Name: 调查低成本方法，以测量秀丽隐杆线虫的寿命和健康寿命 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 了解低成本测量秀丽隐杆线虫寿命与健康寿命的方法。本方案采用同步化、运动能力测定和繁殖力评估等技术，为衰老生物学研究提供简便易行的实验手段。

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G.G. 由美国国家老龄化研究所的 T32AG052374 和 R.H.S. 由 R00AG065200 资助。我们感谢CGC（由美国国立卫生研究院研究基础设施项目 P40 OD010440 资助）提供菌株。

作者声明不存在竞争性财务利益。

寿命最简单的定义是生命的持续时间，在大多数生物中表现为一种明确的二元现象——生物要么存活，要么死亡。然而，长寿并不总是与生物体的健康状况相关。例如，线粒体激素效应模型中，暴露于线粒体应激可显著延长寿命，这类动物通常是寿命最长的个体，但却表现出生长迟缓和代谢功能下降37,54。类似地，内质网应激反应过度活跃的动物尽管表现出显著改善的蛋白质稳态和更长的寿命，但也展现出某些可与健康状况下降相关联的行为和表型36,49。最后，在模式生物中，许多延长寿命的范式，如HSF-1功能增强55、XBP-1功能增强56以及FoxO信号通路的改变57，均与癌症风险增加相关。如果生物体长期处于与癌症及其他健康问题的持续斗争中，那么延长寿命显然并不具有益处。因此，在衰老生物学研究中，寿命不能作为独立的衡量指标。
因此，健康寿命（healthspan）已成为衰老生物学中一个日益重要的研究领域。健康寿命大致定义为个体保持健康状态的生命时长，其确定难度较寿命更为复杂。然而，与寿命不同的是，健康寿命这一概念 &#34;健康&#34; 很复杂，因为生物体健康的衡量指标多种多样：在个体水平上，包括肌肉功能/力量、神经/认知功能、生殖健康等；在细胞水平上，包括蛋白质稳态、脂质稳态、葡萄糖稳态、代谢等。2014年，衰老生物学研究者明确界定了衰老的生物学标志，其定义需满足以下条件：该特征必须在自然衰老过程中发生渐进性衰退，并可通过实验手段进行干预，即实验性加剧应能加速衰老，而实验性干预则应能延缓衰老。这九大衰老标志包括基因组不稳定性、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白质稳态（proteostasis）丧失、干细胞耗竭、细胞间通讯改变、线粒体功能障碍、营养感应失调和细胞衰老58此后，大量研究认为应纳入其他因素，包括细胞外蛋白以及免疫和炎症等系统生理过程59最终，由于健康寿命的定义复杂，必须采用多种不同方法来测量生物体的健康状况。
因此，本论文介绍了利用线虫模型 C. elegans 测量健康寿命多个方面的多种方法。我们通过摆动实验检测运动行为，通过产卵计数和子代数量评估生殖健康，并检测对压力的敏感性。事实上，运动行为是测量健康寿命的金标准方法，因为生物体在衰老过程中会表现出显著的运动能力下降51。运动行为的丧失可归因于多种衰老特征，因为 C. elegans 的肌肉功能依赖于正常的蛋白质稳态60、线粒体功能障碍61以及神经-肌肉信号传导62。尽管本论文仅聚焦于一种运动行为的测量方法，但需指出的是，还存在许多其他方法，包括动物在固体琼脂平板上的运动能力、对触碰的反应51以及趋化性实验63。然而，这些方法通常需要更复杂的记录设备、蠕虫追踪软件，或使用昂贵、危险或易挥发的化学物质，这些因素在某些研究环境中可能构成限制。
此外，产卵量和子代数量检测被用作评估生殖健康的指标，同时也是测量成年线虫细胞分裂的最简单方法，因为成年线虫的体细胞已退出有丝分裂，只有生殖细胞和胚胎在成年个体中进行细胞分裂64。作为细胞分裂的衡量指标，生殖健康与细胞衰老和干细胞耗竭等衰老特征相关。生殖健康可受多种因素影响，包括病原体感染65或应激暴露49，但目前尚无证据表明生殖健康与寿命之间存在直接相关性。事实上，一些长寿个体表现出子代数量显著减少49，甚至可能存在寿命与子代数量之间的负相关关系50。这种现象并非C. elegans所特有，繁殖对寿命的不利影响在人类66、伴侣犬67和小鼠68中早已被观察到。尽管如此，我们仍提供产卵计数和子代数量作为评估生殖健康的可靠且低成本的方法，但需注意的是，生殖健康可能与寿命或健康寿命无直接相关性。
最后，生存实验可作为生物体健康状况的间接衡量指标。重要的是，细胞应激反应（包括对热应激69和内质网应激35的反应）在衰老过程中会迅速下降，这与衰老的核心特征之一——蛋白质稳态失衡（proteostasis）70,71直接相关。相反，过度激活应激反应可通过增强对压力的适应能力而显著延长寿命35,37,38。尽管本研究聚焦于最简单且成本最低的方法，但针对热耐受性41和氧化应激66的应激抗性检测仍存在大量替代方法，每种方法需要不同的仪器设备和耗材。除了简单的应激暴露实验外，还可根据设备条件开展其他生理学检测。例如，细胞外通量分析仪可用于监测线粒体功能和细胞呼吸73；荧光解剖显微镜可用于检测应激反应激活相关的转录报告系统20；而高分辨率的复式显微镜或共聚焦显微镜则可结合线粒体74、内质网75,76以及肌动蛋白细胞骨架77的荧光探针，用于检测细胞器形态。
最后，关于寿命测量的一个警示：尽管化学和遗传方法可用于使线虫不育，从而显著降低成本，但必须注意，这两种方法都可能直接影响寿命。例如，已有报道指出，FUDR 暴露会影响寿命和热耐受性45。虽然 glp-4(bn2) 突变体本身对寿命无直接效应，但在 25 °C 下培养属于轻度热应激33,34，因此可能影响寿命2。目前还存在其他使 C. elegans 不育的方法，包括依赖于生长素的不育技术78 或其他温度敏感型无精突变体79。然而，所有方法均存在一定的局限性，应谨慎选择对各实验室科研需求影响最小的实验方案。寿命研究的另一个最终局限在于，由于样本量过小或研究者客观操作误差，可能导致结果出现变异性。随着自动化寿命测定技术的出现，这一问题可得到缓解80，但这些系统成本较高，且需要一定的工程和计算设备与技能。最终，本文所提供的这一系列方法是一套可靠且易于在几乎所有机构中快速适应和掌握的工具，为衰老生物学研究奠定了坚实的基础。

自《遗传学》出版以来 秀丽隐杆线虫，西德尼·布伦纳（Sydney Brenner）于1974年发表的最具影响力的论文之一，该显微线虫一直被视为研究生物学奥秘的杰出模式系统11977年，Michael R. Klass发表了测定线虫寿命的方法 秀丽隐杆线虫 并建立了该模型系统用于研究衰老2. 为理解压力与寿命之间关系而开展的研究始于单个基因突变的发现 age-1 基因，导致了寿命的延长 秀丽隐杆线虫3此外，近期研究已鉴定出其他可延长寿命的突变，这些突变揭示了寿命延长的突变型线虫表现出对压力的抗性增强4,5,6具有多种优势，包括生命周期短、易于维护、基因组已完全测序且包含约三分之二人类致病基因的同源基因、可获取且易于使用RNA干扰（RNAi）文库，以及与人类相近的生理特性7,8,9, 秀丽隐杆线虫 已迅速成为应激与衰老生物学研究的杰出模型。
或许最大的用途在于 秀丽隐杆线虫 其维护成本极低、实验操作简便，以及可用于研究的丰富遗传工具。 秀丽隐杆线虫 通常在固体琼脂培养基上培养 E. coli 食物来源。两种常用 E. coli 菌株为标准的OP50，一种B型菌株，可能是最常用的菌株10，以及HT115，一种主要用于RNAi实验的K-12菌株11,12HT115 K-12 菌株携带 RNAIII 核糖核酸酶的缺失突变，该突变对于 RNAi 方法至关重要，其中质粒表达与特定基因对应的 dsRNA 秀丽隐杆线虫 基因被使用。dsRNA 饲喂载体可实现高效的基因敲低 秀丽隐杆线虫 无需复杂的杂交或基因组编辑即可研究基因功能，因为携带这些质粒的细菌可直接饲喂线虫。在HT115背景下已存在数千种此类细菌RNAi载体，包括最常用的Vidal RNAi文库，其包含 &#62;19,000 个独立的RNAi构建体13 以及包含16,757个RNAi构建体的Ahringer RNAi文库14然而，OP50 和 HT115 细菌食物在代谢谱上存在显著差异，包括维生素 B12 的差异15,16因此，建议尽可能使用单一细菌来源进行所有实验，以避免基因-饮食相互作用可能引入的多种混杂因素，正如前文所述。17,18,19由于操作简便，所有实验条件下均使用OP50进行动物培养，但所有实验均如前所述在HT115上进行20简而言之，为保持RNAi与非RNAi实验之间的一致性，动物在OP50上培养，并在同步化后（漂白后）转移至HT115。 alternatively，可使用一种具有RNAi能力的OP50菌株，该菌株携带与HT115中相同的RNAIII核糖核酸酶缺失。 E. coli K12 HT115 菌株也可使用21.
RNAi实验的一个主要局限性可能是 秀丽隐杆线虫 是关于敲低效率的问题。虽然敲低效率可以通过验证 通过 qPCR 或蛋白质印迹法需要昂贵的仪器和试剂，且仅限于整体分析。对于特定细胞（如神经元）而言，这一问题尤为突出，因为这类细胞对 RNA 干扰（RNAi）具有抗性（敏感性较低）。尽管可通过某些方法提高 RNAi 在特定细胞中的效率 通过 过表达SID-1（一种介导双链RNA摄取的关键跨膜蛋白）22，这仍然受限于这些构建体所用启动子的细胞类型特异性表达模式，因此基因敲除和基因突变是耗竭基因功能最可靠的方法。除了RNAi介导的基因敲低之外， 秀丽隐杆线虫 也高度适用于基于CRISPR的基因组编辑策略23,24,25&#160;通过显微注射实现转基因构建体的过表达，并可选择通过辐照或基于转座子的整合方法将转基因构建体整合到基因组中26,27,28,29然而，这些方法需要昂贵的显微注射设备，且向导RNA或Cas9酶的高成本可能使资金有限的机构难以采用这些技术。相比之下，在秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）和国家生物资源项目（National Bioresource Project，NBRP），仅需数美元即可轻松获得数千种转基因品系和突变体。NBRP提供了大量基因的分离突变体 秀丽隐杆线虫 基因，包括已发表且经过验证的突变株、来自初步研究项目的突变体，以及尚未完成表征的突变体。相比之下，CGC 主要保藏已发表并确立的 秀丽隐杆线虫 来自科研社区的菌株。两者均以非常合理的价格向全球运送菌株，并为那些在本单位合成菌株能力有限的研究者提供多种选择。
本文提供了一套精选的方法集合，这些方法可能是测定C. elegans寿命与健康寿命的最低成本方案。所介绍的所有方法均仅需低成本设备与耗材，并且仅使用可从秀丽线虫遗传中心（CGC） readily 获得的品系。在C. elegans中进行寿命与生存率测定的最大限制因素可能是线虫生长培养基（NGM）平板的成本。由于C. elegans为雌雄同体并能自体受精，标准的生存率测定要求持续将成虫从其后代中移开，以避免子代污染。这一过程不仅耗时，而且由于每组条件通常需要约100个平板才能完成一次寿命测定，成本可能显著上升。本文提供了两种替代方案：使用温度敏感型生殖系缺失突变体glp-4(bn2)，或使用5-氟-2'-脱氧尿苷（FUDR）进行化学性生殖抑制。glp-4编码缬氨酰-tRNA合成酶，温度敏感型glp-4(bn2)突变体在限制性温度下因蛋白质翻译水平降低而丧失生殖能力30,31。FUDR是一种通过抑制DNA复制从而阻断C. elegans繁殖的高效化学性绝育方法32。尽管FUDR对部分实验室而言可能价格较高，但其用量极小即可实现线虫的化学性绝育，且其粉末形式具有良好的稳定性，因此大多数研究团队仍可负担。使用温度敏感型glp-4(bn2)突变体无疑是成本最低的选择，仅需一个可调节至25 °C的恒温培养箱即可实现生殖抑制；但需注意，在25 °C下培养可能引起轻微的热应激33,34。无论采用何种方法，使用无生殖能力的线虫均可显著降低与衰老相关实验所需的耗材成本。
研究衰老时，标准的寿命测定是常规方法，因为影响寿命的范式会直接作用于衰老过程。然而，健康寿命和应激耐受能力的测量可提供有关生物体健康状况的额外信息。本文提供了几种测量健康寿命的方法：1）以生殖能力作为生殖健康的指标；2）以子代产仔数作为发育健康及所产后代存活能力的指标；3）以运动行为作为肌肉功能和活动能力的指标，这两者均与衰老直接相关。此外，本文还提供了应激耐受性的测定方法：内质网应激存活率、线粒体/氧化应激存活率以及热应激存活率。事实上，对内质网应激35,36、线粒体应激37和热应激38具有更强抵抗能力的动物通常表现出更长的寿命。通过将C. elegans暴露于衣霉素（tunicamycin）来诱导内质网应激，该药物可阻断N-连接糖基化，导致错误折叠蛋白的积累39。线粒体/氧化应激则通过百草枯（paraquat）处理诱导，该化合物可特异性在线粒体中引发超氧阴离子的生成40。热应激通过将动物置于34–37 °C条件下孵育实现33,41。本文所述所有测定方法均可在设备和资金投入最少的情况下完成，为不同研究团队提供了多种研究衰老的工具。

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>用于RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>二水氯化钙</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>用于RNAi</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>药物溶剂</td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>用于LB培养基</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>用于NGM平板和M9培养基</td></tr><tr><td>百草枯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>用于氧化应激/线粒体应激</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>用于漂白液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>用于NGM平板</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>用于M9培养基</td></tr><tr><td>S7E解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>标准解剖显微镜</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>用于NGM平板和M9培养基</td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>用于漂白液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>用于M9培养基</td></tr><tr><td>盐酸四环素</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>用于RNAi</td></tr><tr><td>衣霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>用于内质网应激</td></tr></tbody></table>

评估测量寿命和健康寿命的低成本方法 秀丽隐杆线虫

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式生物的发现与发展对生物学领域产生了深远影响，尤其是在衰老研究领域。许多历史性和当代研究已鉴定出数千种影响寿命的实验范式，包括基因突变、转基因表达以及应激的低剂量刺激效应（hormesis），即对压力的有益性低强度暴露。由于其具有寿命短、易于且低成本维护、基因组已完全测序且与人类近三分之二的基因具有同源性等诸多优势，C. elegans 已迅速成为研究应激与衰老生物学的杰出模型。本文综述了多种可用于测定寿命和健康寿命的标准化方法，这些方法可轻松适应几乎任何研究环境，尤其适用于设备和经费有限的实验室。文中重点展示了C. elegans的极高实用性，突出其在无需庞大基础设施的情况下即可开展强大的衰老相关遗传学分析的能力。最后，还讨论了每种分析方法的局限性及可供选择的替代方案，以供研究者参考。

秀丽隐杆线虫 是衰老研究的优秀模式生物，因为大多数衰老机制在人类和该生物之间是保守的。尤为重要的是，其维护和实验成本极低，对仪器和耗材的需求极少，使其成为资金有限机构所青睐的模型系统。此外，大量操作简便、学习门槛低的检测方法使其成为即使是最年轻的、缺乏或几乎没有经验的研究者也能轻松上手的理想系统。结合其强大的遗传学工具， 秀丽隐杆线虫 包括基因组编辑的便捷性、数千种可获得的突变体和转基因动物且成本低廉，以及可用于几乎每个基因遗传敲降的RNAi文库，使其成为本科院校的理想研究系统。本文介绍了一些研究衰老的最低成本方法 秀丽隐杆线虫 进行调查，主要关注那些所需设备和耗材成本较低、且学习曲线较平缓的检测方法。事实上，全部实验方案的撰写与数据收集均由初级研究人员完成 &lt;5 个月的研究经验，主要为本科生。
由于 C. elegans 的寿命较短，通常为 14–20 天，因此对其开展的长寿研究非常简便。重要的是，寿命测定实验已高度标准化，仅需一个培养箱、一台常规解剖显微镜、一把标准线虫挑取工具以及制备 NGM-琼脂平板所需的耗材。在 C. elegans 寿命测定中，可能最具成本限制的因素是所需耗材的数量。这是因为 C. elegans 为雌雄同体，可自体受精；因此，在进行寿命测定时，需每天将成虫从其后代中移出。然而，可通过使用 FUDR 处理或选择特定突变体（例如在 25 °C 高温下培养的温度敏感型无生殖系 glp-4(bn2) 突变体）来实现动物的无菌化，从而减少耗材的使用量30,31,32。本实验中采用 FUDR 或 glp-4(bn2) 无生殖系突变体进行寿命测定，所得结果与在非无菌动物中进行的标准寿命实验相似。尽管由于 FUDR 的影响45 或在 25 °C 下培养对寿命的作用2，野生型的寿命并不完全一致，但短寿的 hsf-1 沉默动物在所有条件下均稳定地表现出寿命显著缩短（图 1）。hsf-1 编码热休克因子 1（HSF-1）转录因子，该因子参与热应激反应的调控，其表达下调会导致寿命显著降低38,46。
尽管寿命是衰老生物学中需要考虑的一个重要因素，但寿命的延长往往并不伴随健康状况的改善，即使在C. elegans47中也是如此。因此，作为补充方法，我们提供了多种评估生物体健康状况的手段，包括生殖健康、运动行为以及应激抗性。生殖健康可通过两种方式之一进行测量。首先，通过统计产卵数量可直接反映单个自体受精雌雄同体个体所产卵子的数量。然而，由于线虫产生的卵母细胞数量多于精子，部分未受精的卵子也会被产出，而这些卵子无法发育为可存活的后代48。因此，为了更准确地评估个体真正的生殖能力，可通过子代数量（brood size）来衡量其可育后代的数量。通常情况下，应激抗性的增强实际上可能降低生殖能力，这可能是由于应激感知对生殖过程本身具有抑制作用所致49。类似地，与野生型对照相比，hsf-1过表达个体的产卵数和子代数量均显著减少（图2A、B）。事实上，部分hsf-1过表达个体表现出完全不育，这一现象表明生殖健康可能与寿命呈负相关关系。
尽管生殖健康对于理解种系健康、功能性减数分裂以及生殖能力至关重要，但总体而言，寿命与子代数量之间并无直接相关性50。因此，作为一种补充方法，运动行为被作为评估衰老过程中 C. elegans 健康寿命的金标准方法51。测量运动行为的方法有多种，但大多数方法需要复杂的相机、追踪软件或昂贵的化学试剂。相比之下，摆动实验几乎不需要标准 C. elegans 实验室以外的设备：体视显微镜、线虫挑取工具、移液器以及制备NGM-琼脂平板所需的耗材。摆动频率为测量衰老过程中的健康寿命提供了可靠的方法，其依据是老年个体的摆动频率相比年轻个体显著降低（图2C）。
最后，生存至应激实验是衡量生物体韧性的另一种生理指标。在衰老过程中，激活应激反应的能力通常会下降，导致生物体韧性降低、对压力更为敏感。因此，应激韧性可作为机体健康状况的可靠替代指标。本文提供了以下三种应激敏感性检测方法：1）通过暴露于衣霉素（tunicamycin）检测内质网（ER）应激敏感性，该化学试剂可阻断N-连接糖基化，导致未折叠蛋白在内质网中积累；2）通过百草枯（paraquat）暴露检测线粒体/氧化应激，该化学试剂可诱导线粒体中超氧化物的生成；3）通过高温暴露检测热应激。在进行衣霉素和百草枯实验时，需在制备NGM-琼脂平板时将药物加入平板中。对于高浓度的衣霉素，后代通常无法发育，因此无需使用灭菌技术。本方案推荐衣霉素的终浓度为25 ng/µL，但对于经费有限的研究者，10 ng/µL的浓度也能显著降低生存率（图3A）。这两个浓度均能抑制后代发育，因此无需采用灭菌方法；但DMSO对照组则需要使用灭菌技术或将动物转移至新的平板。这是因为衣霉素的毒性可阻止后代发育，而DMSO几乎无毒，因此在含衣霉素的平板上，若使用DMSO作为溶剂对照，后代仍可完全发育。
进行百草枯实验时，需要采用灭菌技术或转移动物，因为百草枯处理无法阻止后代发育至成虫阶段。高浓度百草枯（4 mM）会显著缩短寿命，而低浓度百草枯（0.25 mM）则由于激素效应延长寿命（图3B），这与先前发表的结果一致52。最后，热耐受实验仅需能够达到30–37 °C的培养箱，无需额外试剂。如先前研究所示，hsf-1 的过表达可提高在37 °C下的热耐受性（图3C）53。然而，正如其他研究者先前指出并结合本研究数据所示，热耐受实验的主要问题是其变异性。多种因素可能导致热耐受实验中的变异性，包括不同培养箱之间的差异，以及每小时记录热耐受时动物在培养箱外停留的时间。有关热耐受实验的详细操作指南，请参见参考文献41。
<img alt="显示不同条件下生存率的寿命分析图：N2、FUDR、glp-4(bn2)、温度20-25°C。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：有无灭菌处理的寿命测量结果比较。（A）野生型N2线虫在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂平板上于20 °C培养的寿命。成虫期第1、3、5和7天将动物移离后代。（B）野生型N2线虫在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂-FUDR平板上于20 °C培养的寿命。动物在标准的空载体或hsf-1 RNAi平板上培养至成虫期，然后在成虫期第1天转移至FUDR平板。（C）glp-4(bn2)突变体动物在接种空载体（ev）或hsf-1 RNAi细菌的NGM-琼脂平板上于25 °C培养的寿命。所有条件下，每2天记录一次动物死亡情况，直至所有动物被记录为死亡或删失。出现产卵袋、阴门突出或破裂，或爬至平板边缘干枯的个体予以删失处理。所有统计分析采用Log-Rank Mantel-Cox检验，结果见表2。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蠕虫运动能力、产卵数量、子代数量的比较；柱状图；统计分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：以产卵数、子代数量和运动能力作为健康寿命的衡量指标。 （A）在接种空载体的 NGM-琼脂平板上、25 °C 条件下培养的 glp-4(bn2) 突变型线虫，在第 1 天（蓝色）、第 4 天（红色）和第 9 天（绿色）进行运动能力检测。将线虫置于 M9 溶液中，在 NGM-琼脂平板上进行检测，使用安装在常规解剖显微镜目镜上的标准智能手机摄像头录制视频，并以慢动作回放计数运动频率。每组 n = 15 条线虫。 （B）在野生型 N2（蓝色）和 sur-5p::hsf-1（红色）线虫中测定产卵数量。线虫在 20 °C 下培养，并转移至新鲜平板，每 12 小时计数一次所产卵数，最终累加总产卵数。野生型组 n = 7 条线虫，sur-5p::hsf-1 组 n = 9 条线虫。 （C）子代数量测定使用与（B）相同的线虫，将所产卵在 20 °C 下培养 2 天以完成孵化，统计所有孵化出的子代数量。*** = 通过非参数 Mann-Whitney 检验计算得到 p &lt; 0.001。每个点代表一条线虫，线条表示中位数和四分位间距。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Kaplan-Meier生存分析，不同处理条件下的寿命曲线；图表；研究研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：应激韧性作为生物体健康的代理指标。 (A) 在空载体RNAi细菌上培养的N2动物的生存分析 20 °C. 将动物转移至含有1% DMSO或10 ng/的培养板中，µL 衣霉素（TM），或 25 ng/µL 成年第1天的TM。B) 在空载体RNAi细菌上培养的N2动物的生存分析 20 °C动物在含有水、0.25 mM 百草枯（PQ）或 4 mM PQ 的平板上从孵化开始培养。对于 A-B每隔2天记录一次动物的死亡情况，直至所有动物死亡或被删失。若动物出现阴门膨出、突出或破裂，或爬至培养皿侧壁而干枯死亡，则予以删失处理。所有统计分析均采用Log-Rank Mantel-Cox检验进行。表2). (C) 所有数据的汇总 37 °C 野生型N2动物与过表达株的耐热性检测 hsf-1 (sur-5p::hsf-1）。数据表示在热耐受实验中时间为9小时时的存活百分比，每条线代表同一天进行的匹配实验。动物在空载体RNAi细菌上培养 20 °C 并转移到 37 °C 在成虫期第1天进行检测。每菌株每重复使用60只动物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂</td>
			<td colspan="3">配方</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>漂白液</td>
			<td colspan="3">1.8% (v/v) 次氯酸钠，0.375 M KOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>羧苄青霉素</td>
			<td colspan="3">100 mg/mL 储存液（1000倍），溶于水。4 °C 可保存最多6个月，或 -20 °C 长期保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUDR</td>
			<td colspan="3">10 mg/mL 水溶液。-20 °C 保存。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td colspan="3">1 M 水溶液。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶菌肉汤（LB）</td>
			<td colspan="3">本实验方案中使用商业 LB 培养基（见材料表），但所有使用 Bacto-tryptone、酵母提取物和 NaCl 配制的标准自制 LB 培养基均可使用。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 溶液</td>
			<td colspan="3">22 mM KH2PO4（酸式磷酸盐），42.3 mM Na2HPO4，85.6 mM NaCl，1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>线虫生长培养基（NGM）</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM RNAi 平板</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl，1 mM IPTG，100 µg/mL 羧苄青霉素/氨苄青霉素。4 °C 避光保存，最多3个月</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM RNAi DMSO</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl，1 mM IPTG，100 µg/mL 羧苄青霉素/氨苄青霉素；1% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>（衣霉素对照）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGM RNAi TM</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl2，5 µg/mL 胆固醇，25 mM KPO4（pH 6.0），1 mM MgSO4，2% (w/v) 琼脂，0.25% (w/v) Bacto-Peptone，51.3 mM NaCl，1 mM IPTG，100 µg/mL 羧苄青霉素/氨苄青霉素；1% DMSO，25 ng/µL 衣霉素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>百草枯</td>
			<td colspan="3">400 mM 水溶液——需新鲜配制</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>四环素</td>
			<td colspan="3">10 mg/mL 储存液（500倍），溶于100%乙醇。-20 °C 保存</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>衣霉素</td>
			<td colspan="3">2.5 mg/mL 储存液，溶于100% DMSO。-80 °C 长期保存。此为100倍浓缩液（工作浓度为25 ng/µL）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 实验方案中试剂与培养基的配制配方。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>对应图版</td>
			<td colspan="2">菌株、处理</td>
			<td>中位寿命</td>
			<td>死亡数/总数</td>
			<td>p值 
			(对数秩检验)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1A</td>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C</td>
			<td>17</td>
			<td>74/120</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，hsf-1 RNAi，20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>65/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1B</td>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，FUDR，20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>120/120</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，hsf-1 RNAi，FUDR，20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>116/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1C</td>
			<td colspan="2">N2，glp-4(bn2)，空载RNAi，25 °C</td>
			<td>13</td>
			<td>115/121</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，glp-4(bn2)，hsf-1 RNAi，25 °C</td>
			<td>4</td>
			<td>120/120</td>
			<td>&lt; 0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">2A</td>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C，1% DMSO</td>
			<td>19</td>
			<td>85/120</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C，10 ng/µL 衣霉素</td>
			<td>15</td>
			<td>109/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C，25 ng/µL 衣霉素</td>
			<td>12</td>
			<td>117/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">2B</td>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>84/120</td>
			<td>--</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C，0.25 mM 百草枯</td>
			<td>24</td>
			<td>91/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">N2，空载RNAi，20 °C，4 mM 百草枯</td>
			<td>6</td>
			<td>50/120</td>
			<td>&lt;0.001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 寿命与应激韧性统计结果。

Caenorhabditis elegans 是一种优秀的模式生物系统，具有高效且低成本的方法，可用于评估健康寿命、寿命以及对压力的恢复力。

秀丽隐杆线虫作为一种模式生物的发现与开发对生物学领域产生了重要影响，尤其是在衰老研究领域。许多……

本方案介绍了利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究衰老的最低成本和最低技术要求的方法。秀丽隐杆线虫是衰老生物学中一种具有重要影响的模式生物。这些方法的最大优势在于易于实施，仅需使用低成本的设备和材料。使其适用于任何研究人员，无论其经验或可用资金如何。在衰老研究中，由于种群内部健康状况存在自然变异性，因此必须在健康、营养充足且高度同步的动物个体上进行实验。为确保抑制细菌生长，请开始制备一升线虫生长培养基（NGM 琼脂平板）。在装有搅拌子的一升锥形瓶中加入 2.5 克蛋白胨、3.0 克氯化钠和 20 克琼脂，再加入蒸馏水至终体积为 970 毫升。使用标准高压灭菌器或培养基灭菌设备对一升锥形瓶中的 NGM 琼脂溶液进行灭菌。 让溶液搅拌至冷却至 60 至 75 摄氏度。在溶液冷却的同时，将珠浴加热至 65 至 70 摄氏度。当 NGM 琼脂溶液冷却至 60 至 75 摄氏度时。加入液体添加剂，使溶液完全混合五分钟。然后将烧瓶浸入65至70摄氏度的玻璃珠浴中，以防止培养基在倒入培养皿时凝固。将九至十一毫升溶液移液至每个60毫升培养皿中。完成后，将移液管放回加热的溶液中以维持温度，并防止培养基在移液管内凝固。对所有培养皿重复此操作，并让NGM平板在室温下静置过夜使其完全凝固。凝固后，可用于接种细菌以准备线虫培养，或将其置于密封容器中，在4摄氏度条件下保存最多三个月，用于后续通过漂白法同步线虫。用移液管吸取少量M9溶液，加入含有线虫的培养皿中，注意不要过满。然后轻轻旋转M9溶液，使线虫从细菌菌苔上脱落。接着，用血清移液管将成年怀卵成虫收集至15毫升离心管中。避免用移液器枪头刺穿螺旋推进器。以1100 × g离心30秒使线虫沉淀，吸除上清液。向线虫沉淀中加入5 mL freshly prepared bleaching solution，每隔几分钟在解剖显微镜下检查线虫，并伴随间歇性剧烈振荡，直至所有成虫虫体完全溶解，仅剩卵存在于混合液中。接下来，将卵的漂白混合液在1100 × g条件下离心30秒，使卵沉淀，并吸除漂白液。然后加入最多15 mL M9溶液洗涤沉淀的卵，将离心管颠倒4至5次，使卵和溶液充分混匀。再次在1100 × g条件下离心30秒，使卵沉淀，并吸除M9溶液。洗涤步骤重复四次，以彻底去除卵混合物中的次氯酸钠。第四次洗涤后，根据漂白的线虫总数，将M9溶液从100微升减少至2毫升。充分振荡卵液，打散团块，确保卵在M9溶液中完全重悬。或者，可通过向15毫升离心管中的卵沉淀加入10至12毫升M9溶液，使动物处于L1期停滞状态，以实现更紧密的时间同步。将线虫置于旋转仪中，在20°C下旋转孵育长达24小时。为估算卵或L1期幼虫的浓度，可将4微升卵混合液用移液器点样至铺有细菌的NGM平板上。然后计数并计算每微升培养基中的卵数。根据估算结果重复计数三到四次以提高准确性，并根据估算结果将适量的卵或L1期停滞的线虫接种到接种了所选细菌的NGM琼脂平板上。通过记录线虫的摆动行为来测量其运动能力。在解剖显微镜下，将少量第一天成虫期的线虫从NGM琼脂平板转移至10至20微升的M9溶液中。每次聚焦于一条线虫，记录其在15秒内从凹形变为凸形的次数。使用手动计数器和计时器，对10至15条线虫重复该操作。将线虫培养至目标年龄，并在所有目标年龄重复颤动频率的测量。如图所示，年老的线虫颤动速度显著减慢。用于数量和繁殖力的测量。在10至15只秀丽隐杆线虫中，挑选出L4期的线虫，转移至一个接种了所选细菌的NGM琼脂平板上。将线虫在20摄氏度条件下培养过夜，并确保准备好新接种的平板以供次日使用。为测量秀丽隐杆线虫产卵数量，每12至24小时将成虫转移至一个接种了相同细菌的新鲜NGM琼脂平板上，持续七至八天，或直至不再观察到产卵为止，并统计各平板上的产卵数量。为了测量秀丽隐杆线虫的子代数量，将成年线虫每隔12至24小时或7至8天转移至接种有细菌的新鲜NGM琼脂平板上，直至不再观察到子代。将所有含有卵的平板置于20°C条件下培养。在线虫转移两天后进行观察。统计平板上发育的子代。计数所有处于L四幼虫阶段或更早阶段的存活和正在发育的线虫，以确保F二世代不会干扰实验结果。计数时将所有线虫从平板上移除。在再次计数前，将培养板继续维持一到两天，以确保不会遗漏任何孵化或发育延迟的个体。不同消毒方法对野生型 N2 线虫寿命的影响显示，生长在 NGM 螺旋平板上的线虫寿命变化与生长在 NGM 螺旋 FUDR 平板上的线虫或生长在 NGM 螺旋平板上的 glp 四 BN2 突变体动物的寿命变化相似。短寿命的 HSF 一基因敲低动物在所有条件下均表现出寿命显著下降。与野生型对照组相比，HSF-1过表达动物的产卵数量和子代数量显著减少。部分HSF-1过表达动物表现出完全不育，表明生殖健康可能与寿命呈负相关。通过比较老年动物与年轻动物的摆动频率显著下降，摆动速率被证明是衡量衰老过程中健康状况的可靠方法。对胁迫的生存能力是衡量生物体健康状况的可靠检测方法。无论浓度如何，引起内质网应激的衣霉素均使其寿命较DMSO对照组缩短。高浓度的百草枯显著缩短了寿命，而低浓度百草枯则因毒物兴奋效应延长了寿命。在热耐受性实验中，HSF-1的过表达使生物体在37摄氏度下的热耐受性增强。以上结果均来自所有寿命与衰老相关实验。需要牢记的是，灭菌技术可能对生物体健康产生多效性影响，从而影响实验结果。如果具备相应的设备和基础设施，还可采用多种其他补充方法来测量健康寿命，包括转录、翻译、蛋白质聚集、细胞器形态以及代谢功能的检测。

surveying-low-cost-methods-to-measure-lifespan-healthspan

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

调查低成本方法，以测量秀丽隐杆线虫的寿命和健康寿命

本文介绍了一种在固体培养基上以紫外线灭活的细菌作为食物来源饲养线虫时，测定其寿命的通用实验方案。...

测量 秀丽隐杆线虫 固体培养基上的寿命测定

在本实验方案中，我们介绍了一种在96孔微孔板中测定Caenorhabditis...

测量 秀丽隐杆线虫 96孔微孔板中的寿命测定

本视频介绍了一种传统的基于平板的测量秀丽隐杆线虫（C.

寿命分析：测量 C. elegans 的寿命

本文介绍了复制集（Replica Set）方法，这是一种以高通量且稳健的方式定量测量秀丽隐杆线虫（C.

复制集方法：一种高通量定量测定秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命的实验技术

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

本文展示了一种在微加工多孔装置中的固体培养基上培养分离的单个线虫的优化方案。该方法可对单个动物整个生命周期内的多种与衰老和健康相关的表型进行监测，包括活动性、体型与形态、运动轨迹以及存活情况。...

在多孔板装置中对分离的 Caenorhabditis elegans 进行长期培养与监测

成像平台“寿命机器”（The Lifespan...

使用寿命机进行高通量行为衰老与寿命分析

我们描述了一种低成本、可配置的病态恒定器，该装置通过动态调节药物浓度，实现对抗生素耐药性的表征。该设备可与多重微流控平台集成，该方法可扩展用于实验室中的抗生素耐药性研究。...

设计和使用低成本自动化病态恒定器在抗生素药物选择压力下进行细菌的适应性进化

基于基因编码的组蛋白-miniSOG可在蓝 光依赖的方式下诱导全基因组范围内的可遗传突变。该诱变方法操作简便、速度快、无需有毒化学试剂，非常适合用于正向遗传筛选和转基因整合。...

使用组蛋白-miniSOG在C. elegans中进行光遗传学随机诱变

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。...

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

了解低成本测量秀丽隐杆线虫寿命与健康寿命的方法。本方案采用同步化、运动能力测定和繁殖力评估等技术，为衰老生物学研究提供简便易行的实验手段。

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