一种用于研究冰和包合物水合物结晶的微流控方法

该协议是独一无二的，因为它允许用户研究，检查和测量可溶性分子与晶体表面之间的相互作用。防冻蛋白与冰的不可逆结合或使用这种方法获得的有力证据。该技术的主要优点是能够控制微米尺寸的冰和水合物晶体的生长，并以受控方式交换它们周围的溶液。

首先，将预先准备好的模具放入覆盖有铝箔的玻璃培养皿中。然后通过称取1至10的固化剂和弹性体混合物并连续混合约五分钟，直到混合物呈现白色且几乎不透明，制备30至40毫升PDMS混合物。接下来，将PDMS混合物倒入带有模具的培养皿中，并在干燥器中脱气，直到没有气泡残留。

用液体PDMS在烤箱或70摄氏度的热板上烘烤模具，直到获得类似橡胶的稠度。然后用手术刀在特征周围描摹设备，注意用手术刀向前推而不是向下推，因为模具很脆弱。取出切口PDMS装置后，将其倒置放在新的培养皿中。

使用钝器，20号针头，根据印记图案在设备上打孔。然后将清洁的PDMS和盖玻片插入等离子清洁剂。关闭阀门并打开电源、真空和泵。

让等离子清洁器运行约一分钟。将RF设置为高，并使用精细阀允许一些空气进入等离子清洁器。当观察窗颜色从紫色变为粉红色时，让等离子清洁器工作 50 秒以关闭射频。

保持泵打开一分钟，关闭后，逐渐打开主阀，让空气进入等离子清洁器。然后将PDMS表面压在清洁的盖玻片上，并在盖玻片上稍微向上拉时观察到没有脱落，以确认它们已粘合。用一把钳子固定90度钝针的针后，将针的一端插入Tygon管中，另一端插入设备的一个打孔，同时对其他孔重复该过程。

在铜冷台表面涂抹少量浸油，然后用不起毛的擦拭将其涂抹，以形成一层薄薄的油。接下来，将干净的蓝宝石圆盘放在创建的油层上。然后将一滴浸油涂在蓝宝石圆盘的中心，并将PDMS器件定位在液滴上，使器件的特征在冷载物台的观察孔上对齐。

将设备固定到位后，将管子固定到装有胶带的铝盒的外壁上。使用玻璃注射器，将四至五微升防冻蛋白溶液注入入口通道并关闭冷台的盖子。启动温度控制程序，将温度设置为零下25摄氏度。

然后每五秒缓慢升高温度约一摄氏度。接近样品熔点，其范围从零下1到零下0.2摄氏度，具体取决于防冻蛋白溶液中使用的缓冲液。为了更好地观察单晶，请切换到10倍或20倍物镜。

并且在所需位置获得单晶后，通过略微降低温度来生长晶体，直到晶体的末端与通道壁相遇。切换到50倍物镜后，将防冻蛋白溶液注入通道并观察荧光强度增加，表明蛋白质溶液已成功注入通道。要记录溶液交换过程，请使用NIS-Elements成像程序，确保施加的压力不会太高，并将缓冲溶液缓慢注入微流体装置的第二个入口。

观察荧光信号的减少，其速率取决于施加到注射器的压力。为了在制备摩尔比为1至15的THF水溶液后获得THF水合物，请将溶液注入微流体装置中。THF水溶液冷冻后，缓慢升高温度，直到所有冰在排除水合物的情况下融化，并将温度保持在一摄氏度三分钟。

将温度设置为零下两摄氏度，并在没有抑制剂的情况下观察微流体通道中出现的水合物丰度。然后使用玻璃注射器将防冻蛋白或抑制剂注入微流体通道，同时调节温度，以确保获得的晶体不会熔化或生长，并允许抑制剂分子吸附几分钟到晶体表面。通过将无抑制剂溶液注入通道来进行溶液交换。

在溶液交换前后拍摄晶体图像，并使用成像程序分析晶体和溶液中的荧光强度。在冰晶周围进行了成功的溶液交换，表明溶液交换相对较快。但是，交换速度较慢是可能的。

交换完成后，清楚地观察到来自冰吸附的防冻糖蛋白分子的荧光强度。监测防冻蛋白浓度的定量分析，测定溶液和冰上的荧光强度，表明溶液中的荧光信号在溶液交换过程中降低了100倍，而计算出的冰表面信号保持不变。使用THF水合物进行微流体实验，在允许水合物晶体吸附抑制剂分子后，将无抑制剂溶液注入通道中。

在与两种类型的抑制剂进行溶液交换后观察到THF水合物，包括用异硫氰酸荧光素标记的防冻糖蛋白和荧光染料Safranin O。该过程的关键步骤是在微流体通道中形成和分离单晶以及在其周围交换溶液。该方法可以与其他对温度高度敏感的晶体材料一起使用，以了解抑制剂与这些晶体相互作用的机制。

围绕晶体交换溶液的能力为研究人员确定防冻蛋白结合机制的关键见解铺平了道路，并发现了同位素对冰生长的影响的新现象。