利用MRI、组织透明化和光片显微镜对完整新生小鼠脑进行全脑单细胞成像与分析

小鼠大脑约有一亿个细胞，全脑细胞分辨率图像的尺寸接近太字节量级，因此需要先进的图像分析工具来准确定量细胞。我们的计算流程能够对图像进行预处理，并在小鼠大脑皮层内定量细胞核，同时在细胞检测准确性、成像时间与计算资源之间保持合理的权衡。本次实验操作将由我实验室的研究生Felix Kyere和Ian Curtin进行演示。

首先，将样品安装到合适尺寸的样品 holder 中，确保样品的 z 轴方向深度不超过 5.2 毫米，以符合 UltraMicroscope II 显微镜的工作距离规格。然后将 holder 插入样品托架中，使 holder 上的螺丝与托架的支撑部分呈 45 度角。接着，将托架放置到位，使样品方向与光路垂直。

随后，将显微镜的变焦体设置为 4 倍或更高放大倍数，以获得每像素 0.75 微米的分辨率。在 Inspector Pro 软件中，选择数值孔径约为 0.08 的单个光片。为确保沿图像宽度方向保持轴向分辨率，请选择水平动态聚焦，并根据激光波长应用推荐的步数。

然后根据参考对齐通道以及各通道的激光功率特性，调节每个通道的精细聚焦。接下来，将光片宽度调整至约50%，以确保在y维度上，光片功率能够针对样本尺寸实现最优分布。随后，根据样本尺寸设置拼接图像（tiles）的数量，建议相邻图像间重叠15%，并在每个拼接位置处，按顺序对每层图像的各个通道逐个进行成像采集。

首先，下载并安装适用于 Linux 的 Conda 环境管理器和 NuMorph 图像处理工具。在命令行中，从 NuMorph 运行 matlab 和 NM_setup.m，以下载并安装分析所需的图像分析软件包。

然后通过编辑文件 NM_samples.m 来指定样本名称、输入和输出目录、通道信息以及光片成像参数。进行强度调整时，在 NMp_template 中将 intense 调整设为 true，并在处理一组新图像时将 use_processed_images 设为 false。接下来，将 save_images 和 save_samples 均设为 true。

接下来，将拼接图像的明暗校正模式设置为“basic”，以使用基本算法进行明暗校正；或设置为“manual”，以利用UltraMicroscope II在特定光片宽度下的测量值进行拼接图像明暗校正。对于图像通道对齐，在NMp_template中将channel_alignment设置为true，并将channel_alignment_method设置为translation（平移）或elastics（弹性变形）。接下来，将sift_refinement设置为true，并将重叠值设为0.15，以匹配成像过程中的拼接区域重叠部分。

在 MATLAB 中运行预处理步骤时，需指定样本名称并将配置设置为 NM_config 以处理样本。然后通过指定 NM_process config stitch 来运行任意预处理步骤，同时使用 intensity、align 或 stitch 指定阶段，并检查各阶段输出目录中的输出文件。起始数据包括一个 3D 图谱图像以及对应的标注图像，后者将每个体素分配给特定的结构。

对齐Atlas图像和注释文件，以确保它们在正确的方向上准确匹配。对齐后，按照论文中所述执行命令，在NuMorph中处理文件并指定输入。在NMa_template中，将resample_images设置为true，并将resample_resolution设置为与Atlas一致。

然后使用 resample_channels 指定需重采样的通道编号。随后，将 register_images 设为 true，指定 atlas_file 以匹配 Atlas 目录中的文件，并将 registration_parameters 设为默认值。然后将 save_registered_images 设为 true。

对于细胞核检测、细胞计数和分类，需将 count_nuclei 和 classify_cells 均设为 true。然后将 count_method 设置为 3dunet，并设置 min_intensity 以定义检测对象的最低强度阈值。接下来，将 classify_method 设置为 threshold（基于质心位置的非监督荧光强度）或 SVM（构建监督式线性支持向量机分类器）。

在 MATLAB 中执行分析步骤时，需指定样本名称，并将配置设置为 NM_config analyze sample。接着，通过指定 NM_analyze config stage 并使用 resample、register、count 或 classify 来设定阶段，运行任意分析步骤，并检查各阶段输出目录中的输出文件。在 NMe_template 中，将 update 设置为 true，并将 compare_structures_by 设置为 index。

然后设置模板文件和结构表，结构表中需指定所有可能的结构索引及待评估的结构，同时定义细胞计数和细胞类型分类。采用iDISCO+方案进行组织透明化处理，并结合神经元层特异性核标记物，可在同型皮层中清晰区分上层和下层神经元的细胞群。NuMorph进行的细胞计数依赖于成功的预处理步骤，包括信号强度调整、通道对齐和图像拼接。

然而，预处理步骤中的错误可能导致拼接不当，从而引起错位和拼接错误，最终产生部分区域在焦内、部分区域在焦外的图像模式。为了从特定脑区计数细胞核，将使用图谱（Atlas）对拼接后的图像进行标注，使标注能够叠加在相应的脑区上。细胞核的中心位置通过 NuMorph 中训练好的 3D U-Net 模型进行检测，在同型皮层中总共检测到约 1200 万个 TO-PRO-3 阳性的细胞核，其中约 260 万个为 brain-two 阳性，160 万个为 CTIP2 阳性。

在基底神经节和海马联合皮层中，分别检测到约370万和290万个TO-PRO-3阳性的总细胞核。然而，这两个脑区中检测到的脑-2阳性细胞极少，在基底神经节和海马联合皮层中，每不到一百万个CTIP2阳性细胞中仅检测到约1.5个。在采集过程中执行视觉质量检查，以实现良好的分割效果。

并正确设置 Conda 环境，以确保下游分析中不会出现错误。除了细胞计数外，该流程还可与其它用于测量细胞大小和形状的分割工具整合，进而可在不同基因型组间进行比较。通过我们的流程，我们能够在细胞分辨率水平上识别脑解剖结构的变化，从而鉴定出与疾病风险相关的重要细胞类型和脑区。