Name: 使用量子点介导的免疫标记，然后通过透射电子显微镜可视化心脏中蛋白质的亚细胞定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解量子点介导的免疫标记技术，用于小鼠心脏组织中蛋白质的亚细胞定位研究。该方法通过透射电子显微镜实现高分辨率成像，为医学诊断和治疗研究提供重要技术支持。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金的支持：R01HL145753、R01HL145753-01S1、R01HL145753-03S1 和 R01HL152723；MSB 获得了 LSUHSC-S CCDS Finish Line 奖项、COVID-19 研究奖项以及 LARC 研究奖项；CSA 获得了 LSUHSC-S Malcolm Feist 心血管研究博士后奖学金和美国心脏协会博士后奖学金（20POST35210789）；RA 获得了 LSUHSC-S Malcolm Feist 博士前奖学金。

本实验方案中的动物操作程序遵循《实验动物护理与使用指南》（第八版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州），并经路易斯安那州立大学健康科学中心-什里夫波特动物护理与使用委员会批准。本研究采用6月龄雄性FVB/N背景小鼠，小鼠来自商业来源（见 材料表小鼠饲养在环境可控的笼具中，保持12小时光照-黑暗循环，并自由饮水和摄取常规饲料。 随意摄取，并按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》进行饲养和管理。整个流程如图所示 图1.
1. 动物准备
<ol>
	<li>使用3%异氟烷麻醉小鼠。在腹部中段上方区域做一横向切口并拉开皮肤以打开胸腔。小心地再做一切口以打开胸腔，注意不要刺破任何其他器官21,22,23。
	<ol>
		<li>首先通过心尖灌注24心脏，然后使用冰冷的含3%戊二醛的心肌停搏液（50 mM KCl，5%葡萄糖PBS溶液，参见补充文件1）灌注右心室2分钟，以确保心肌完全松弛。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用冰冻的含3%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4，步骤2.1.1）继续灌注心脏2分钟。利用重力压力，使用25 G 5/8&#34;针头将固定液注入心脏。一旦心脏开始充满固定液，立即抬起心尖，并在距离心脏1-2 mm处剪断其下方的血管以释放压力，使液体得以排出。</li>
	<li>解剖心脏，去除心房24，将心室放入盛有冰冻3%戊二醛/0.1 M二甲胂酸钠的培养皿中。固定30-60分钟后做蝴蝶状切口，并将其置于含有3%戊二醛/二甲胂酸钠的培养皿中（参见材料表）。在戊二醛/二甲胂酸钠溶液中，使用手术刀将心脏切成1 mm3的小块。</li>
	<li>将解剖后的心脏组织在戊二醛/二甲胂酸钠溶液中于4 °C固定/浸渍24小时。</li>
</ol>
2. 心脏组织处理
<ol>
	<li>固定 24 小时后，用 0.1 M 的二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织 20 分钟。
	<ol>
		<li>按照以下步骤配制 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液。
		<ol>
			<li>配制 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液时，先配制 1 M 二甲胂酸钠缓冲液母液：将二甲胂酸钠（21.4 g）和 1% 氯化钙溶液（3 mL）溶于 90 mL 蒸馏水中，再用蒸馏水定容至 100 mL。充分搅拌溶液，并静置过夜以确保溶质完全溶解。</li>
			<li>取 10 mL 1 M 二甲胂酸钠母液，加入 80 mL 蒸馏水中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，再用蒸馏水定容至 100 mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>再次用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织 20 分钟。将组织从二甲胂酸钠缓冲液中取出，浸入 2% 四氧化锇溶液中，在室温下处理 4 小时。此过程称为锇酸固定。
	<ol>
		<li>按照以下步骤配制 2% 四氧化锇溶液。
		<ol>
			<li>配制 2% 四氧化锇溶液时，取 4% 四氧化锇溶液 4 mL（见材料表）、1 M 二甲胂酸钠母液 0.8 mL 和蒸馏水 3.2 mL，混合成总体积为 8 mL 的溶液。 
			注意：此整个过程及后续所有步骤均须在通风橱中进行。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成锇酸固定后，将组织在 2% 醋酸钠溶液中室温下浸洗 10 分钟。
	<ol>
		<li>通过将 4 g 醋酸钠溶解于 20 mL 蒸馏水中，配制 2% 醋酸钠溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接着，将组织在 2% 醋酸铀酰溶液中室温下浸染 1 小时。
	<ol>
		<li>通过将 4 g 醋酸铀酰溶解于 20 mL 蒸馏水中，配制 2% 醋酸铀酰溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成醋酸铀酰染色后，按照补充文件 1中列出的顺序，使用梯度乙醇和丙酮对组织进行逐级脱水。</li>
</ol>
3. 心脏组织包埋
<ol>
	<li>按照以下步骤将脱水后的组织包埋于低黏度环氧树脂中。
	<ol>
		<li>配制低黏度环氧树脂：在50 mL离心管中加入10.24 mL乙烯基环己烯二氧化物（ERL 4221）环氧单体、6.74 mL聚丙二醇二缩水甘油醚（DER 732）和30.05 mL壬烯基琥珀酸酐（NSA）（见材料表），手动充分搅拌2分钟。</li>
		<li>加入18滴2-二甲氨基乙醇（DMAE，见材料表）环氧促进剂，搅拌使各组分充分混合。</li>
		<li>按以下混合顺序用环氧树脂浸透组织。
		<ol>
			<li>用1:1树脂:丙酮混合液替换100%丙酮，将组织浸入其中，在室温下放置1小时。</li>
			<li>用6:1树脂:丙酮混合液替换1:1树脂:丙酮混合液，将组织浸入其中，持续3小时。</li>
			<li>最后，用100%树脂替换6:1树脂:丙酮混合液，将组织在室温下浸入其中过夜。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织放入盛有新鲜树脂的8 mm微型模具中（见材料表），在70 °C条件下固化过夜。 
	&#8203;注意：确保树脂固化后坚硬但不脆。</li>
</ol>
4. 使用超薄切片机进行组织切片
<ol>
	<li>将带有组织的树脂块修整至不超过 1 mm，然后安装到超薄切片机上（参见材料表）。尽可能精确地将模具放置在超薄切片机的分段臂上，并手动推进样品模具靠近金刚石刀。</li>
	<li>使用组织切片刀（Histo knife）（参见材料表）以 500 nm（半微米）的厚度进行切片，用电子显微镜载网环工具（EM loop tool）捞取切片并置于载玻片上。</li>
	<li>将载玻片置于加热板上，进行甲苯胺蓝染色25，以确定目标区域。</li>
	<li>找到目标区域后，使用 45° 超薄切片刀（Ultra 45° knife）（参见材料表）制备呈淡金色的超薄切片（100 nm），并将这些超薄切片置于 200 目铜网的哑面一侧。</li>
</ol>
5. 心脏超薄切片染色
<ol>
	<li>使用蚀刻液（即 5% 高碘酸钠溶液）进行抗原去封闭，开始染色步骤。
	<ol>
		<li>在蒸馏水中配制 500 µL 的 5% 高碘酸钠（见材料表）溶液。 
		注意：使用前新鲜配制。</li>
		<li>取 20 µL 高碘酸钠溶液滴加于洁净的石蜡膜上。将完全干燥并带有组织切片的载网放置于蚀刻液液滴中。 
		注意：载网上的组织切片面（无光泽面）必须朝向蚀刻液。</li>
		<li>室温下将切片载网置于溶液中孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将蚀刻后的组织切片置于蒸馏水液滴上清洗 60 秒。</li>
	<li>将切片载网置于 0.05 M 甘氨酸溶液液滴上，室温孵育 10 分钟以封闭残余醛基。用滤纸轻吸载网边缘，去除残留的甘氨酸溶液。
	<ol>
		<li>通过将 3.75 mg 甘氨酸溶解于 1 mL 1x PBS（pH 7.4）中，配制 0.05 M 甘氨酸溶液（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片载网置于 10–20 µL 封闭液中，室温孵育 25 分钟。 
	注意：封闭液组成：1% 正常山羊血清（NGS）2 µL + 1% BSA（终浓度 10%）20 µL + 1x PBS（pH 7.4）178 µL，最终体积为 200 µL。</li>
	<li>用滤纸吸干载网边缘，将载网切片置于抗体稀释液中，室温下预处理 10 分钟。</li>
	<li>将载网切片与一抗（本实验中为 Sigmar1，见材料表；用抗体稀释液按 1:10 稀释）在湿盒中孵育 1 小时 30 分钟。</li>
	<li>吸干载网，用抗体稀释液洗涤载网切片两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将载网切片与生物素标记的二抗（本实验中为生物素化山羊抗兔多克隆二抗，见材料表；用抗体稀释液按 1:10 稀释）在湿盒中室温孵育 1 小时。</li>
	<li>吸干载网，用抗体稀释液洗涤载网切片两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将载网切片置于市售的链霉亲和素偶联量子点（QD655nm，见材料表；用抗体稀释液按 1:10 稀释）中，在湿盒中室温孵育 1 小时。用铝箔覆盖孵育盒，避免光照。</li>
	<li>用滤纸吸干载网边缘，将载网切片置于水滴上清洗 2 分钟。</li>
	<li>用滤纸吸干载网边缘使其干燥。</li>
</ol>
6. 透射电子显微镜（TEM）成像
<ol>
	<li>将超薄切片置于样品四联铜网上，并将其夹在样品 holder 中，调整位置以便在电子束下选择铜网。</li>
	<li>将样品台插入显微镜镜筒，并启动泵开关以抽空测角台，随后将样品台完全插入显微镜镜筒中（参见 材料表）。</li>
	<li>在生成电子束进行图像观察前，将电压设定为 80 kV。</li>
	<li>对目标区域进行清晰聚焦，使用高速数字相机采集图像，并将文件保存为 .tif 格式。 
	注意：本研究中采集图像的显微镜设置为加速电压（或高张力电压）80 kV，放大倍数为 20,000x。</li>
</ol>

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<li>Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical applications of quantum dots.</a> AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，采用量子点介导的免疫标记技术特异性显示Sigmar1的亚细胞定位。利用量子点技术，清晰地展示了Sigmar1在心肌组织线粒体膜，尤其是线粒体内膜上的定位。此外，在超微结构水平上还发现Sigmar1定位于肌浆网/内质网（S/ER）和溶酶体，如图2A-D所示。
本方案中的一个关键步骤是使用高浓度的偏高碘酸钠溶液进行蚀刻或抗原修复，以在戊二醛固定和锇酸处理后暴露抗原。本方案采用单一处理方式，即使用高浓度（5%）偏高碘酸钠溶液在室温下孵育30分钟。此步骤需格外小心，因为偏高碘酸钠孵育时间过长或浓度过高会导致结构聚集、细胞器膜边界模糊，并在切片上造成穿孔，从而难以观察目标蛋白或结构。作为替代方案，也可使用较低浓度（3%）的偏高碘酸钠溶液分两步进行处理，每步30分钟，代替5%的单步处理。研究表明，该替代方案与5%偏高碘酸钠单步孵育30分钟的效果相似。然而，分两次使用3%偏高碘酸钠溶液各孵育30分钟，能更好地控制反应过程26,27,28。最初，本方案曾采用10%偏高碘酸钠溶液孵育30分钟，但由于该浓度在组织切片中产生过多穿孔，因此最终将偏高碘酸钠溶液的浓度和孵育时间逐步下调并优化为5%孵育30分钟。
另一个需要优化的步骤是使用戊二醛进行固定的时间。组织固定不足会导致量子点（QD）标记不充分，而过度固定则会引起较高的非特异性标记。因此，在确定和滴定组织最佳固定程度以实现蛋白质的准确且特异性标记时，必须仔细权衡。在本研究使用心脏组织的方法中，通过设置24小时和48小时两个时间点来滴定戊二醛的固定时间。根据这两个时间点固定后切片的染色图像结果，发现固定24小时的切片表现出更优的标记效果。迄今为止，市面上可提供的量子点纳米晶体有多种尺寸，包括525、565、585、605、655和705 nm11,29。每种量子点具有独特的发射光谱，并在不同波长处发射荧光。此外，这些不同尺寸的商业化量子点在形态上也各不相同；例如，QD 525、565和585在形态上几乎呈球形，但尺寸不同，而QD 605、655和705则呈不规则的长椭圆形。在这些不同的量子点纳米晶体中，QD 525、565和655彼此之间易于区分11,29。这些发射光谱和形态上的差异使量子点成为通过荧光显微镜和电子显微镜进行多标记蛋白检测与可视化的理想选择。在本研究中，选用了一种市售的量子点QD 655，用于标记Sigmar1蛋白，以便将其与染色切片中的任何非特异性背景信号区分开来。
在高分辨率显微镜中用于蛋白质标记的另一种量子点（QD）对应物是免疫胶体金颗粒。传统上，免疫胶体金颗粒被用于高分辨率显微镜下的蛋白质标记。与量子点纳米晶体相比，这些金颗粒具有高度电子密度，易于识别。然而，量子点在组织穿透性、稳定性、保存期限以及超微结构组分的保留方面表现更优，使其成为蛋白质标记更理想的候选材料4,5。此外，量子点具有可同时被光学显微镜和电子显微镜检测的独特能力，进一步提升了其相对于免疫胶体金标记的优势10。
这种量子点介导的免疫标记方法的一个局限性在于样品处理过程中使用了四氧化锇。四氧化锇用于增强电子密度、导电性以及原本电子密度较低且对比度较差的生物膜结构的对比度5,30。然而，四氧化锇的使用会瞬时且不可逆地破坏样品在用量子点标记后产生荧光的特性6，从而限制了量子点在荧光显微镜中的应用。若采用不使用四氧化锇的替代方法，则有助于保留量子点的荧光特性，进而实现量子点介导免疫标记的双重应用。一些较新型的透射电子显微镜（TEM）可配备能量色散X射线分析（EDX）系统，用于鉴定材料的元素组成。本研究的另一局限性在于缺乏对样品进行元素分布图绘制及使用EDX进行图像分析。因此，未来的研究应聚焦于对量子点光谱进行EDX分析，以解析其元素组成。
近年来，量子点（QD）标记蛋白质的技术受到了广泛关注。量子点在生物研究和医学治疗领域具有多种应用和优势。若量子点 дополнительно被多齿配体包裹，则可提高其稳定性，同时保持较高的量子产率。此外，通过这些生物相容性良好的试剂封装量子点，还能提高其在组织中的生物利用度，使其成为肿瘤检测、活细胞成像、药物递送和组织成像等潜在应用中的理想候选材料3,31,32。

人体由多种蛋白质构成，这些蛋白质负责执行多种生理功能。蛋白质的功能在很大程度上取决于其在器官和细胞器中的定位。目前常用多种技术来确定蛋白质的亚细胞定位，包括亚细胞分级分离、免疫荧光以及去污剂介导的蛋白质提取等方法1,2。其中，利用免疫荧光染料进行显微成像的技术应用最为广泛。然而，该技术所使用的荧光染料稳定性较差，容易发生光漂白3。其他技术则结合高分辨率显微镜，通过使用电子致密的重金属（如金、铁蛋白）或量子点纳米晶体对蛋白质进行免疫标记，进而在超微结构水平上观察蛋白质的分布，并利用透射电子显微镜（TEM）进行成像观察4,5。
量子点（QD）是一种由半导体金属化合物组成的半导体纳米晶体，具有可调控的光致发光特性，在生物系统中具有重要意义3。QD纳米晶体通常采用核-壳结构，即一个纳米晶体被封装在另一层纳米晶体中，以确保其稳定性和正常功能。常用的核-壳纳米晶体组合包括CdSe/ZnS、CdSe/CdS、CdSe/ZnSe、CdTe/CdS、CdTe/ZnS以及CdTe/CdS/ZnS（核/壳/壳）3。在这些纳米晶体组合中，CdSe/ZnS和CdSe/CdS被最为广泛研究，并常用于二抗偶联3,6。这些QD纳米颗粒还具有与传统荧光染料不同的激发和发射光谱。QD通过将电子从价带整体激发，实现比传统荧光染料更高的荧光量子产率。半导体金属的纳米晶体排列使QD介导的标记更加稳定，并且更耐光漂白6。此外，QD中的纳米晶体核及其晶体结构使得不同尺寸的QD具有宽范围的吸收光谱和非常窄的发射峰7。同时，这些QD颗粒足够大，能够产生高电子密度，因此适用于包括透射电子显微镜在内的高分辨率显微技术5,8,9。这些QD纳米晶体还可商业获得，具有多种尺寸、不同荧光发射光谱和形态，是多抗体标记的理想选择10,11。
量子点技术因其多种功能特性而在生物研究中受到广泛关注，包括用于活细胞成像、细胞内运输机制研究、蛋白质扩散运动的膜运输、细胞功能异质性分析以及细胞器标记3,12,13,14,15,16量子点（QD）在分子诊断中也具有重要应用，可用于靶向和检测癌组织，表征肿瘤的分子特征和免疫状态，以及可视化玻璃体和视网膜前膜。3,17,18此外，量子点还可用于医学治疗，以治疗肿瘤恶性疾病。 通过 通过向眼部递送药物实现光动力疗法和治疗眼科异常3,17,18,19.
本研究利用这些极具应用价值的量子点（QD）纳米晶体，确定了一种名为Sigma 1受体（Sigmar1）的蛋白质的亚细胞定位。Sigmar1是一种广泛表达的多功能分子伴侣蛋白。大量针对Sigmar1在不同组织和器官中亚细胞定位的研究表明，其定位具有细胞类型和组织类型特异性，并影响其分子功能20。在不同细胞（如神经元细胞、感光细胞和免疫细胞）以及不同组织（如肝脏和大脑）中，通过多种生物化学方法，研究报道了Sigmar1定位于内质网（ER）、线粒体相关内质网膜（MAM）、核膜、质膜、核质网、细胞核以及线粒体。尽管已有上述研究，Sigmar1在心脏组织中的亚细胞定位仍不清楚20。因此，本研究采用量子点介导的免疫标记结合透射电子显微镜（TEM）成像技术，确定了Sigmar1在心肌组织中的亚细胞定位。

<table><tbody><tr><td>200目铜网</td><td>Ted Pella</td><td>G200HH</td><td></td></tr><tr><td>FVB/N背景的6月龄雄性小鼠</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮 100%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A949</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>抗-Sigmar1抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>61994S</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔IgG抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7389</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（10%）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal Xyl</td><td>Thermo fisher</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>DER 732C36AA10:C33</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>Diatome</td><td>Histo; Ultra 45&lt;sup&gt;0&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13300</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEOL-1400 Flash</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15004</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 100%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A405P</td><td></td></tr><tr><td>3% 戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16538-15</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13816</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56</td><td></td></tr><tr><td>微型模具</td><td>Ted Pella</td><td>10505</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica Microsystem</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19050</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td>Genesse Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655链霉亲和素偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334</td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸钠</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>偏高碘酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片（10号）</td><td>Aspen surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>TEM&amp;nbsp;图像软件</td><td>AMT-V700</td><td>AMT TEM imaging systems</td><td></td></tr><tr><td>TEM成像相机</td><td>XR80 TEM系列</td><td>AMT TEM imaging systems</td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝O溶液（0.5%）</td><td>Fisher Scientic</td><td>S25612</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr></tbody></table>

利用量子点介导的免疫标记结合透射电子显微镜观察心脏中蛋白质的亚细胞定位

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

亚细胞定位对于阐明特定蛋白质的正常功能及确定其分子机制至关重要。目前已有多种定性和定量技术用于确定蛋白质的亚细胞定位。其中一种新兴技术是利用量子点（QD）介导的蛋白质免疫标记，随后通过透射电子显微镜（TEM）成像来确定蛋白质的亚细胞定位。量子点是一种半导体纳米晶体，具有晶体结构和高电子密度的双重特性，因此适用于电子显微镜观察。本方法利用量子点-透射电镜技术，在超微结构水平上可视化了野生型小鼠心脏组织中Sigma 1受体（Sigmar1）蛋白的亚细胞定位。取野生型小鼠心脏组织的小块样本，用3%戊二醛固定，随后进行锇酸处理，醋酸铀染色，再依次用乙醇和丙酮进行脱水。将脱水后的心脏组织包埋于低黏度环氧树脂中，切成500 nm厚的超薄切片，置于载网上，接着用5%过碘酸钠进行抗原修复，再用甘氨酸淬灭残余醛基。组织切片经封闭后，依次与一抗、生物素标记的二抗以及链霉亲和素偶联的量子点孵育。染色后的切片经吸干后，使用透射电子显微镜在高倍镜下观察成像。量子点-透射电镜技术实现了在心脏组织中超微结构水平上对Sigmar1蛋白&#160;亚细胞定位的可视化。该技术可用于在任何器官系统中可视化任意蛋白质的存在及其亚细胞定位。

本研究采用的量子点透射电镜（QD-TEM）方法通过在成年小鼠心脏超薄切片上进行靶向抗Sigmar1的量子点标记，直观展示了Sigmar1的存在及其在心肌细胞亚细胞结构中的定位。QD-TEM图像显示，电子致密的抗Sigmar1标记量子点位于线粒体膜（内膜和外膜）、溶酶体以及内质网/肌浆网（ER/SR）膜与线粒体的膜接触界面（图2A、B）。此外，作为抗Sigmar1兔源一抗的同型对照，心脏切片还使用兔IgG与量子点进行标记（图2C、D）。因此，QD-TEM成像明确了内源性Sigmar1的定位，其主要富集于溶酶体和线粒体膜上。
<img alt="小鼠心脏组织制备和染色工作流程图，包括固定、处理、包埋和标记步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：示意图展示进行QD-TEM所用的连续步骤和操作流程。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过电子显微镜观察线粒体超微结构示意图，详细展示细胞呼吸相关组分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：成年小鼠心脏组织中 Sigmar1 免疫标记的量子点（QD）定位。（A,B）代表性透射电镜（TEM）图像，显示 Sigmar1 标记的量子点定位于线粒体（外膜和内膜）、线粒体相关内质网（ER）/肌浆网（SR）膜以及溶酶体。（C,D）同型对照（使用量子点和兔 IgG 标记）的心脏切片透射电镜图像。比例尺：200 nm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件1：用于组织脱水的PBS及其他溶液的成分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本实验方案描述了一种利用量子点对心脏组织切片中的蛋白质进行免疫标记的方法。该技术为在超微结构水平上观察任何蛋白质的亚细胞定位和表达提供了有效的工具。

亚细胞定位对于阐明特定蛋白质的正常功能及确定其分子机制至关重要。多个……

确定蛋白质的亚细胞定位对于阐明其正常功能及相关作用机制至关重要。该方法可帮助我们在超微结构水平上直观观察蛋白质的亚细胞定位。量子点介导的免疫标记具有更高的稳定性，抗光漂白能力强，拥有独特的发射光谱，可产生高电子密度，在组织中穿透性更好，且标记效率更高、在组织中的保留性更佳。该过程中的多个步骤，即固定、蚀刻、封闭以及量子点的最佳浓度，都是需要优化的难点。建议尝试多种反应时间点和试剂浓度。另一个挑战是载网的操作，这需要耐心，当然也需要实践。演示该实验操作的人员包括：Chowdhury Abdullah（博士后研究员）、Naznin Remex（我实验室的研究生）以及Brandon Hartman（本机构电子显微镜服务中心的主管）。在麻醉小鼠并打开胸腔后，使用冰冻的含3%戊二醛的0.1摩尔钠二甲胂酸盐缓冲液对心脏进行灌注，持续两分钟。采用25号、5×8英寸的针头，通过重力压力将固定液注入心脏。心脏开始充满固定液后，立即抬起心尖以减轻压力。在距离心脏1至2毫米处剪断下方的血管，使液体排出。解剖心脏。去除心房，将心室放入含有冰冻的3%戊二醛和0.1摩尔的二甲胂酸钠的培养皿中。固定30至60分钟后作蝴蝶状切口，再将心室放回培养皿中。用手术刀将心脏切成1立方毫米的小块。将解剖后的心脏组织在四摄氏度下用戊二醛和二甲胂酸盐溶液固定并浸泡24小时。固定24小时后，用0.1摩尔的二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织两次，每次20分钟。将组织从二甲胂酸钠缓冲液中取出，室温下浸入2%四氧化锇溶液中四小时。锇酸处理后，将组织在2%醋酸钠溶液中室温浸泡10分钟。接着，将组织在2%醋酸铀酰溶液中室温浸泡1小时。醋酸铀酰染色后，依次通过梯度乙醇和丙酮对组织进行脱水。按照文中的描述，将脱水后的组织包埋于低粘度环氧树脂中。将组织放入8毫米的微型模具中的新鲜树脂内，并在70摄氏度下过夜固化包埋的组织。找到目标区域后，使用45度超薄切片刀制备呈淡金色的超薄切片。将这些超薄切片置于200目铜网的哑光面。开始染色时，通过在干净的石蜡膜上滴加20微升高碘酸蚀刻液来暴露抗原。将带有组织切片的干燥铜网放置于蚀刻液滴上。将切片载网置于溶液中，在室温下孵育30分钟。将蚀刻处理的组织切片放置于一滴蒸馏水中60秒，进行洗涤。将切片载网置于一滴0.05摩尔的甘氨酸溶液中，在室温下孵育10分钟，以封闭残余的醛基。用滤纸吸去载网边缘的残留甘氨酸溶液。将切片载网置于10至20微升封闭液中，室温孵育25分钟。用滤纸吸去载网边缘液体，将载网切片置于抗体稀释液中，室温下预处理10分钟。在湿盒中，将载网片与一抗于室温孵育1小时30分钟。用吸水纸吸干载网，再用抗体稀释液洗涤载网片两次，每次5分钟。在湿盒中，将载网片与生物素标记的二抗孵育1小时。网格经 blot 干燥后，用抗体稀释液洗涤网格部分两次，每次五分钟。将网格部分置于含有市售的链霉亲和素偶联量子点（QD）的溶液中，在室温下的孵育盒中孵育一小时。用铝箔覆盖孵育盒，避免光照。使用滤纸将载网边缘的印迹液干燥后，将载网置于水滴上清洗两分钟，再用滤纸吸干载网边缘。将样品台插入显微镜镜筒中，启动泵开关以检查测角台，随后将样品台完全插入显微镜镜筒内。对目标区域进行清晰聚焦。使用高速数码相机捕获图像，并将文件保存为 tif 格式。在线粒体膜、溶酶体以及内质网或肌质网膜与线粒体的界面处，均观察到 Sigmar1 标记的量子点。心脏切片使用兔免疫球蛋白 G 及量子点作为抗 Sigmar1 兔一抗的同型对照进行可视化观察。在进行本方案时，一个需要考虑的重要因素是抗原的去封闭时间。如果组织切片刻蚀时间过长，高碘酸盐溶液会在薄的组织切片上产生穿孔。量子点介导的标记技术正在肿瘤检测、肿瘤分子与免疫状态分析以及组织成像中受到关注，为医学诊断开辟了新的途径。量子点还可通过向眼部递送药物，用于光动力疗法治疗肿瘤以及眼科异常。

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