利用造血细胞因子进行肿瘤疫苗接种的实验性黑色素瘤免疫治疗模型

本方案提供了一种临床实体瘤免疫治疗模型以及研究肿瘤细胞与浸润性免疫细胞之间关系的研究平台。这种基于细胞的肿瘤疫苗使用方便、操作简便，可与其他治疗方式（如检查点阻断疗法）联合应用，以产生相加或协同效应，从而实现更强效的抗肿瘤免疫反应。演示该实验操作的是我实验室的研究技术员Ann Balancio。

首先，在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）、2毫摩尔谷氨酰胺、1毫摩尔丙酮酸钠、1毫摩尔MEM非必需氨基酸以及每毫升各100单位的青霉素和链霉素的IMDM培养基中培养B16-F10黑色素瘤细胞。将细胞系置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中维持培养。按照文本稿件中的描述进行B16-F10细胞的接种与收获。

吸去培养基，用 PBS 洗涤培养瓶一次。吸去 PBS，加入 5 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，用力轻敲培养瓶边缘。加入 15 毫升培养基以中和胰蛋白酶-EDTA，将瓶内液体倒入 50 毫升离心管中。

用10毫升PBS清洗培养皿表面，并倒入同一个50毫升离心管中。在200 RCF下离心细胞5分钟。弃去上清液，通过轻弹管底使细胞沉淀松散。

加入 10 毫升冷的 PBS，轻轻吹打混匀细胞悬液。然后使用血细胞计数板手动计数细胞。注射前将细胞置于冰上保存。

使用30号针头在左侧 flank 皮内接种500,000个B16-F10肿瘤细胞，溶于50 µL冷PBS中。为成功建立肿瘤模型，接种的B16-F10肿瘤细胞数量可能需要在50,000至500,000个细胞范围内进行调整。接种后，每周三次使用电子数显卡尺测量肿瘤的长度和宽度。

当肿瘤生长至两毫米时，根据文稿中所述方法计算肿瘤体积，并对小鼠施用肿瘤疫苗。使用设定为160千伏和25毫安的X射线辐照仪，以150戈瑞剂量的γ射线对细胞进行辐照。注射前通过台盼蓝染色法计数并检测细胞活力。

在初始细胞接种后的第3、6和第9天，于与原发肿瘤植入同侧的皮下部位，将100万照射处理过的B16-Flt3L细胞溶于50 µL冷PBS中，进行皮内注射，注射位置距离原发肿瘤约1厘米。使用彩色记号笔标记疫苗注射部位，以区别于原发肿瘤。

如果最初植入50,000个B16-F10细胞，建议在第8、11和14天进行疫苗治疗。将每只安乐死小鼠的肿瘤连同皮肤一起手术切除，放入含有1毫升10% FBS RPMI 1640培养基的24孔板中。在2毫升消化缓冲液中将肿瘤切成小块，并于37°C孵育25分钟。

加入 10 毫升含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基以终止消化。用 25 毫升移液管将细胞转移至 40 微米细胞滤筛。然后使用 1 毫升注射器的推杆研磨组织。

在 4 摄氏度下，以 500 RCF 离心细胞 5 分钟。将沉淀重悬于 5 毫升含 PBS 的 40% 密度梯度专用培养基中，该培养基已稀释至 1× 浓度。将细胞悬液缓慢加至 5 毫升含 PBS 的 80% 密度梯度专用培养基上层。

在室温下，以325 RCF离心力和低刹车设置离心23分钟。离心后，小心收集40%与80%密度梯度特异性培养基界面处的白细胞层，并通过40微米细胞筛网过滤。随后在4摄氏度下以500 RCF离心5分钟。

将沉淀物在2 mL红细胞裂解缓冲液中室温孵育5分钟。孵育结束后，加入10 mL含10% FBS的RPMI 1640培养基以终止红细胞裂解反应。在4°C条件下，以400 × g离心5分钟。

将细胞重悬于0.5毫升含10% FBS的RPMI 1640培养基中，并在用于后续分析前计数总细胞数。收集脾脏或引流淋巴结作为对照，用于流式细胞术分析中免疫细胞亚群设门策略的参考。按照文本稿件中描述的细胞分离方法进行操作。

通常在肿瘤植入约三天后，可在皮肤表面观察到植入的B16-F10细胞形成的可见黑色斑点。当肿瘤结节达到或超过两毫米时，分别在第三、第六和第九天对小鼠进行肿瘤疫苗治疗。在接种疫苗的小鼠组中，约在肿瘤植入两周后观察到显著的肿瘤生长抑制。

从白细胞层收集的细胞中含有大量肿瘤细胞，难以清晰界定淋巴细胞群体。因此，平行使用脾细胞，以准确圈定肿瘤内免疫细胞亚群在流式细胞术分析中的设门策略。CD103阳性、CD11c阳性树突状细胞、CD8阳性、CD4阳性和调节性T细胞（Treg）的设门策略与补偿矩阵一并绘制。

还提供了获得的细胞数量及各细胞群频率的代表性数据。来自疫苗接种小鼠的瘤内CD103阳性、CD11c阳性的树突状细胞（DC）表现出共刺激配体CD86的表达显著升高。疫苗接种小鼠还显示出肿瘤浸润性CD8阳性、CD4阳性且Foxp3阴性细胞，以及CD8阳性且颗粒酶B阳性、干扰素γ阳性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）数量增加。

确保原发肿瘤与肿瘤疫苗之间保持足够的距离。这种物理分隔对于避免两个肿瘤移植灶之间可能发生融合至关重要。