使用 离体 灌注生物反应器进行大鼠后肢的获取和去细胞化血管化复合同种异体移植

我们已经建立了一个用于肢体去细胞化的小动物模型。这对于促进血管化复合组织的去细胞化和再细胞化的概念验证研究很有用。免疫抑制方案是血管化复合同种异体移植的主要局限性之一。

使用去细胞化可以降低组织免疫原性。首先，使用10号手术刀片沿着腹股沟韧带进行皮肤切口，从外侧移动到内侧，同时用Adson镊子固定周围的皮肤。当下面的脂肪暴露出来时，用钝性解剖仔细解剖脂肪，并定位上腹部血管。

使用微型剪刀，解剖近端，并在腹股沟韧带水平暴露下面的股神经、动脉和静脉。在解剖显微镜下，识别股血管，并使用细镊子解剖近端动脉和静脉，以从动脉网络的分叉点获得足够的长度。然后，使用 6-0 缝合线分别结扎股静脉和动脉。

接下来，在不破坏结扎的股血管的情况下，在后肢的其余部分进行圆周解剖，并使用骨切割器将股骨横断中段。为了完全隔离后肢，使用微型剪刀横断结扎的远端结扎的股骨血管，并在夹层显微镜下使用24号血管导管插管股动脉。然后，用肝素化盐水冲洗，直到观察到股静脉明显流出。

通过将一条缝合线绑在空心血管周围的另一条缝合线中，固定套管，确保套管靠近，以防止阻塞分叉点。之后，浸没获得的后肢和PBS，直到去细胞化。要构建生物反应器，请放置灭菌室，并在入口、出口和补充管路处拧上三个一次性三通旋塞阀，确保补给口的旋塞阀在其其余两个端口处盖上以防止泄漏。

将先前制造的硅胶管连接到入口和出口管路的旋塞阀上。然后，将蠕动管连接到硅胶管。将暗盒固定在蠕动管上后，将其放在蠕动泵上。

接下来，从上述步骤将其中一个硅胶管连接到出口管的蠕动管末端。在另一端，连接一毫升血清移液器，并将末端与血清移液器连接在废储液瓶中。接下来，将连接到血清移液管的管端悬挂到洗涤剂储液槽中，并立即用封口膜密封洗涤剂储液器烧瓶的开口。

将0.25%SDS从一升玻璃罐中加入生物反应器室的中途水平。然后，使用Adson Shorts取出采购的后肢，并小心地将其悬挂到生物反应器室中。使用两对爱信钳，将后肢的空心部分引导至入口线，同时用一对镊子握住套管。

使用另一对镊子扭转并将入口管固定到套管上。固定后，根据需要从一升玻璃罐中添加更多 0.25% SDS 以完全浸没肢体，确保出口也浸没在生物反应器储液器中，并保持一致的流出。然后，将一次性注射器过滤器连接到生物反应器室盖子上的通风口，并将盖子固定在生物反应器上，确保腔室从四面八方密封。

要从管道中去除空气并灌注回路，请使用新的一次性 10 毫升注射器使用入口管路处的三通旋塞阀从洗涤剂储液器中抽取洗涤剂。抽出后，使用相同的流体插入出口管路处的三通旋塞阀中。接下来，按下并将带有管道的盒式磁带固定到蠕动泵中。

然后，使用电源按钮打开蠕动泵。在蠕动泵屏幕上，使用箭头键进入第二个选项卡，以输入流速为输送方式设置第一个通道的灌注速率，并将灌注速率设置为每分钟1毫升，确保根据设备设置正确流动方向。校准蠕动泵，以确保通过入口管路输送的流体量和/或从出口管路输送的流体量在两者之间一致流动，确保管道ID设置为1.85毫米。

通过机器灌注开始脱细胞，通过按键盘上的电源按钮，以每分钟一毫升的速度对入口和出口管路进行脱细胞。监控并确保入口和出口管路的流量持续不断。使用1升0.25%STS，根据需要通过补充端口补充生物反应器储液器。

然后，寻找组织的白色半透明外观，这将在第五天出现，表明大鼠后肢的去细胞化。确认脱细胞后，用PBS和1%抗生素 - 抗真菌剂储液器替换洗涤剂储液器，并用封口膜密封烧瓶的开口。以每分钟一毫升的速度开始PBS和1%抗生素 - 抗真菌药灌注，并持续两天。

用200毫升0.1%寄生酸，4%乙醇储液罐替换PBS和1%抗生素 - 抗真菌剂储液器，并以每分钟1毫升的速度开始灌注，持续两小时。在生物安全柜下，使用两对无菌 Adson 镊子断开后肢与入口线的连接，一对镊子扭曲入口线，另一对镊子握住套管，确保套管不被拉动以防止脱节。将肢体储存在装有PBS和1%抗生素 - 抗真菌剂的500毫升玻璃罐中，温度为4摄氏度，直到进一步使用。

去细胞化的股动脉和静脉都显示出所有层和周围结缔组织的核含量损失，因为天然血管中缺乏蓝色染色的细胞核。股静脉和动脉的内膜介质和外膜维持在脱细胞血管中。股神经显示组织结构保存，包括神经内膜。

骨显示出整体结构保留，骨细胞染色核丢失，脱细胞后从周围的内膜和骨膜层丢失。皮肤显示表皮和真皮细胞丢失。真皮显示保留的胶原纤维类似于天然皮肤组织。

最后，骨骼肌的横视图显示位于肌内膜外围的细胞核丢失。肌原纤维含量在脱细胞后保留在各自的分册内。还使用PicoGreen进行了DNA定量，其中股血管，神经，皮肤，肌肉和骨骼的DNA含量显着降低。

按照该方案，可以进一步表征脱细胞肢体。这涉及使用组织学和生化方法检查细胞外基质，以及使用成像评估血管。脱细胞化的茎也可以使用组织特异性细胞进行再细胞化。