Name: 内皮细胞转吞测定作为 体外 模型评估内部血-视网膜屏障通透性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学习使用人视网膜微血管内皮细胞进行内皮细胞转吞测定，评估内部血-视网膜屏障通透性。该方法无需活体动物，可研究血管屏障完整性的分子调控机制。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 EY028100、EY024963 和 EY031765），资助对象为 JC。ZW 获骑士圣殿眼科基金会职业启动奖资助。

所有动物实验均经波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，用于获取光学显微镜和电镜图像（图3）。实验方案 体内 研究可参见 Wang 等人。24所有涉及人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的实验均经波士顿儿童医院机构生物安全委员会（IBC）批准。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>组织培养皿包被液的配制：将1 mL明胶储备液（40%-50%）溶解于500 mL无菌组织培养级1×PBS（pH = 7.4）中，配制成0.1%明胶溶液。使用0.22 µm滤膜过滤该溶液。将0.1%明胶溶液储存于2-8°C。在无菌条件下，该溶液可在上述温度下长期保存。</li>
	<li>生长培养基：根据生产商说明书（材料表），将EGM添加剂溶解于内皮细胞生长基础培养基（EBM）中，配制500 mL内皮细胞完全生长培养基（EGM）。将生长培养基分装至50 mL离心管中，于4 °C保存。生长培养基在4 °C下的保质期为12个月。</li>
	<li>胰蛋白酶溶液：将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液从原装瓶中分装至50 mL离心管中，于4 °C保存（最多2周）或−20 °C保存（最多24个月）。</li>
</ol>
2. HRMEC 的培养
<ol>
	<li>初始细胞培养
	<ol>
		<li>在超净工作台中，用5 mL 0.1%明胶溶液对细胞培养皿（直径100 mm，高20 mm）进行包被，并在室温（RT）下静置30分钟，以确保均匀包被。 
		注意：培养皿的明胶包被可增强细胞贴附。也可使用预先包被明胶的T75培养瓶。</li>
		<li>在接种细胞前，使用真空泵吸除明胶溶液。所用吸液器的真空压力最高可达724 mmHg。 
		注意：吸除操作必须在接种细胞前立即进行，以防止包被液干燥。</li>
		<li>将冻存于液氮中的HRMECs冻存管在37 °C水浴中或通过向冻存管中加入预热的生长培养基进行解冻。解冻后，将细胞悬液转移至9 mL生长培养基中（假设HRMECs冻存液体积为1 mL）。 
		注意：HRMECs为商业来源（材料表）。加入细胞的生长培养基在使用前应始终预热至37 °C。</li>
		<li>在室温下以200 × g 离心5分钟，小心吸除上清液，避免移除细胞沉淀。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于10 mL生长培养基中，并将所得悬液转移至明胶包被的培养皿中。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。通常情况下，HRMECs在72小时后达到70%-80%汇合度。 
		注意：每间隔一天更换一次生长培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在可渗透膜插件上对HRMECs进行传代培养
	<ol>
		<li>在超净工作台中，通过向每个插件（顶侧室）加入200 µL 0.1%明胶溶液并孵育30分钟，对细胞培养滤膜插件（6.5 mm插件，孔径0.4 µm的聚碳酸酯膜，置于24孔板中）进行包被，以准备接种HRMECs。确保溶液覆盖滤膜插件的整个底面。 
		注意：每个孔由多孔膜分隔为顶侧室和基底外侧室。</li>
		<li>从培养箱中取出培养有HRMECs的培养皿（步骤2.1.5），吸除生长培养基。在超净工作台中用10 mL 1× PBS轻轻冲洗细胞2次，以去除可能存在的漂浮细胞或死细胞。</li>
		<li>用0.5–1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，并将培养皿置于培养箱（37 °C，5% CO2）&#160;中孵育5分钟。</li>
		<li>加入4.5–9 mL生长培养基以终止胰蛋白酶活性，并使用10 mL移液器将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在室温下以200 × g 离心5分钟，小心去除上清液，并将细胞沉淀重悬于3 mL生长培养基中。</li>
		<li>使用手动血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞，并以每滤膜插件4 × 104个细胞的密度接种（即1.25 × 105 个细胞/cm2）。每个插件的细胞悬液体积为250 µL。</li>
		<li>吸除含有可渗透插件的孔中的包被液，每插件（顶侧室）加入250 µL细胞悬液。向其中一个插件仅加入培养基（不含细胞），作为跨上皮电阻（TEER）测量的&#34;空白对照&#34;。同时，向每个孔的基底外侧室加入750 µL培养基。</li>
		<li>将含有可渗透插件的24孔板置于培养箱（37 °C，5% CO2）中培养7–12天，直至培养的细胞完全汇合，并达到约20 Ω·cm2的目标TEER值。</li>
		<li>每间隔一天更换一次生长培养基。在更换培养基时，小心吸除旧培养基，以尽量减少对细胞单层的扰动，并分别向顶侧室和基底外侧室每孔加入250 µL和750 µL新鲜培养基。 
		&#8203;注意：24孔板中每个孔的顶侧室和基底外侧室均需更换生长培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. TEER 测量（图 4）
<ol>
	<li>在细胞接种后第14天（步骤2.2.9），使用上皮细胞伏特-欧姆计（EVOM）电阻系统（材料表）测量HRMEC的跨上皮电阻（TEER），方法如下。</li>
	<li>预先启动电阻系统，并使用STX04测试电极检查仪表功能。如有需要，进行校准。</li>
	<li>将电极连接至仪表，通过先将其浸泡于70%乙醇中15–20分钟，随后短暂浸入细胞培养EGM生长培养基中，以平衡电极。</li>
	<li>同时，将含细胞的24孔板置于超净台中室温（RT）下静置15–20分钟，以达到温度平衡。 
	注意：TEER测量结果受温度影响，因此平衡步骤至关重要。</li>
	<li>进行TEER测量时，在孔板的顶端室（250 µL）和基底外侧室（750 µL）均加入新鲜生长培养基。</li>
	<li>小心地将电极浸入，使较短的一端插入小室中，较长的一端接触孔底，以进行TEER测量。首先测量空白对照组的电阻。对每个小室，均需进行三次重复测量。 
	注意：每次测量之间，使用培养基冲洗电极。确保电极与小室底部保持90°垂直，以获得稳定的读数。</li>
	<li>使用以下公式计算单层细胞的电阻值（单位：Ω·cm2）：TEER = 净电阻（Ω）× 小室滤膜表面积（cm2）；其中，净电阻为各孔（含细胞的培养基）电阻与空白孔（仅含培养基）电阻之差。</li>
	<li>只有当TEER值达到约20 Ω·cm2后，方可进行后续细胞处理。若未达到目标TEER值，将培养板继续置于培养箱中，并于次日再次测量TEER。 
	&#8203;注意：HRMEC的汇合度还可通过显微镜下观察细胞形态（典型的鹅卵石样形态）和/或通过免疫组织化学染色检测细胞连接蛋白的存在进行验证。</li>
</ol>
4. 跨细胞转运实验
<ol>
	<li>网格蛋白介导的 体外 使用Cy3标记的转铁蛋白进行跨细胞转运实验图5)
	<ol>
		<li>当达到汇合状态且跨上皮电阻值约为 20 Ω·cm 时2，于37 °C、5% CO₂条件下对细胞进行24小时血清饥饿处理2 在加入配体处理前，两个腔室均使用含0.5% FBS的EBM（低血清培养基）（顶端腔室：250 µL，基底外侧腔室：750 µL）。整个实验过程中均使用低血清EBM。</li>
		<li>将细胞（使用步骤4.1.1中的减血清培养基）与荧光标记（花青素3）的转铁蛋白配体（Cy3-Tf）（终浓度为40 µg/mL）在37 °C下于顶室孵育60分钟。 
		注意：含有Cy3-Tf的培养板应避光保存，以防止Cy3-Tf发生光漂白，可用铝箔包裹，并在关闭光源的细胞培养超净台内进行实验。</li>
		<li>孵育1小时后，将培养板置于冰上，用血清减量培养基在室温下从顶端和基底外侧分别洗涤单层细胞4次（每次3-5分钟），以去除游离的未结合Cy3-Tf。 
		注意：洗涤步骤至关重要，可去除游离的示踪分子，从而在无细胞旁路通透干扰的情况下准确检测转胞吞作用。</li>
		<li>向已彻底清洗并含有细胞的滤膜插入物中加入新鲜的低血清培养基（同步骤4.1.1），然后将插入物转移至含有预热低血清培养基的24孔板的新孔中。</li>
		<li>将细胞在培养箱中（37 °C 和 5% CO₂）再孵育 90 分钟2），然后从基底外侧室收集培养基。</li>
		<li>使用荧光检测器记录基底外侧室溶液的荧光强度。以相对荧光单位（RFU）测得的荧光强度水平，表示通过网格蛋白依赖性转胞吞作用跨过HRMEC单层细胞的Cy3-Tf复合物的量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小窝蛋白介导的 体外 使用HRP的转胞吞作用检测图6)
	<ol>
		<li>达到完全汇合且跨上皮电阻值约为 20 Ω·cm 时2，于37 °C、5% CO₂条件下对细胞进行24小时血清饥饿处理2 使用含0.5% FBS的EBM培养基（低血清培养基）进行处理前孵育（如步骤4.1.1所述）。整个实验过程中均使用低血清EBM培养基。</li>
		<li>在顶端室中用所需的处理物和溶剂对照处理细胞。 
		注意：此处我们以Wnt信号通路调节剂为例，展示Wnt信号通路在HRMECs中对小窝介导的转胞吞作用的调控，所用试剂为：人重组Norrin和Wnt抑制剂XAV939。在典型实验中，细胞在培养箱中（37 °C、5% CO₂）处理24小时。2）处理，处理条件如下：Norrin（125 ng/mL）、Norrin（125 ng/mL）+ XAV939（10 µM）以及溶剂对照溶液。此外，还使用了Wnt3a条件培养基（由L Wnt-3A细胞产生）。</li>
		<li>在37 °C条件下，将细胞与HRP（5 mg/mL）在顶室中孵育15分钟。</li>
		<li>随后，将24孔板置于冰上，用P缓冲液（10 mM HEPES pH = 7.4，1 mM丙酮酸钠，10 mM葡萄糖，3 mM CaCl₂）对顶端和基底外侧腔室进行充分清洗，共6次。2，145 mM NaCl）以去除游离的胞外HRP。 
		注意：洗涤步骤至关重要，可去除游离的示踪分子，从而在无细胞旁路通透干扰的情况下准确检测转胞吞作用。</li>
		<li>向顶端室加入新鲜的减血清培养基（同步骤4.1.1），并将插入式培养小室转移至含有预热培养基的新培养孔中。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂的培养箱中将单层细胞再孵育90分钟2 在从基底外侧室收集培养基之前。</li>
		<li>向收集的培养基中加入 100 µL HRP 荧光过氧化物酶底物（材料表按照制造商说明书操作，室温孵育10分钟，然后加入100 µL终止液以终止反应。</li>
		<li>使用荧光酶标仪检测培养基中HRP底物反应产物的水平。在325 nm激发波长、420 nm发射波长下测定荧光强度，以相对荧光单位（RFU）表示。该数值反映通过小窝介导的转胞吞作用跨过HRMEC层的HRP水平。 
		注意：此处使用的荧光产物（材料表不会发生光漂白，无需采取避光措施以防止光漂白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突或经济利益需要披露。

血-视网膜屏障（BRB）在视网膜健康与疾病中发挥着至关重要的作用。体外血管通透性评估技术已被证明是研究屏障（BRB/血脑屏障）发育与功能的关键工具。本文所述方法可用于研究内皮细胞转胞吞作用的分子机制，或评估影响BRB通透性的相关分子调节因子。体外内皮细胞转胞吞检测相较于体内检测或血管通透性评估技术具有多项优势：操作快速、通量高，可用于分析多种不同变量或特定信号通路中孤立分子的作用，且可结合基因和药物手段进行调控。纯内皮细胞培养体系消除了体内实验中常见的个体动物差异，同时限制了其他细胞类型对目标分子可能产生的修饰或内吞作用32。HRMEC细胞的培养操作简便，仅需大多数实验室常见的基础细胞培养设备，且在成本上通常优于体内动物实验。尽管体外转胞吞检测无法完全模拟体内生理条件33，但它们仍可作为有价值的工具，补充体内研究，推动我们对BRB调控机制的理解。
<p class="jove_content"...

人视网膜是体内能量需求最高的组织之一。神经视网膜的正常功能需要充足的氧气和营养供应，同时限制其他潜在有害分子的进入，以保护视网膜微环境，这一过程由血-视网膜屏障（BRB）介导1。与中枢神经系统中的血-脑屏障（BBB）类似，BRB在眼部起到选择性屏障的作用，调控离子、水、氨基酸和糖类在视网膜内外的转运。BRB还通过阻止免疫细胞、抗体和有害病原体等循环因子的进入，维持视网膜的稳态及其免疫豁免状态2。BRB功能障碍参与多种血管性眼病的病理生理过程，如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性（AMD）、早产儿视网膜病变（ROP）、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎，导致血管源性水肿及继发性视力丧失3,4,5。
血-视网膜屏障（BRB）由两个独立的屏障组成，分别对应于两个不同的ocular血管网络：视网膜血管系统和位于视网膜下方的有孔毛细血管——脉络膜毛细血管。内层BRB（iBRB）主要由视网膜微血管内皮细胞（RMECs）构成，这些细胞排列在视网膜微血管内壁，为视网膜内层神经元提供营养。另一方面，视网膜色素上皮细胞构成了外层BRB的主要部分，位于神经感觉性视网膜与脉络膜毛细血管之间2。对于iBRB而言，分子在RMECs之间的跨膜转运通过细胞旁路（paracellular）和跨细胞途径（transcellular）两种方式进行（图1）。iBRB对物质的高度选择性依赖于以下两个因素：（i）存在连接蛋白复合物，限制相邻内皮细胞（ECs）之间的细胞旁转运；（ii）内皮细胞中胞膜穴样凹（caveolae）介导分子、转运蛋白和受体的表达水平较低，从而维持较低的跨细胞转运速率1,6,7,8。调控细胞旁通量的连接复合物包括紧密连接（claudins、occludins）、粘附连接（VE-cadherins）和间隙连接（connexins），允许水和小分子水溶性化合物通过。小分子脂溶性物质可被动扩散穿过RMECs细胞内部，而较大分子的脂溶性和亲水性物质的转运则由ATP驱动的跨内皮途径调控，包括囊泡转运和膜转运蛋白介导的转运5,9。
囊泡转胞吞作用可分为由小窝蛋白介导的小窝转胞吞作用、网格蛋白依赖性（及受体介导的）转胞吞作用以及网格蛋白非依赖性的巨胞饮作用（图2）。这些囊泡运输过程涉及不同大小的囊泡，其中巨胞饮体最大（直径范围为200–500 nm），小窝最小（平均为50–100 nm），而网格蛋白包被囊泡的直径介于70–150 nm之间10。小窝是烧瓶状富含脂质的质膜内陷结构，其表面包被主要由小窝蛋白-1构成的蛋白层；小窝蛋白-1通过其小窝蛋白支架结构域结合脂质膜中的胆固醇以及其他结构蛋白和信号蛋白11。小窝蛋白与外周结合的Cavin蛋白协同作用，促进小窝在质膜上的稳定12。小窝膜还可携带多种分子的受体，如胰岛素、白蛋白以及循环脂蛋白（包括高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）），以协助这些物质穿过内皮细胞13。在发育过程中，血-视网膜屏障（BRB）功能的形成依赖于对内皮细胞转胞吞作用的抑制8。因此，在生理条件下，成熟的视网膜内皮细胞中小窝、小窝蛋白-1以及白蛋白受体的表达水平相对较低，与其他内皮细胞相比，这一特性有助于其屏障功能的维持4,9。
由于内层血-视网膜屏障（iBRB）破坏是多种病理性眼病的重要特征，因此开发评估视网膜血管通透性的方法至关重要。 体内 和 体外这些方法有助于深入了解血-视网膜屏障完整性受损的可能机制，并评估潜在治疗靶点的有效性。目前 体内 成像或定量血管渗漏检测通常采用荧光示踪剂（荧光素钠和葡聚糖）、比色示踪剂（伊文思蓝染料和辣根过氧化物酶[HRP]底物）或放射性示踪剂14 通过显微成像或分离的视网膜组织裂解液检测血管系统向周围视网膜组织的渗漏。理想的血管完整性示踪剂应具有惰性，且分子足够大，可在受损血管中自由通透，而在健康完整的毛细血管中则被限制在内。目前广泛采用的方法包括在活体眼底荧光素血管造影（FFA）或分离的视网膜平铺标本中使用荧光素钠或异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）来定量视网膜渗漏。 体内或离体FITC-葡聚糖具有可提供4-70 kDa不同分子量的优势，适用于尺寸选择性研究15,16,17FITC-白蛋白（约68 kDa）是用于血管渗漏研究的另一种具有生物学相关性的大分子蛋白质示踪剂18经心内注射的伊文思蓝染料19，经眼后静脉或尾静脉20，也依赖于其与内源性白蛋白结合形成大分子，该大分子主要可通过分光光度法检测，较少情况下可通过平铺样本的荧光显微镜检测20,21然而，这些定量或光学成像方法通常无法区分细胞旁运输与跨内皮运输。为了特异性分析转胞吞作用并以超微结构可视化观察转胞吞囊泡，通常使用辣根过氧化物酶（HRP）等示踪分子，以定位内皮细胞内可通过透射电子显微镜观察到的转胞吞囊泡。22,23,24 (图 3A-C).
发展与使用 体外 iBRB 模型可用于评估内皮细胞通透性，能够提供可靠且高通量的评价方法，以作为补充 体内 实验有助于研究血管渗漏的分子调控机制。常用于评估紧密连接的旁细胞运输和完整性的检测方法包括跨内皮电阻（TEER），即对离子电导率的测量图4)2,25，以及 体外 使用小分子量荧光示踪剂的血管渗漏检测26此外，基于转铁蛋白的跨细胞转运实验模型被用于研究依赖网格蛋白的跨细胞转运27尽管如此，用于评估血-视网膜屏障（BRB）以及更特异性地评估视网膜内皮细胞小窝介导的转胞吞作用的检测方法 体外 有限。
本研究中，我们描述了一种利用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）进行的内皮细胞转胞吞实验 体外 用于评估iBRB通透性及内皮细胞转胞吞作用的模型。该实验基于HRMECs通过受体介导或小窝蛋白依赖的转胞吞途径分别转运转铁蛋白或HRP的能力（图2）。将HRMEC培养至顶室（即滤膜小室）完全汇合后，加入荧光标记的转铁蛋白（Cy3-Tf）或辣根过氧化物酶（HRP），以检测经内皮细胞转胞吞作用单独转运至底室的转铁蛋白或HRP对应的荧光强度。细胞单层的汇合程度可通过测量经上皮/内皮电阻（TEER）来确认，以反映紧密连接的完整性25为了演示TEER和转胞吞实验技术，使用了已知的血管通透性和内皮细胞转胞吞作用的分子调节剂，包括血管内皮生长因子（VEGF）。28 以及Wnt信号通路中的成分（Wnt配体：Wnt3a和Norrin）29.

<table><tbody><tr><td>生物安全柜&amp;nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿&amp;nbsp;</td><td>Nest Biotechnology</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>Corning Inc.</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>氰基3-人转铁蛋白&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞基础培养基-2（EBM-2）</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）SingleQuots 添加剂</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell 电阻测量系统-2（ERS-2）</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（双计数室）</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）</td><td>Cell Systems</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L细胞（用于对照条件培养基）</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A细胞（用于Wnt3A条件培养基）</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（1×）</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu 荧光过氧化物酶底物试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>重组人Norrin蛋白（rhNorrin）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>重组人血管内皮生长因子（rhVEGF）</td><td>R&amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器（0.22 &amp;micro;m）</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室（6.5 mm Transwell，0.4 &amp;micro;m 孔径聚酯膜插入物）</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）（1×）</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939（Wnt/&amp;beta;-catenin 抑制剂）</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

内皮细胞转吞作用检测方法作为一种 体外 评估内层血-视网膜屏障通透性的模型

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

血-视网膜屏障（BRB）功能障碍是多种血管性眼病病理生理过程中的重要因素，常导致视网膜水肿及继而发生的视力丧失。内层血-视网膜屏障（iBRB）主要由视网膜血管内皮构成，在生理条件下具有低通透性的特征。这种低通透性特征受到严格调控并得以维持，主要依赖于相邻视网膜微血管内皮细胞间极低的旁细胞转运率以及通过细胞本身的跨细胞转运（胞吞转运）过程。对视网膜跨细胞屏障通透性的评估，可能为理解健康与疾病状态下iBRB的完整性提供基础性见解。在本研究中，我们描述了一种内皮细胞（EC）胞吞转运检测方法，作为一种 体外 用于评估内层血-视网膜屏障（iBRB）通透性的模型，采用人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）。该检测方法分别评估HRMECs通过受体介导和小窝蛋白介导的跨细胞转运过程运输转铁蛋白和辣根过氧化物酶（HRP）的能力。将完全汇合的HRMECs培养于多孔膜上，分别与荧光标记的转铁蛋白（网格蛋白依赖性胞转作用）或HRP（小窝蛋白介导的胞转作用）共孵育，测定转移至下室的转铁蛋白或HRP水平，以反映内皮细胞单层中的胞转水平。通过调控已知调节iBRB的Wnt信号通路，验证基于小窝蛋白介导的HRP胞转检测方法。本文所述的内皮细胞胞转检测方法可为研究血管病理状态下内皮细胞通透性及iBRB完整性的分子调控机制，以及药物递送系统的筛选提供有力工具。

关键词：内层血-视网膜屏障，iBRB，人视网膜微血管内皮细胞，HRMECs，转铁蛋白，辣根过氧化物酶，HRP，胞转作用，小窝蛋白介导的胞转，网格蛋白依赖性胞转，Wnt信号通路，内皮细胞通透性，药物递送系统

视网膜血管内皮细胞的透射电镜图像显示内皮细胞中存在穿胞囊泡运输及小窝样囊泡 体内. 
EC 跨细胞转运可被可视化 体内 在光学显微镜下，视网膜横切面中可见深棕色沉淀物，代表含辣根过氧化物酶（HRP）的血管图3A）以及作为含有HRP的穿胞小泡的电子致密沉淀物（图3B, C）使用透射电子显微镜（TEM）观察，从而证明内皮细胞通过iBRB的转胞吞作用。较大的囊泡可能反映巨胞饮作用（白色箭头； 图3B），小囊泡可能代表小凹小泡（白色箭头； 图3C）。此外，在荧光显微镜下可观察到小窝在视网膜血管中的定位，表现为小窝标志物CAV-1抗体与血管内皮标志物异凝集素（EC marker）在血管中的共染色...

本方案演示了一种 体外 内皮细胞转胞吞实验作为一种模型，通过检测人视网膜微血管内皮细胞在小窝介导的跨细胞转运过程中跨细胞运输辣根过氧化物酶的能力，评估内层血-视网膜屏障的通透性。

血-视网膜屏障（BRB）功能障碍参与多种血管性眼病的病理生理过程，常导致视网膜水肿和……

本方案提供了一种基于细胞的实用模型，用于研究选择性血管屏障（如血-视网膜屏障或血-脑屏障）的功能与通透性，特别聚焦于内皮细胞转胞吞作用。该检测方法易于建立和操作，无需使用活体动物。可用于研究影响内血-视网膜屏障完整性的多种内皮细胞通透性和转胞吞作用的分子调控因子。该实验可为血管生物学以及眼科学和脑科学研究提供重要见解，有助于深入理解血-视网膜屏障（BRB）和血脑屏障（BBB）调控的分子机制，并探索药物穿越这些屏障的潜在递送途径。首先，在超净工作台中，用200微升0.1%明胶溶液对细胞培养小室滤膜进行包被，室温孵育30分钟，以制备用于接种人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）的细胞培养滤插片。确保溶液完全覆盖滤插片的整个底面。取一个在37摄氏度和5%二氧化碳条件下培养的人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）培养皿，吸除培养基。在超净工作台中用10毫升1×PBS轻柔冲洗细胞两次，以去除可能存在的悬浮细胞或死细胞。用0.5至1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，并将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育5分钟。加入 4.5 至 9 毫升培养基以终止胰蛋白酶活性，并使用 10 毫升移液管将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 3 毫升培养基中。使用手动血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞数量进行计数，并以每孔滤膜插件40,000个细胞的密度接种。每个插件的细胞悬液体积为250微升。吸除含有可渗透插件的孔中的包被液，然后向每个插件中转移250微升细胞悬液，仅向其中一个插件加入培养基，该插件将用作跨内皮电阻（TEER）测量的空白对照。同时，在每个基底外侧室中加入 750 微升培养基。将含有可渗透性插件的 24 孔板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中培养 7 至 12 天，直至培养的细胞完全融合，并达到约 20 欧姆·平方厘米的目标 TEER 值。在进行 TEER 测量前，将含有细胞的 24 孔板置于室温下的层流罩中 15 至 20 分钟，以平衡温度。使用上皮细胞伏特/欧姆计电阻力系统测量HRMEC的TEER时，先将电极连接至仪器，然后通过将电极在70%乙醇中浸泡15至20分钟，再短暂浸入细胞培养EGM生长培养基中进行平衡。进行TEER测量时，小心地将电极浸入，使较短的探头位于小室（insert）内，较长的探头接触孔板底部。首先测量空白对照的电阻，然后对每个小室进行三次重复测量TEER。当细胞达到汇合状态且跨上皮电阻（TEER）值约为 20 欧姆·平方厘米时，在添加配体前，于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下，使用含 0.5% FBS 的 EBM 培养基在上下室中对细胞进行 24 小时的无血清培养。整个实验过程中均使用减血清的 EBM 培养基。在 37 摄氏度下，用含荧光氰胺-3 标记转铁蛋白配体的减血清培养基孵育上室中的细胞 60 分钟。用无血清培养基在顶端和基底外侧对单层细胞冲洗4次后，向含有细胞的滤插中加入新鲜培养基，并将滤插转移至含有预热无血清培养基的24孔板的新孔中。将细胞在培养箱中继续孵育90分钟，随后收集基底外侧室中的培养基。使用荧光检测仪记录基底外侧室溶液的荧光强度。当细胞达到汇合状态且经皮电阻值（TEER）约为20 Ω·cm²时，在37°C、5% CO₂条件下，使用含0.5% FBS的EBM培养基对两个腔室中的细胞进行24小时的血清饥饿处理，然后再进行配体处理。整个实验过程中均使用低血清EBM培养基。随后，对顶侧腔室中的细胞施加所需的处理因素及相应的溶剂对照。向细胞中加入终浓度为 5 毫克/毫升的辣根过氧化物酶（HRP），在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。向顶端室中加入新鲜的低血清培养基，并将插入物转移至含有预热培养基的新培养孔中。将单层细胞在培养箱中继续孵育额外 90 分钟。从基底外侧室收集培养基后，向收集的培养基中加入 100 µL HRP 荧光过氧化物酶底物，在室温下孵育 10 分钟。加入 100 µL 终止液终止反应，并使用荧光酶标仪检测培养基中 HRP 底物反应产物的水平。在演示体外转胞吞实验之前，首先展示视网膜内皮细胞转胞吞作用的可视化图像，作为背景信息。此处的光学显微镜图像显示了经DAB染色的3月龄野生型小鼠视网膜切片中充满HRP的血管腔。HRP通过眶后注射进入体内。在光学显微镜下，充满HRP的视网膜血管呈现为深棕色沉淀物。透射电子显微镜超薄切片显示，HRP标记的穿胞运输血管中，视网膜微血管内皮细胞（RMECs）表现出跨越内层血-视网膜屏障的内皮细胞穿胞作用。图中较大的囊泡可能为巨胞饮体，管腔侧可见红细胞。透射电镜图像显示RMEC内含有HRP标记的小型穿胞囊泡，可能为小窝囊泡。CAV-1 抗体与凝集素 B4 的免疫组织化学染色显示了 CAV-1（小窝小泡的标志物）在 3 月龄野生型小鼠视网膜血管中的定位。此处展示的是视网膜内皮细胞中免疫金标记 CAV-1 的透射电子显微镜图像，以及 CAV-1 阳性小窝小泡的放大图像。在 HRMEC 中利用转铁蛋白进行的网格蛋白介导的内皮细胞转胞吞实验中，荧光显微镜图像显示经 DAPI 染成蓝色的 HRMEC 内吞的 Cy3 标记转铁蛋白呈红色。以HRP检测小窝介导的内皮细胞转胞吞作用时，本实验以Wnt信号通路为例进行说明。近期研究发现，Wnt信号通路可调控小窝介导的内皮细胞转胞吞作用。实验中，细胞分别用Wnt通路激活剂Wnt3a条件培养基和重组Norrin蛋白处理，同时设置或不设置Wnt信号抑制剂XAV939及其相应的对照。Wnt 激活剂降低了基于 HRP 的转胞吞作用水平，而 XAV939 可逆转该效应。正确的 TEER 测量对于确定单层细胞完整性至关重要。该测量结果受多种因素影响，如操作不当、温度波动、培养基、培养时间等。该检测方法可修改为共培养或三维类器官培养系统，以模拟体内条件。

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