Name: 在膜上重构隔膜组件以研究生物物理性质和功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 了解膜结合蛋白在脂质双层上的组装机制，探索膜形态如何影响蛋白质组织。本方案提供适用于多种膜几何形状和蛋白质类型的灵活实验方法，助力细胞生物学与生物物理学研究。

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本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助号 R01 GM-130934 和美国国家科学基金会（NSF）资助号 MCB-2016022 的支持。B.N.C.、E.J.D.V. 和 K.S.C. 部分受美国普通医学科学研究所资助 T32 GM119999 的支持。

注意：制备支撑脂质双层需要先制备单一分散的小单层囊泡（SUVs）。有关SUV的制备，请参考先前发表的方案24。简而言之，所有SUV均通过探针超声处理制备，总时长为12分钟，超声功率为70%，采用4分钟超声与2分钟冰水浴中静置交替进行的方式。SUV溶液必须澄清且粒径均一。SUV的粒径分布可通过例如动态光散射25等方法测定。
1. 平面脂双层
<ol>
	<li>载玻片的等离子清洗 
	注意：等离子清洗可去除有机污染物，并增强玻璃表面的亲水性，从而确保脂质有效吸附。以下步骤可能需要根据所使用的等离子清洗仪和玻璃盖玻片进行调整或优化。
	<ol>
		<li>使用氧气对等离子清洗仪吹扫5分钟，以清除管路和腔室中的空气。此步骤可确保在运行等离子清洗时，管路和腔室内主要为氧气，从而获得更一致的双分子层制备效果。</li>
		<li>在吹扫的同时，用惰性气体（如N2或Ar）吹拂微型盖玻片表面，以去除灰尘和颗粒物。 
		可选：可用100%异丙醇喷洒盖玻片两面，随后用水冲洗。重复异丙醇-水清洗3次，再用N2气流吹干。</li>
		<li>将干燥的盖玻片整齐排列于陶瓷支架中。将支架置于等离子腔室后部，使盖玻片与腔室长边平行（以确保等离子清洗过程中盖玻片保持稳定）。以最大功率在氧气环境中运行等离子清洗仪15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>反应腔室制备 
	注意：此处描述的方法使用自制的塑料PCR管腔室以容纳反应液体积，但其他低吸附性材料（如硅胶小室）也可能适用。
	<ol>
		<li>使用剃刀刀片或剪刀，在0.2 mL PCR管磨砂部分下方切去管帽（图2）。</li>
		<li>在PCR管边缘涂抹紫外光活化胶水，避免胶水进入管内。轻轻将PCR管胶面向下置于经等离子清洗的盖玻片中央。 
		注意：为避免胶水进入腔室内，应使用最少必要量的胶水实现密封，并在放置后立即进行紫外照射处理，过程中避免碰撞或扰动腔室。</li>
		<li>将腔室置于长波长紫外光下照射5–7分钟，以固化胶水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双分子层形成 
	注意：此步骤应使用单一分散的小单层囊泡（SUVs），以实现高效的双分子层形成。表1列出了双分子层形成过程中所用所有缓冲液的配方，包括储备液和终浓度缓冲液。
	<ol>
		<li>向反应孔中加入40 µL支撑脂双层缓冲液（SLBB：300 mM KCl，20 mM HEPES，pH 7.4，1 mM MgCl2；表1）、10 µL 5 mM SUVs和1 µL 100 mM CaCl2。轻轻左右摇动反应腔室以破坏SUVs结构，随后在37 °C孵育20分钟。 
		注意：为减少蒸发，应将反应体系置于加盖的培养皿中，并在皿内放置湿润的擦拭纸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗去多余脂质 
	注意：此步骤用于去除多余的SUVs，并实现缓冲液置换。清洗过程中切勿用移液枪头刮擦双分子层表面；若玻璃表面暴露，septin蛋白及其他多种蛋白将不可逆地结合于其上，从而降低有效蛋白浓度。
	<ol>
		<li>孵育结束后，用150 µL SLBB缓冲液重复冲洗双分子层6次，每次上下吹打混匀，注意避免产生气泡。 
		注意：直接将150 µL缓冲液加入已存在的50 µL缓冲液和SUVs混合液中，使反应孔内总体积达到200 µL。</li>
		<li>当准备开始与septin蛋白或其他目标蛋白孵育时，用150 µL反应缓冲液（RXN：33.3 mM KCl，50 mM HEPES，pH 7.4，1.4 mg/mL BSA，0.14%甲基纤维素，1 mM BME）重复清洗双分子层6次。 
		注意：为获得最佳结果，建议现配反应缓冲液，并在反应孔内混匀时格外小心，避免产生气泡。</li>
		<li>最后一次清洗后，移除125 µL反应缓冲液，保留75 µL于孔内。加入25 µL用septin储存缓冲液（SSB：300 mM KCl，50 mM HEPES，pH 7.4，1 mM BME）稀释至所需浓度的septin蛋白，随后通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像26。 
		注意：首次建立该实验体系或引入新的脂质组成时，建议通过光漂白后荧光恢复（FRAP）实验确认脂质在表面自由扩散。尽管不同脂质组成的恢复速率会有所差异，且天然低于自由悬浮体系，但脂质不应完全静止不动。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">支撑脂双层缓冲液 (SLBB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>200 µL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM MgCl2</td>
			<td>20 µL</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>8 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">预反应缓冲液 (PRB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>166 µL</td>
			<td>33.3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>9.33 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">反应缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>166 µL</td>
			<td>33.3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>300 µL</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/mL BSA</td>
			<td>1.39 mL</td>
			<td>1.39 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% 甲基纤维素</td>
			<td>1.39 mL</td>
			<td>0.0014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>加至 10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>0.7 µL</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Septin 储存缓冲液 (SSB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>体积</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KCl</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>300 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>500 µL</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>加至 10 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME</td>
			<td>0.7 µL</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：制备支撑脂质双层及反应所用缓冲液的组分。 表中列出了加入缓冲液中的各种储备液的体积以及各组分的最终浓度。SLB 和 PRB 可在室温下保存，并可在不同实验间重复使用。反应缓冲液和 SSB 需在每次实验前新鲜配制。
2. 球形支撑脂质双层
注意：本方案使用悬浮于超纯水中、密度为10%的二氧化硅微球。在进行蛋白质组装动力学参数相关研究时，严格控制不同实验之间的总膜表面积和曲率至关重要。表2列出了为维持5 mm2总膜表面积所需的微球和缓冲液体积的校正值。本方案在先前发表的方法8,18基础上进行了扩展。
<ol>
	<li>双层膜的形成 
	注意：与平面双层膜类似，高质量的小单层囊泡（SUVs）对于稳定双层膜的形成至关重要。表2列出了使用不同直径微珠时，为获得5 mm2的最终表面积所需的10%密度溶液中的微珠体积及其相应的SLBB体积。
	<ol>
		<li>二氧化硅微球（也称为微珠）容易沉降并聚集；为混匀微珠并打散任何团块，先将瓶体涡旋振荡15秒，然后水浴超声1分钟，再涡旋振荡15秒。</li>
		<li>在0.5 mL低吸附微量离心管中，将适当体积的微珠（表2）与相应体积的SLBB以及10 µL的5 mM SUVs混合。</li>
		<li>将微珠-脂质混合物在室温下以翻转方式轻轻摇动1小时。确保该孵育过程在旋转仪上进行，以防止沉降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在PEG修饰的盖玻片上制备反应腔室 
	注意：与平面双层膜类似，本实验使用由塑料PCR管自制的腔室来承载反应液体积，但其他低吸附材料（如硅胶小室）也可能具有同样效果。
	<ol>
		<li>在微珠摇动的同时，将一张PEG修饰的盖玻片在室温下解冻。剪切一段0.2 mL PCR管，并按照步骤1.2所述方法将其粘接到盖玻片上。对于24 mm × 50 mm的载玻片，一张玻片上最多可合理容纳10个腔室。 
		注意：本方案使用预先制备的24 mm × 50 mm PEG修饰玻璃盖玻片。简而言之，玻璃盖玻片通过在丙酮、甲醇和3 M KOH中依次超声清洗进行彻底清洁，随后用n-2-氨乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷进行功能化修饰，并共价连接至mPEG琥珀酰亚胺戊酸酯。制备完成的PEG修饰盖玻片在−80 °C下真空密封保存。类似钝化方案可参考Gidi等人的研究27。尽管此处推荐使用PEG修饰玻璃盖玻片，其他钝化方法（如BSA或聚-L-赖氨酸法）也可能有效。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗去多余脂质 
	注意：此步骤旨在去除多余的SUVs并完成缓冲液置换。微珠需用预反应缓冲液（PRB：33.3 mM KCl，50 mM HEPES，pH 7.4）总共洗涤4次。表3列出了适用于不同直径微珠的相对离心力（RCF）转速。
	<ol>
		<li>按指定RCF离心微珠30秒（表3）。若使用多种尺寸的微珠，请在轮到其洗涤前继续保持微珠摇动。 
		注意：为节省时间而将较大微珠与较小微珠以较小珠的沉降速度一同离心是不可取的，这可能导致微珠相互粘连，破坏双层膜的完整性。</li>
		<li>第一次离心后，移除50 µL上清液并加入200 µL PRB。第二次和第三次离心后，各移除200 µL上清液并加入200 µL PRB。第四次离心后，移除200 µL上清液并加入220 µL PRB。每次洗涤均需用力吹打混匀。 
		注意：最终重悬体积与洗涤体积不同。在脂质孵育后切勿涡旋微珠，以免在双层膜中产生空隙。为避免在处理其他尺寸微珠或设置实验其他部分时发生沉降，请将微珠混合物重新放回翻转式旋转仪上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备反应体系 
	注意：该反应设计旨在保持反应体系中总膜表面积恒定为5 mm2，并达到最终反应条件：100 mM KCl、50 mM HEPES、1 mg/mL BSA、0.1%甲基纤维素和1 mM BME。
	<ol>
		<li>若进行多种微珠尺寸的竞争性实验，可通过将各尺寸微珠等体积混合制备1:1的混合液。然后，取29 µL所需微珠混合液（或单一尺寸微珠）与721 µL RXN缓冲液混合。 
		注意：每一步均需使用移液器充分混匀微珠，以避免微珠密集聚集；这有助于实现更均匀的微珠分布和准确的总表面积。</li>
		<li>将75 µL稀释后的微珠与25 µL用SSB稀释的蛋白加入各孔中。 
		注意：作者通常在1–50 nM浓度范围内对酵母septin复合物进行成像。</li>
		<li>若需测量稳态下的septin分布，则在室温下孵育1小时后，使用近全内反射荧光（near-TIRF）或共聚焦显微镜进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>微珠直径&#160;(µm)</td>
			<td>充分混合微珠的体积 (µL)</td>
			<td>SLB缓冲液的体积 (µL)</td>
			<td>SUVs的体积 (µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.46</td>
			<td>8.94</td>
			<td>61.1</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.06</td>
			<td>7</td>
			<td>63</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.17</td>
			<td>4.39</td>
			<td>65.6</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.96</td>
			<td>1.33</td>
			<td>68.7</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.54</td>
			<td>0.75</td>
			<td>69.3</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.31</td>
			<td>0.43</td>
			<td>69.6</td>
			<td>10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：微球的归一化体积。 为了保持每种粒径微珠的表面积相等，并确保不同实验间总膜表面积的一致性，计算了使总表面积归一化所需的每种粒径微珠及其缓冲液体积。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>微珠直径（µm）</td>
			<td>沉降速度（RCF）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.31</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.54</td>
			<td>4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.96</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.17</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5.06</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：不同直径微球的沉降速度。针对每种微球直径，所示的最低沉降速度用于使微球沉淀，以洗去未结合的脂质体。
3. 杆支撑的脂质双层
注意：与本文介绍的其他检测方法不同，杆状结构检测法无法精确控制总的膜表面积。虽然可以在不同实验之间保持用量和体积的一致性，但由于这会导致形成长度和直径不同的杆状结构，因此很难推算出反应中膜的总表面积。因此，尽管该方法非常适合在单一表面上研究多种曲率条件下的曲率感知，并且在研究 septin 超微结构方面已证明具有实用价值，但不推荐用于动力学测量。该方法此前已有报道18，本文在此基础上进行了扩展。
<ol>
	<li>从玻璃微纤维滤膜中获取硼硅酸盐细棒
	<ol>
		<li>将一张42.5 mm的GF/C级玻璃微纤维滤膜撕成小片，放入含有60 mL 100%乙醇的100 mL烧杯中。超声处理至溶液变浑浊；若滤膜被充分剪碎，此过程可能仅需20–30分钟。 
		注意：需充分超声以打碎大块物质；溶液越分散、越浑浊，效果越好。</li>
		<li>用封口膜覆盖溶液，并在室温下静置过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细棒上形成双层脂膜 
	注意：此步骤使用过量脂质以确保细棒表面完全覆盖，因为本方法无法定量总表面积。
	<ol>
		<li>次日，乙醇溶液已沉淀（见步骤3.1.2），使用前需充分混匀。取10 µL细棒溶液与70 µL SLBB混合。</li>
		<li>在微型离心机中以最高速度离心30秒，弃去50 µL上清液。用另外50 µL SLBB重悬沉淀，重复离心，共进行四次洗涤以稀释乙醇。 
		注意：细棒载体不会在管底形成致密沉淀，而是沿管壁涂抹状分布；因此在洗涤过程中难以完全保留。由于本实验未控制总表面积，轻微扰动不影响结果。</li>
		<li>取10 µL充分混匀的细棒溶液，加入50 µL 5 mM SUVs和20 µL SLBB。在室温下孵育1小时，以翻转混匀的方式旋转，如同在微球上形成脂双层时的操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗去多余脂质
	<ol>
		<li>与步骤3.2.2类似，将脂质-细棒混合液在微型离心机中以最高速度离心30秒，使包被膜的细棒沉淀。</li>
		<li>第一次离心后，移除50 µL上清液并加入200 µL PRB。第二次和第三次离心后，各移除200 µL上清液并加入200 µL PRB。第四次离心后，移除200 µL上清液，加入220 µL PRB，并剧烈吹打混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备反应体系
	<ol>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，将721 µL反应缓冲液与29 µL细棒溶液混合，充分混匀。</li>
		<li>在0.2 mL PCR管中，加入75 µL反应缓冲液中的细棒溶液和25 µL目标浓度的septin蛋白（用SSB稀释），室温孵育至少1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微镜样品制备
	<ol>
		<li>孵育结束后，将100 µL septin-细棒混合液滴加至圆形PEG包被的12 mm盖玻片上，置于密闭培养皿中，室温孵育1小时。</li>
		<li>用玻璃移液管将10 mL 2.5%戊二醛（溶于0.05 M磷酸缓冲液NaCo，pH 7.4）加入培养皿底部，固定样品30分钟。用玻璃移液管吸除液体。加入10 mL 0.05 M NaCo孵育5分钟，重复一次，共洗涤两次。</li>
		<li>在0.5% OsO4 磷酸缓冲液中后固定30分钟，随后用0.05 M NaCo洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>用1%单宁酸孵育样品15分钟，再用NaCo洗涤3次。接着在0.5% OsO4中孵育15分钟，再次用NaCo洗涤3次。</li>
		<li>使用梯度乙醇进行脱水：30% EtOH处理5分钟，重复两次；50% EtOH处理5分钟；75% EtOH处理5分钟；100% EtOH处理5分钟，重复两次。之后再继续孵育10分钟。</li>
		<li>用过渡液（六甲基二硅氮烷）孵育3次（分别为5分钟、10分钟、5分钟）。</li>
		<li>让样品自然风干，然后放入干燥器中直至喷镀。使用金/钯合金喷镀4 nm厚度，随后在扫描电子显微镜下观察成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li>
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</ol>

作者无利益冲突。

细胞膜具有多种不同的形态、曲率和理化性质。为了研究细胞如何通过纳米级的分子机制构建微米级的结构，有必要设计出膜模拟物的最小重建系统。本方案介绍了一种能够精确控制膜曲率和组分的技术，同时允许使用者利用广泛可用的显微镜技术轻松进行定量荧光测量。
本方案最关键的步骤是将小室组装在合适的表面上并正确处理脂质。本文所述的小室是使用PCR管和紫外光激活胶水手工制作的；组装过程中应避免将胶水沾到反应区域内部。实验过程中可通过成像观察小室边缘，检查盖玻片上是否存在蛋白质过度吸附，以判断是否发生污染。使用者也可选择其他材料制作小室，例如可从商业渠道购买的硅胶小室，但本文所述方法可制备出坚固、不易移动或泄漏且能容纳较大反应体积的小室。据我们经验，盖玻片的表面特性对于形成平面双分子层极为重要。为实现双分子层的均匀形成，可能需要优化等离子清洗时间，甚至更换不同品牌的盖玻片，因为适当的表面处理和表面电荷对于囊泡的吸附与融合至关重要31,32,<sup class="xr...

细胞及其许多内部区室的形态依赖于包围它们的脂质膜。膜是具有黏弹性的结构，可通过与蛋白质的相互作用、脂质分选以及内外部作用力的参与发生形变，从而形成多种多样的形态1,2,3,4。这些形态通常以膜曲率来描述。细胞利用多种不同的蛋白质，这些蛋白质能够优先组装到特定曲率的膜上，或&#34;感知&#34;特定的膜曲率，从而确保对细胞运输、胞质分裂和细胞迁移等过程实现精确的时空调控5,6。由于难以在时间分辨率、空间分辨率与细胞健康之间取得平衡，细胞膜上分子机器动态过程的观测尤为困难。尽管超分辨率成像技术可提供这些结构的详细视图，但其成像过程耗时较长，难以匹配大多数分子机器组装与解聚的时间尺度。此外，这些复合物在其天然环境中具有复杂的分子组成，且单个组分可能具有多种功能，因此构建简化的重建系统成为研究分子功能能力的重要工具。
已开发出最小化的膜模拟物，用于在细胞外研究膜的性质及蛋白质与膜之间的相互作用。膜模拟物包括游离脂质双层（如脂质体或巨型单层脂质囊泡）以及支撑脂质双层（SLBs）。7,8,9,10. 支持性脂双层（SLBs）是锚定在基底上的仿生膜，基底通常由玻璃、云母或二氧化硅组成11,12.&#160;可采用多种几何形状，包括平面、球体、棒状物以及波动状或微图案化基底，以同时在凹面和凸面曲率上探究蛋白质-膜相互作用13,14,15,16,17,18双层膜的形成始于囊泡在亲水表面的吸附，随后发生融合和破裂，从而形成连续的双层膜（图1)19支撑双层膜特别适用于光学和电子显微镜观察，其时间和空间分辨率通常优于细胞中的成像效果。弯曲的支撑脂双层膜（SLB）尤其为研究蛋白质对膜曲率的敏感性提供了理想手段，且无需引起显著的膜形变，从而能够在无显著膜变形的情况下区分曲率感知与曲率诱导，而这两种效应在游离膜系统中通常难以分辨。
Septins 是一类能够形成丝状结构的细胞骨架蛋白，以其在正曲率膜上组装的能力而著称6,18,20。在酵母细胞周期过程中，Septins 会组装成环状结构，并必须重排为沙漏形结构和双环结构，分别对应芽体出现和胞质分裂阶段21。尽管已有研究利用铂复型电子显微镜技术在不同细胞周期阶段观察 Septins 的超微结构，取得了精美成果22，但通过光学显微镜在活体酵母中实时观察 Septins 组装过程的空间分辨率却较为有限。以往基于透射电子显微镜（TEM）对脂单层上 Septins 的研究成功重建了多种有趣的 Septins 结构，如环状、束状和网状结构23。然而，电子显微技术在时间分辨率方面同样受限，而荧光显微镜则具备更高的时间分辨率。为了更清晰地解析 Septins 多尺度组装过程的动力学参数，我们采用了支撑膜模拟系统，在该系统中可精确控制膜的几何形状、样品条件以及成像模式。
本文所述方案使用平面或曲面固相脂双层膜（SLB）、纯化蛋白以及多种显微镜技术的组合。采用定量荧光共聚焦显微镜和全内反射荧光显微镜（TIRFM），不仅可测量蛋白整体在不同膜曲率上的结合情况，还可检测单个分子的结合动力学。此外，该方案已调整适用于扫描电子显微镜（SEM），以观察蛋白在不同膜曲率上的超微结构。尽管这些方案的重点是研究septin细胞骨架，但读者可轻松修改本方案以探究任何感兴趣蛋白对膜曲率的敏感性。同时，从事胞吞作用或囊泡运输等领域研究的研究人员可能会发现，这些技术有助于探究多蛋白复合物依赖于膜曲率的组装行为。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 平盖 PCR 管，透明</td><td>Watson</td><td>137-211C(EX)</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 低吸附管</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（BME）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4612-25G</td><td></td></tr><tr><td>用于制备 PEG 修饰盖玻片的盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>152450</td><td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cover Glass 24x50 #1.5</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>卵磷脂罗丹明 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810146</td><td></td></tr><tr><td>EMS 25% 水溶液戊二醛，电镜级</td><td>VWR</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>EMS 卡可基酸钠缓冲液</td><td>VWR</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，200 证明</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223EA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>VWR</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素 4000cp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M052-100G</td><td></td></tr><tr><td>用于平面双层膜的微型玻璃盖玻片</td><td>Matsunami</td><td>已停产</td><td>22x22</td></tr><tr><td>迷你离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>非功能化二氧化硅微球</td><td>Bangs Laboratories, Inc.</td><td>根据尺寸而定：SS0200*-SS0500*</td><td>水悬浮液中的二氧化硅</td></tr><tr><td>光学胶</td><td>Norland Thorlabs</td><td>NOA 68</td><td>适用于玻璃或塑料的柔性胶粘剂</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Millipore Sigma</td><td>20816-12-0</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-25</td><td>电压：120V，60Hz；电流：15 安培</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>VWR</td><td>0395-1kg</td><td></td></tr><tr><td>圆形盖玻片，#1.5，12mm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td>Bransonic 超声清洗器，50-60 Hz，输出功率：70W</td></tr><tr><td>大豆磷脂酰肌醇（Soy PI）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840044</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>Spectroline</td><td>ENF-260C</td><td>115 伏，60 Hz，0.20 安培</td></tr><tr><td>Whatman 玻璃微纤维滤纸</td><td>VWR</td><td>28455-030</td><td>直径 42.5 mm，GF/C 级</td></tr></tbody></table>

在膜上重建隔蛋白组装以研究其生物物理特性与功能

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

大多数细胞能够感知并改变其形态，以执行基本的细胞活动。在许多真核生物中，Septin细胞骨架是协调细胞形态变化（如胞质分裂、极性生长和迁移）的关键组分。Septin是一类能够形成丝状结构的蛋白质，可组装成多种高级结构，在许多情况下分布于质膜的不同区域，尤其集中在微米尺度正曲率的膜区域。监测Septin组装过程 在体 由于光学显微镜在细胞中的局限性，以及 Septin 与膜结构和细胞骨架成分相互作用的复杂性，使得在活体系统中量化 Septin 动态变得困难。幸运的是，在过去十年中，已在无细胞体系中成功重建 Septin 细胞骨架，从而能够在高时空分辨率下解析调控 Septin 组装的分子机制。Septin 组装的核心步骤包括：Septin 异源寡聚体与膜的结合与解离、聚合成丝状结构，以及通过丝状体之间的相互作用形成更高阶的结构。本文介绍了三种在不同条件下观察 Septin 组装的方法：平面双分子层、球形支撑体和棒状支撑体。这些方法可用于测定 Septin 在不同组装阶段的生物物理参数：单个八聚体与膜结合的状态、丝状体状态，以及丝状体的组装态。我们将这些参数与曲率感知和优先吸附的实验测量相结合，以理解曲率感应在多种空间和时间尺度上的作用机制。

在制备每张支持性脂双层（SLB）后，可将septin蛋白或目标蛋白与所需的支撑表面孵育，并通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）、共聚焦显微镜或扫描电镜（SEM）进行成像。本文所示结果使用了从E. coli17中重组表达并纯化的septin蛋白。利用TIRFM对平面SLB进行观察，可测定丝状结构的长度及其柔韧性，测量扩散系数，并实时观察其组装过程28,29。为了获得最高质量的测量数据，首先必须确认脂双层的质量，尤其是在首次制备或改变脂质组成时。通过TIRFM对双分子层上蛋白分布进行视觉检查，有助于识别被划伤或形态异常的区域。蛋白分布应均匀（图3A），双分子层上不应出现孔洞或间隙（图3B）。应尽量避免使用带有孔洞的膜，因为这些孔洞可能由灰尘污染或载玻片操作时的污迹引起，进而影响双分子层其他区域的蛋白分布。为直接观察膜结构本身，可在小单层囊泡（...

无细胞重建是研究细胞骨架组装的关键工具，过去十年的研究已建立了在简化系统中研究 septin 动态的方法。本文介绍了三种互补的方法，用于在不同膜环境中观察 septin 的组装：平面双层膜、球形支撑体和杆状支撑体。

大多数细胞能够感知并改变其形状，以执行基本的细胞过程。在许多真核生物中，Septin 细胞骨架是细胞结构的重要组成部分……

本方案将指导从事膜结合蛋白研究的人员，确定膜形态在蛋白质组装有序化过程中的作用。该技术的主要优势在于其对蛋白质类型、膜成分和膜几何形状的广泛适用性。此外，该方法还可用于探究脂质双分子层如何改变相关蛋白质的性质。为了确定实验中合适的膜，我们建议建立一个检查清单，其中可能包括脂质扩散速率、目标蛋白的流动性，以及表面是否存在未破裂或已融合并黏附在表面的脂质体。开始载玻片的等离子清洗前，先用氧气对等离子清洗仪吹扫五分钟，以清除管路和腔体内的空气。将干燥的盖玻片整齐放置于陶瓷支架中。吹扫时，将惰性气体流过微型盖玻片表面，以去除灰尘和颗粒物。将载物架置于等离子腔体后部，使盖玻片与腔体长边平行。使用氧气在最大功率下运行等离子清洗仪15分钟。进行腔室制备时，将0.2毫升PCR管的磨砂部分下方管帽剪掉。在PCR管边缘涂抹紫外光活化胶水，注意避免胶水进入管内。将涂有胶水的一端朝下，轻轻放置在经等离子清洗过的盖玻片中央，然后将整个腔室置于长波长紫外光下照射5至7分钟，使胶水固化。为了形成双层膜，将试剂加入孔中。轻轻左右摇晃腔室以破坏小单层囊泡（SUVs），然后在37摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，用150微升SLBB缓冲液轻轻吹打，洗涤双层膜六次，以去除多余的脂质，随后在与Septin蛋白孵育前，再用150微升反应缓冲液洗涤六次。在最后一次洗涤步骤中，移除反应缓冲液，每孔保留75微升。加入25微升用SSB稀释的septin蛋白，通过全内反射荧光显微镜（TIRF）进行成像。首先，将含有二氧化硅微球的瓶子涡旋震荡15秒，然后超声水浴1分钟，再涡旋震荡15秒，以打破任何聚集的微球团块。在低吸附微量离心管中，将磁珠与SLBB及10微升5毫摩尔的SUV混合。将磁珠-脂质混合物置于摇床上，室温孵育1小时，以防止沉淀。在此期间，解冻一片经聚乙二醇修饰的盖玻片，并将一段截短的0.2毫升PCR管粘附于其上。孵育后，在指定的相对离心力（RCF）下离心 beads 30 秒。第一次离心后，移除 50 微升上清液，然后加入 200 微升 PRB，并通过剧烈吹打混匀。在后续步骤中，第二次和第三次离心后各移除 200 微升 PRB 并重新加入 200 微升 PRB，第四次离心后加入 220 微升 PRB。若进行包含多种微珠尺寸的竞争实验，需将每种尺寸的微珠取等体积混合，再取29微升该微珠混合物与721微升反应缓冲液稀释；随后向各孔中加入75微升稀释后的微珠混合物和25微升用SSB稀释的蛋白质溶液，并混匀。若需测量处于稳态的septin蛋白，将反应体系在室温下孵育一小时，然后通过近全内反射荧光（near TIRF）或共聚焦显微镜成像。用绿色显示的septin蛋白与平面SLB共同孵育后的TIRF显微图像表明，蛋白质呈均匀分布。使用清洁不充分的玻璃盖玻片制备的SLB在低浓度septin区域显示出双层膜上的孔洞或间隙。若使用陈旧的脂质体或洗涤步骤不够严格，未破裂且呈管状的脂质体可能在表面聚集。通过罗丹明PE标记观察到的脂质包被微球的显微图像显示双层膜均匀平滑地沉积。膜均匀地包覆在球形载体表面，且仅有少量珠状聚集体。过量脂质洗涤不充分会导致膜包覆不均，表现为脂质团块，而操作不当则会导致双层结构出现间隙。珠粒混合不充分会引起聚集，不利于总蛋白吸附量的测定。利用此处介绍的支撑脂质双层，还可开展其他方法，如荧光寿命成像显微镜、膜质谱流式细胞术以及高速原子力显微镜，以研究不同的蛋白质-蛋白质或蛋白质-膜动态相互作用。

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科研

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生物化学

在膜上重构隔膜组件以研究生物物理性质和功能

在本视频中，我们演示一种在玻璃支撑脂双层上研究 septin 组织结构的方法 体外...

平面支撑脂双层实验：一种基于显微镜的体外技术，用于研究Septin在生物膜模拟物上的组装

本视频介绍了在涂有脂质双层的微球上研究 septin...

球形支撑脂双层实验：一种在微球上观察Septin组装的技术

本文描述了将一种原型电压门控钾通道完全重建到脂质膜中的操作步骤。重建后的通道适用于生化分析、电生理记录、配体筛选以及电子晶体学研究。这些方法可能普遍适用于其他膜蛋白的结构与功能研究。...

将Kv通道重构至脂质膜中用于结构与功能研究

有丝分裂纺锤体的组装和定位依赖于微管动力学、马达蛋白和交联蛋白共同产生的作用力。本文介绍了我们近期开发的方法，该方法利用球形乳液液滴的几何限域，自下而上地重建基本的有丝分裂纺锤体。...

在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

体外重建细胞骨架蛋白是理解这些蛋白基本功能特性的关键工具。本文介绍了一种纯化重组septin复合物并评估其质量的实验方案，septin复合物在细胞分裂和迁移中发挥核心作用。...

用于无细胞重组的重组Septin复合物的纯化与质量控制

Septins 是细胞骨架蛋白。它们可与脂质膜相互作用，并能够在微米尺度上感知甚至产生膜曲率。本实验方案中，我们描述了自下而上的体外（in vitro）方法，用于分析膜形变、对曲率敏感的 septin 结合行为以及 septin...

自下而上法 体外 检测Septin超微结构组织、膜重塑及曲率敏感行为的方法

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

Bacillus anthracis 是致命性吸入性炭疽病的专性病原体，因此对其基因和蛋白质的研究受到严格管制。一种替代方法是研究其直系同源基因。本文描述了对 B. anthracis 在 B. cereus 中的直系同源基因 bc1531...

重组蛋白表达、结晶及生物物理研究 芽孢杆菌属保守的核苷酸焦磷酸化酶，BcMazG

本方法中，我们介绍了从多种小鼠组织中快速高效分离中间丝（IF）蛋白的生化操作流程。分离得到的中间丝可用于通过质谱及其他生化实验研究翻译后修饰的变化。...

从小鼠多种组织中分离中间丝蛋白以研究衰老相关翻译后修饰

了解膜结合蛋白在脂质双层上的组装机制，探索膜形态如何影响蛋白质组织。本方案提供适用于多种膜几何形状和蛋白质类型的灵活实验方法，助力细胞生物学与生物物理学研究。

在膜上重建隔蛋白组装以研究其生物物理特性与功能

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