Name: 一种用于研究冰和包合物水合物结晶的微流控方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解微流控方法研究冰和包合物水合物结晶过程，利用PDMS装置实现可控液体交换。该技术可实时观察抗冻蛋白与晶体表面的不可逆结合动态，为晶体生长机制研究提供精确实验平台。

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感谢美国化学学会石油研究基金的捐赠者对本研究提供的支持（资助编号 60191-UNI5）。作者感谢Ido Braslavsky教授在利用微流控装置研究抗冻蛋白和冰方面的开创性工作。作者感谢Arthur DeVries教授、Konrad Meister教授和Peter Davies教授提供抗冻蛋白样品。

1. 微流控装置的制备
<ol>
	<li>用铝箔覆盖培养皿的内表面，并将预先制备好的模具放入培养皿中。
	<ol>
		<li>使用参考文献中描述的光刻技术制备模具。本研究中使用的两种装置设计如图1所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过称量固化剂与弹性体按1:10（质量比）的混合物（见材料表），持续搅拌约5分钟，制备30–40 mL的PDMS混合液，直至混合液呈现白色且几乎不透明。 
	注意：将塑料杯放在电子天平上，先倒入弹性体，再加入固化剂，以获得1:10的质量比。</li>
	<li>将PDMS混合液倒入含有模具的培养皿中，在真空干燥器中脱气，直至无气泡残留（约30分钟）。</li>
	<li>将含有液态PDMS的模具置于烘箱或加热板上，在70 °C下加热，直至形成类似橡胶的质地。此过程大约需要1小时。</li>
	<li>使用解剖刀沿模具特征轮廓切割器件，注意推动解剖刀时应向前推进而非向下按压，因为模具较为脆弱。取出切割好的PDMS器件，并将其倒置放入新的培养皿中。通过粘贴并撕去一段胶带（见材料表），清除其底面的灰尘和杂质颗粒。</li>
	<li>使用钝头注射针（20 G）根据模具压印的图案在器件上打孔，必要时可借助显微镜操作。确保孔穿透器件另一侧，并使用镊子移除被冲出的PDMS碎片。</li>
	<li>用清水和肥皂彻底清洗盖玻片（18 × 18 mm，厚度0.14 mm），然后用异丙醇清洗。使用压缩空气吹干已清洗的盖玻片。</li>
	<li>将清洁后的PDMS器件和盖玻片放入等离子清洗机中，关闭阀门，开启电源、真空泵和抽气泵。让等离子清洗机运行约1分钟，将射频（RF）调至高（HI）档，然后使用微调阀缓慢通入少量空气。
	<ol>
		<li>当观察窗颜色由紫色变为粉红色时，继续让等离子清洗机工作50秒，随后关闭射频。保持抽气泵运行1分钟，关闭泵后，缓慢打开主阀门，使空气逐渐进入等离子清洗机。 
		注意：另一种可获得类似效果的方法是热键合。该方法中，将模具放置在盖玻片上，并将其置于设定为70–80 °C的加热板上，持续约60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PDMS表面压合到清洁的盖玻片上，轻微上提盖玻片以确认两者是否牢固键合，若无分离现象则表明键合成功。</li>
	<li>使用钳子固定90°钝头针（18 G）的针体，用力拔除塑料注射器连接头。将针的一端插入Tygon管（内径0.020&#34;，外径0.060&#34;，见材料表），另一端插入器件上的一个打孔中。对其他孔重复此操作。</li>
	<li>为去除气泡，使用玻璃注射器向通道中注入水或缓冲液（可选使用泵，但本实验未使用泵）。所有液体在注入器件前均需经0.22 µm滤膜过滤。</li>
	<li>使用封闭剂（如1% BSA溶液）防止荧光标记的AFP非特异性结合到PDMS通道壁上。将封闭剂注入入口通道，并使其在微通道中孵育20分钟。随后注入缓冲液冲洗入口通道，以去除残留的BSA溶液。 
	注意：最终制得的PDMS器件底部已键合盖玻片，入口和出口孔连接了导管，且通道内已涂覆封闭剂。</li>
</ol>
2. 设置微流控装置
<ol>
	<li>在铜制冷台表面（参见材料表）滴加少量浸油，并使用无尘布均匀涂抹，形成一层薄油膜。随后，将一片洁净的蓝宝石圆片（参见材料表）放置在油膜上。在蓝宝石圆片中心滴加一滴浸油，然后将PDMS装置置于液滴上，使装置的微结构对准冷台的观察孔。</li>
	<li>固定装置位置，并使用胶带将管路固定在容纳冷台的铝盒外壁上。记录每根特定管路的位置。</li>
	<li>使用玻璃注射器向进样通道注入4–5 µL的抗冻（糖）蛋白[AF(G)P]溶液（参见材料表）。关闭冷台盖板。 
	&#8203;注意：AFP溶液的浓度可根据其荧光强度进行调整和确定。在本实验方案中，浓度范围为5–40 µL。</li>
</ol>
3. 微流控通道中单晶的形成
<ol>
	<li>用干燥空气或氮气吹扫冷台，以防止冷台内部产生冷凝。启动循环冷却浴，使水流经冷台，作为散热装置。</li>
	<li>启动温度控制程序，并将温度设定为 -25 °C。 
	注意：当样品温度降至约 -20 °C 时，样品将开始冻结，表现为样品突然变暗并表面粗糙化。此时可使用任意物镜观察，建议使用 4x 物镜，以便观察微流控通道的完整区域。</li>
	<li>缓慢升温，升温速率约为 1 °C/5 s，接近样品的熔点（根据所用 AF(G)P 溶液中的缓冲液不同，熔点范围为 -1 至 -0.2 °C）。当温度接近熔点时，等待少数单晶形成并分离。 
	注意：如有需要，可使用固定在显微镜上的红外激光器（980 nm）（参见材料表）局部熔化不需要的冰晶。激光开启期间会持续熔化附近的冰晶。</li>
	<li>此时建议切换至 10x 或 20x 物镜，以便更清晰地观察单个晶体。在目标位置获得单晶后，通过略微降低温度（约 0.01 °C）使晶体生长，直至晶体边缘接触通道壁。</li>
	<li>切换至 50x 物镜，将 AF(G)P 溶液注入通道，观察荧光强度增加，表明蛋白溶液已成功注入通道。此步骤需谨慎操作，避免在溶液交换过程中导致冰晶熔化。在溶液交换过程中，需密切监控并调节流速（通过调节玻璃注射器施加的压力大小）和温度。</li>
	<li>给予足够时间使蛋白质在晶体表面富集并结合。 
	&#8203;注意：所需时间取决于 AF(G)P 的富集与吸附速率5,25。在典型实验中，通常给予 5–10 分钟用于 AFP 的富集。</li>
</ol>
4. 热滞（TH）活性测定
注意：此步骤为可选步骤。
<ol>
	<li>通过以0.002 °C的微小步长调节温度，并观察小晶体在不熔化的情况下所能承受的最高温度，确定晶体的熔点。</li>
	<li>在温度控制器的RAMP功能中，将冷却速率设置为-0.05至-0.01 °C/4 s，并启动RAMP程序。记录晶体突然开始生长时的精确温度。 
	&#8203;注意：该值称为爆发温度，对应于冻结温度。熔点与冻结温度之间的差值即为TH活性25。</li>
</ol>
5. 单晶周围溶液交换
<ol>
	<li>确保样品温度处于热滞（TH）间隙范围内，以防止实验过程中晶体熔化或生长。</li>
	<li>使用 NIS Elements 成像程序（见材料表）记录溶液交换过程，用于后续荧光数据分析。缓慢将缓冲液注入微流控装置的第二个入口，并观察荧光信号的下降，其下降速率取决于施加在注射器上的压力。
	<ol>
		<li>利用此可视化结果确保所施加的压力不过高，以免导致晶体熔化。溶液交换过程的图像序列参见图2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用成像程序测量微流控通道中的荧光强度。 
	注意：信号应在晶体表面附近区域达到峰值，表明抗冻蛋白（AFP）结合；而在已被缓冲液冲洗的周围溶液中，信号应相对较低。</li>
	<li>在完成步骤4的溶液交换后，测定热滞（TH）活性。</li>
	<li>通过分离一个新的晶体重复实验（步骤3.3–3.5）。使用玻璃注射器注入抗冻蛋白（AFP）溶液，并重复溶液交换过程（步骤5.1–5.3）。获取另一个单晶（步骤3.3–3.5），并通过玻璃注射器将AFP溶液引入通道中。</li>
</ol>
6. 笼形水合物实验
<ol>
	<li>为获得四氢呋喃（THF）水合物，需配制摩尔比为1:15的THF/水溶液，即体积比为1:3.326。在后续所有实验中使用的溶液（包括含有AF(G)P或其他抑制剂的溶液）均应保持该比例。</li>
	<li>按照步骤1和2制备微流控装置，并将其置于低温载物台上。将温度设为-25 °C；如步骤3.2所述，样品将在约-20 °C时冻结。</li>
	<li>待THF溶液完全冻结后，缓慢升高温度，直至所有冰完全融化。 
	注意：THF会使冰的熔点略微降低。</li>
	<li>为确保仅冰晶体完全融化而水合物保留，将温度维持在1 °C持续3分钟。</li>
	<li>将温度设为-2 °C，观察在无抑制剂条件下微流控通道中形成的水合物数量。 
	注意：THF水合物呈八面体形（图2），在某些情况下晶体非常薄，因此清晰观察可能存在困难。若出现此情况，建议重复步骤6.4–6.5以获得新的晶体。</li>
	<li>使用玻璃注射器将AF(G)P/抑制剂注入微流控通道，同时调节温度以确保已形成的晶体不发生融化或生长。静置数分钟，使抑制剂分子充分吸附于晶体表面。</li>
	<li>如需测定，可按照步骤4测量热滞后（TH）活性。</li>
	<li>按照步骤5.2–5.3所述方法更换晶体周围的溶液。</li>
</ol>

<ol><li>Bar Dolev, M., Braslavsky, I., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ice-Binding+Proteins+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ice-Binding Proteins and Their Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 515-542 (2016).</li>
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</ol>

本实验方案旨在结合微流控流动与显微晶体，以揭示晶体生长及其抑制过程的新机制。通过使用具有毫开尔文分辨率的温控冷台27，可精确控制位于微流控通道内的单个显微晶体，并实现其周围溶液的更换。尽管微流控装置的制备属于常规操作，且与常见方法类似17,18，但对该装置内晶体生长与熔化的控制则具有独特性和新颖性。该系统中最关键的部分是卓越的温度控制，其通过使用帕尔贴热电制冷器、紧邻样品位置的热敏电阻提供的反馈信号，以及调控反馈回路的高分辨率温度控制器共同实现。
另一个关键步骤是溶液交换过程本身，因为在该过程中晶体可能会熔化或生长；因此，必须在溶液交换期间调节温度，以防止晶体生长或熔化。微流控通道中晶体的形成会干扰液体流动，这是该系统面临的主要挑战；因此，必须控制这些晶体的生长。在此，将一个红外激光器（980 nm）安装在倒置显微镜上，用于局部熔化不需要的冰/水合物晶体28。如果无法使用此类激光器，可通过额外的帕尔贴热电制冷器加热微流控装置的金属连接件，从而熔化装置入口/出口处的冰。
本文所述方法涉及自行研制的仪器（冷台），且需要经过培训，因为上述部分步骤具有挑战性。由于即使在无主动流动的情况下，晶体周围溶液的浓度仍可能发生改变，因此一个简单的校准步骤5可根据荧光信号提供浓度的可靠估计。另一种可能的解决方案是使用微流控阀门，以应对非预期流动（例如在热滞测量期间），该方法在参考文献4中有详细描述。
该系统还被用于研究 D2O 冰在 H2O 液体中的生长行为，该项研究揭示了一种微观的、扇形冰表面的新现象27。因此，微流控技术可用于研究多种对温度变化响应良好的晶体系统。

抗冻蛋白（AFPs）和抗冻糖蛋白（AFGPs）可保护多种适应寒冷环境的生物体免受霜冻损伤1。AFPs 和 AFGPs（统称为 AF(G)Ps）通过不可逆地结合到冰晶表面，利用吉布斯-汤姆森效应抑制冰晶的进一步生长2,3,4,5。由于熔点基本保持不变，而新的冻结点被降低，两者之间形成的温差称为热滞效应（TH），是反映 AFP 活性的可测量参数6。利用 AFPs 抑制冰晶生长具有广泛而多样的应用前景，可在低温保存、冷冻食品品质提升以及抗寒作物保护等领域发挥潜在作用。
在低温高压条件下，水与小分子有机物共同存在时会发生结晶，形成笼形水合物（或称气体水合物），其中最常见的是甲烷水合物7。甲烷水合物在油气输送管道中结晶可能造成堵塞，进而因气体&#160;点燃而引发爆炸8,9,10。目前防止管道中水合物结晶的主要方法包括使用热力学抑制剂（如醇类和二醇类）和动力学抑制剂（主要是聚合物）11,12,13,14。研究还发现，抗冻蛋白（AFPs）能够结合于笼形水合物晶体并抑制其生长，这表明AFPs有望用于阻止堵塞物的形成，从而提供一种更环保的解决方案15。
微流控技术是一种常用的方法，用于研究在极小样品体积（低至飞升级，fL）下流经微通道网络的流体特性16。这些微通道的结构是通过光刻技术在硅片（模具）上构建特定图案而形成的17。聚二甲基硅氧烷（PDMS）是制造微流控装置时广泛使用的一种材料，因其成本低廉且在科研实验室中操作相对简便。微结构（通道）的设计根据装置的具体用途而定，因此该技术可应用于多种领域，包括DNA检测18、医学诊断19以及结晶过程3,20,21。
本实验方案描述了一种独特的微流控方法，可用于在多种抑制剂（包括抗冻蛋白AFP和抗冻糖蛋白AFGP）存在下培养微米级冰晶和水合物晶体。在这些实验中，采用四氢呋喃（THF）水合物模拟甲烷气体水合物的性质22，后者需要专用设备来控制压力和温度23。使用荧光标记的AF(G)Ps来可视化并分析这些蛋白质在晶体表面的吸附行为，结合荧光成像技术，微流控方法能够获取这些分子与晶体表面结合过程的关键特征。

<table><tbody><tr><td>0.22 微米滤膜</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>90度弯头钝针</td><td></td><td></td><td>18 Gauge</td></tr><tr><td>抗冻蛋白和抗冻糖蛋白</td><td>赠品</td><td></td><td>参见参考文献5和28</td></tr><tr><td>钝针</td><td></td><td></td><td>18 Gauge 和 20 Gauge</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷台</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Globe Scientific</td><td></td><td>18 × 18 mm，厚度 0.14 mm</td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>980 nm 红外激光器</td><td>Opto Engine LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜，Eclipse Ti - S</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>Staples</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无尘擦拭纸</td><td>Kimwipes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Newport 3040 温度控制器</td><td>Newport</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 成像软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>油封真空泵</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（Dow Corning Sylgard 184 硅橡胶套件）</td><td>Dow Corning Syglard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>沙黄O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255-25G</td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石圆盘</td><td>Ted Pella Inc</td><td>16005-1010</td><td>&amp;nbsp;直径 25.4 mm，厚度 0.3 mm</td></tr><tr><td>sCMOS 相机，Neo 5.5</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃（THF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-100ML</td><td></td></tr><tr><td>用于微流控装置的Tygon微孔管</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>&amp;nbsp;内径 0.020&quot;，外径 0.060&quot;，每卷 100 英尺</td></tr><tr><td>用于水循环和氮气的Tygon管</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>内径 1/8&amp;rdquo;，外径 3/16&amp;rdquo;</td></tr></tbody></table>

一种用于研究冰和笼形水合物结晶的微流控方法

A Microfluidic Approach for the Study of Ice and Clathrate Hydrate Crystallization

对水结晶过程进行准确的机理描述具有挑战性，需要几个关键要素：优异的温度控制以实现单个微观晶体的形成，以及与低温载台耦合的合适显微系统。本文所述方法增加了一个重要功能，即能够在冰和笼形水合物晶体周围进行溶液交换。该系统结合了独特的自主研发仪器，包括微流控装置、高分辨率低温载台和荧光显微镜。该低温载台专为微流控设备设计，可在微流控通道内形成微米级的冰/水合物晶体，并实现晶体周围溶液的更换。低温载台的温度分辨率为1毫开尔文（millikelvin），温度稳定性极高，这对于控制这些微小晶体的生长至关重要。该多功能系统用于研究冰和水合物结晶的不同过程，以及抑制这些晶体生长的机制。本实验方案详细描述了如何制备微流控装置，如何在微流控通道中生长并控制微观晶体，以及如何利用液体在冰/水合物晶体周围的流动来深入理解水的结晶过程。

冰晶溶液交换 
图3展示了围绕冰晶进行的溶液交换过程。每张图像的时间戳表明，该溶液交换过程相对较快；然而，也可实现较慢的交换。溶液交换完成后，可清晰观察到吸附在冰表面的抗冻糖蛋白（AFGP）分子产生的荧光强度（图3，右侧）。通过指定的兴趣区域（ROI）工具对冰表面抗冻蛋白（AFP）浓度进行定量分析（图4）。在本实验4中，使用的是溶于50 mM Tris-HCl（pH 7.8）和100 mM NaCl中的AFP III型（QAE异构体）。围绕一个双锥形冰晶进行溶液交换，并监测溶液中及冰表面的荧光强度。在溶液交换过程中，代表溶液中荧光信号的红色曲线下降了约100倍，而冰表面的计算信号（绿色曲线）则保持恒定。冰表面吸附分子的计算信号是通过从冰的总信号中减去来自溶液的信号（乘以一个与微流控通道厚度相关的常数）得到的4。
THF水合物的溶液交换 
THF水合物的微流控实验操作方式与冰的实验类似。在让水合物晶体从溶液中吸附抑制剂分子后，将不含抑制剂的溶液注入微流控通道。图5展示了两种不同类型抑制剂存在下进行溶液交换后的THF水合物：一种是用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的AFGP1-5（图5A）；另一种是荧光染料藏红O（见材料表）26（图5B）。这是首次展示AFGP结合到笼形水合物表面的现象。
<img alt="晶体生长室示意图；入口、出口；微流控设计，实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：本研究中所用微流控通道的示意图。 两种设计均包含两个入口和一个出口。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质晶体的显微镜图像；用于晶体学分析和结构研究的实验图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：在温度降至约 -2 °C 后，四氢呋喃水合物在微流控通道中形成。 所示所有晶体的形态均为四面体；然而，部分晶体的取向不同。比例尺 = 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微流控装置中AFP浓度随时间变化的荧光成像，实验系列。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：微流控通道中单个冰晶周围溶液交换的代表性实验。 初始溶液中含有用FITC标记的AFGP1-5 ，未观察到冰吸附的AFGP。当溶液更换为不含AFGP的溶液后，先前吸附在冰表面的蛋白质被清晰检测到（右侧图像）。比例尺 = 25 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜结果；三八面体样品分析；随时间变化的强度图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图4：冰表面AFP浓度的定性与定量分析。（A）高浓度AFP溶液中的冰晶（溶液交换前）。（B）同一冰晶在将AFP溶液置换为不含AFP的缓冲液后的状态。比例尺 = 20 µm。（C）溶液交换过程中冰表面（黑色）和溶液中（红色）荧光强度的定量分析。绿色曲线表示计算得到的冰表面强度。该图经参考文献4许可改编。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig04largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，晶体结构；绿色和红色发射分析，光学研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64072/64072fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5： 在微流控通道中，周围溶液被置换后形成的单个 THF 水合物晶体，置换前溶液为（A，AFGP1-5）或（B， 藏红O）。图（B）转载自参考文献26。比例尺 = 25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64072/64072fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了在微流控装置中结晶微观冰晶和笼形水合物的方法，可实现晶体形成后周围液体的交换。这为研究抑制剂的结晶过程及其结合机制提供了前所未有的可能性。

准确描述水结晶的机理具有挑战性，需要几个关键要素：优异的温度控制，以实现……

该方案的独特之处在于，它使用户能够研究、观察并测量可溶性分子与晶体表面之间的相互作用。利用此方法已获得抗冻蛋白与冰不可逆结合的有力证据。该技术的主要优势在于能够控制微米尺度冰晶和水合物晶体的生长，并以可控方式更换其周围的溶液。首先，将预先制备好的模具放入一个用铝箔覆盖的玻璃培养皿中。然后，通过称量固化剂与弹性体按1:10比例混合，持续搅拌约五分钟，制备30至40毫升的PDMS混合物，直至混合物呈现白色且几乎不透明。接下来，将PDMS混合物倒入装有模具的培养皿中，并在真空干燥器中脱气，直至无气泡残留。将含有液态PDMS的模具在70摄氏度的烘箱或加热板上加热，直至形成类似橡胶的质地。然后用手术刀沿器件轮廓切割，注意推动手术刀时应向前推进而非向下按压，因为模具较为脆弱。取出切割好的PDMS器件后，将其倒置放入一个新的培养皿中。使用钝头注射器和20号针头，根据印制的图案在装置上打孔。然后将清洗后的PDMS和盖玻片放入等离子清洗仪中。关闭阀门，打开电源、真空泵和抽气泵。让等离子清洗机运行约一分钟。将射频（RF）调至高功率，并通过微调阀门让少量空气进入等离子清洗机。当观察窗颜色由紫色变为粉红色时，继续让等离子清洗机工作50秒，然后关闭射频。保持泵运行一分钟，关闭后逐渐打开主阀，使空气进入等离子清洗仪。然后将PDMS表面按压到已清洁的盖玻片上，并通过轻轻上提盖玻片观察是否发生分离，以确认两者已牢固键合。用镊子固定90度钝头针的针头后，将针的一端插入Tygon管，另一端插入装置中打好的一个孔中，并对其他孔重复此操作。在铜制冷台表面滴加少量浸油，使用无绒布擦拭，形成一层薄油膜。接着，将洁净的蓝宝石圆片放置在油膜上。然后，在蓝宝石圆片中心滴加一滴浸油，将PDMS装置置于液滴上，使装置的结构特征对准冷台观察孔的位置。固定装置位置后，将管路固定在容纳胶带的铝盒外壁上。使用玻璃注射器向入口通道注入四到五微升的抗冻蛋白溶液，并关闭冷台盖子。启动温度控制程序，将温度设定为零下25摄氏度。然后以大约每五秒升高1°C的速度缓慢升温。接近样品的熔点，该熔点范围可能在-1至-0.2°C之间，具体取决于抗冻蛋白溶液中所用的缓冲液。为了更好地观察单个晶体，切换至10倍或20倍物镜。在目标位置获得单晶后，通过略微降低温度使晶体生长，直至晶体两端接触到微流控通道的壁。切换至50倍物镜后，将抗冻蛋白溶液注入通道，观察荧光强度的增加，表明蛋白溶液已成功注入通道。为记录溶液交换过程，使用NIS-Elements成像程序，确保施加的压力不过高，并缓慢将缓冲液注入微流控装置的第二个入口。观察荧光信号的下降，其下降速率取决于施加在注射器上的压力。在制备摩尔比为1:15的四氢呋喃（THF）水溶液后，将该溶液注入微流控装置中。待THF水溶液冻结后，缓慢升高温度，直至除水合物外的所有冰完全融化，并在1°C下保持三分钟。将温度设定为零下二摄氏度，观察在无抑制剂条件下微流控通道中形成的水合物数量。然后使用玻璃注射器将抗冻蛋白或抑制剂注入微流控通道，同时调节温度以确保已形成的晶体不会熔化或继续生长，并静置数分钟，使抑制剂分子吸附至晶体表面。通过向通道内注入不含抑制剂的溶液，进行溶液置换。在溶液交换前后拍摄晶体的图像，并使用成像程序分析晶体及溶液中的荧光强度。已成功完成围绕冰晶的溶液交换，表明溶液交换速度相对较快。然而，较慢的交换也是可行的。在交换完成后，可清晰观察到冰上吸附的抗冻糖蛋白分子发出的荧光强度。通过定量分析监测了抗冻蛋白的浓度，并测定了溶液和冰上的荧光强度，结果表明溶液中的荧光信号在溶液交换过程中降低了100倍，而冰表面计算得到的荧光信号则保持不变。还进行了四氢呋喃（THF）水合物的微流控实验，在允许水合物晶体吸附抑制剂分子后，将不含抑制剂的溶液注入通道中。在使用两种抑制剂（包括用异硫氰酸荧光素标记的抗冻糖蛋白和荧光染料藏红O）进行溶液置换后，观察到了四氢呋喃水合物。该方法的关键步骤是在微流控通道中形成并分离单个晶体，以及对晶体周围的溶液进行置换。此方法也可用于其他对温度高度敏感的晶体材料，以期阐明抑制剂与这些晶体相互作用的机制。在晶体周围进行溶液交换的能力，使研究人员得以揭示抗冻蛋白结合机制的关键信息，并发现同位素效应对冰晶生长的新现象。

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科研

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Chemistry

化学

一种用于研究冰和包合物水合物结晶的微流控方法

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由LabVIEW控制的新型纳升渗透压仪用于冰结合蛋白研究

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