存在 4 摄氏度，直到准备好重新细胞化。使用 3 至 10 毫米打孔活检工具获取组织样本以评估脱细胞皮瓣。在手动控制下冲洗的分离脱细胞皮瓣显示有证据显示网膜、阔筋膜张肌和桡骨前臂皮瓣的自由引流静脉插管流出的证据。
自体网膜、阔筋膜张肌和桡骨前臂皮瓣的总体形态在采购后立即呈现粉红色。相比之下，去细胞化组织的特征是白色或不透明的外观。用苏木精和伊红对天然组织的组织学检查显示存在蓝色细胞核。
在脱细胞皮瓣中，组织学染色显示细胞物质丢失而没有蓝色核染色，表明无细胞组织支架。DNA含量的额外定量显示，与天然组织相比，无细胞支架中的DNA显着减少。最重要的考虑因素是在采购期间使用的手术技术，注意避免损坏皮瓣，以便随后进行灌注脱细胞。
灌注脱细胞后，所得的皮瓣可以用组织特异性细胞群重新细胞化，以便再生天然组织区室。
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概述
本方法描述了血管化猪皮瓣的外科采集及其随后的灌注脱细胞化。该技术可以广泛应用于其他血管化皮瓣，作为重建手术中的潜在组织工程解决方案。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 重建手术
- 脱细胞化技术
背景
- 血管化猪皮瓣用于重建手术。
- 脱细胞化是一种从组织中去除细胞成分的方法。
- 该技术允许组织再生。
- 自定义生物反应器设置可以促进灌注过程。
研究目的
- 描述脱细胞化血管化猪皮瓣的方法。
- 增强组织工程方法的多功能性。
- 为生物反应器提供简单的组装方法。
使用的方法
- 血管化猪皮瓣的外科采集。
- 通过皮瓣血管灌注十二烷基硫酸钠洗涤剂。
- 使用定制的灌注生物反应器。
- 组装用于灌注液输送的进出流管。
主要结果
- 该方法成功地脱细胞化血管化猪皮瓣。
- 在各种皮瓣类型中展示了多功能性。
- 为研究人员提供了一个简单的生物反应器设置。
- 在重建手术的组织工程中的潜在应用。
结论
- 该技术为组织脱细胞化提供了一种可靠的方法。
- 可以适应不同类型的血管化皮瓣。
- 该方法支持组织工程的未来研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Perfusion-decellularization of porcine vascularized flaps in a customized bioreactor enables the generation of acellular scaffolds with preserved extracellular matrix and vascular microarchitecture. This capability addresses a critical bottleneck in tissue engineering for reconstructive applications, supporting translational research and future recellularization studies. The method enhances predictive confidence in scaffold quality and supports risk-adjusted advancement in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of tissue engineering hypotheses using large animal models.
- Supports biological de-risking by preserving native ECM and vascular structures.
- Facilitates functional validation of decellularization protocols for translational use.
Screening & Assay Development
- Provides standardized acellular scaffolds for downstream recellularization and functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of decellularization efficiency.
- Prepares validated biological matrices for scalable tissue engineering workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold properties with disease-relevant reconstructive models.
- Enables continuity from scaffold generation to preclinical recellularization studies.
- Supports risk-adjusted decisions for advancing engineered tissues toward clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the regenerative medicine continuum from scaffold generation to preclinical recellularization and functional validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on ECM preservation and vascular integrity post-decellularization.
- Screening: Delivers reproducible, acellular matrices for comparative recellularization studies.
- Analytics: Enables quantitative DNA content measurement and histological assessment of scaffold quality.
- Translational Research: Bridges scaffold production with preclinical evaluation in large animal models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable bioreactor platform adaptable to various tissue types and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold suitability for tissue engineering.
- Operational Value: Standardizes decellularization and bioreactor workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for advancing engineered tissues in the R&D pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering programs for reconstructive applications.
Implementation Considerations
- Requires surgical expertise for vascularized flap procurement and cannulation.
- Needs access to sterile bioreactor systems and perfusion instrumentation.
- Demands cross-team standardization of decellularization protocols and quality metrics.
- Adaptable to multiple porcine flap types but dependent on careful pedicle preservation.
- Limitations include the need for rigorous histological and DNA quantification to confirm decellularization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:57
Perfusion Bioreactor Fabrication
1:29
Procurement of Porcine Flaps
5:51
Setup of the Decellularization System
7:39
Decellularization of Porcine Flaps and Evaluation of Decellularization
9:06
Results: Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps
10:16
Conclusion
