Name: 鼻腔博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 46 s
Description: 了解通过鼻腔博来霉素雾化给药建立肺纤维化小鼠模型的方法。该模型可实现药物在肺部的均匀分布，模拟临床疾病特征，有助于研究肺纤维化的发病机制及药物靶向策略。

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本工作得到国家自然科学基金（编号：92068108）的资助。

中日友好医院（中国北京）动物实验伦理委员会批准了本研究中涉及小鼠的所有实验程序（编号：190108）。小鼠饲养于中日友好医院临床医学研究所的无菌动物房内，室温为20–25 °C，相对湿度为40%–70%，动物照度为15–20 LX，光照与黑暗交替各12小时。动物可自由获取食物和饮水。
1. 小鼠
<ol>
	<li>确保所有动物在雾化前已在饲养设施中适应环境7天。</li>
	<li>使用8至10周龄的雄性C57BL/6小鼠进行雾化。</li>
</ol>
2. 鼻内博来霉素雾化
<ol>
	<li>博来霉素制备 
	注意：博来霉素（BLM）是一种化学毒物，可杀伤肿瘤，但也可能损伤正常细胞和正常组织。
	<ol>
		<li>在洁净工作台中配制BLM溶液。
		<ol>
			<li>为获得工作浓度（7 U/mL），将15 U的盐酸博来霉素溶于2.14 mL生理盐水中。轻轻混匀复溶后的BLM，直至完全溶解。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将工作液置于4 °C或冰上保存，并在1天内使用。雾化前将BLM溶液恢复至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>通过将0.1 g戊巴比妥钠溶解于10 mL生理盐水中来配制麻醉液。将配制好的麻醉工作液储存在避光、4 °C环境中，3天内使用完毕。</li>
		<li>使用1 mL注射器配合26 G针头，向小鼠腹腔注射戊巴比妥钠，按75 mg/kg体重的终剂量进行麻醉。 
		注：本研究中，小鼠对该剂量的反应持续时间不少于30分钟。如有必要，可根据小鼠反应在兽医指导下调整剂量。</li>
		<li>数分钟后，用食指和拇指按压麻醉小鼠的脚趾，确认其肢体回缩反射已消失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>雾化系统的准备
	<ol>
		<li>仪器校准后，用柔软的网状罩固定麻醉后的小鼠（图1A），用移液器将工作浓度的BLM溶液加入暴露塔顶部的雾化头中（图1B），运行雾化器30分钟，以实现稳定的雾化效果。 
		注：工作流程见图1C、D。软件操作的详细步骤请参见补充图S1和补充图S2，其中展示了步骤2.3.1.1–2.3.1.9的具体内容。
		<ol>
			<li>双击flexiWare 8图标（补充图S1A），点击experimentation session（补充图S1B），然后点击New Study按钮（补充图S1C）。</li>
			<li>编辑实验名称（补充图S1D），并编辑标题和负责人（补充图S1E）。</li>
			<li>选择IX-4DIO模板（补充图S1F），输入操作员信息（补充图S1G），点击确认按钮（补充图S1H）| 下一步按钮（补充图S1I）。</li>
			<li>选择泵，然后依次点击下一步（补充图S1J）| 下一步（补充图S2A）| 下一步（补充图S2B）| 完成按钮（补充图S2C）。</li>
			<li>点击Continuous-1Lmin的设置（三个点，补充图S2D）| DIO1，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2E）。</li>
			<li>点击DIO2，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2F）。</li>
			<li>点击DIO3，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2G）。</li>
			<li>点击DIO4，将占空比（%）设为25%，然后点击确定（补充图S2H）。</li>
			<li>点击左侧的顶部绿色按钮开始运行，点击右侧的红色按钮停止工作。点击右上角的x退出程序（补充图S2I）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在BLM组中，每次雾化12只小鼠，共进行四次，总计48只小鼠。在正常对照组中，每次使用生理盐水雾化6只小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动物恢复
	<ol>
		<li>在雾化器中处理30分钟后，将小鼠转移至配备加热垫的恢复笼中。</li>
		<li>观察小鼠直至其完全清醒。</li>
		<li>确认小鼠状态良好（即能够自由活动）后，将其放回原笼。在完全恢复前，不得将其与其他动物同笼饲养。</li>
		<li>在BLM处理后的24小时内，每天两次检查生理指标，包括呼吸频率、存活情况及任何症状。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肺组织处理
<ol>
	<li>在第9、16和23天&#160;在给予博来霉素（BLM）数天后，通过腹腔注射戊巴比妥钠（终剂量为100 mg/kg体重）处死6只小鼠。</li>
	<li>取出气管和肺，并立即用冷的磷酸盐缓冲液冲洗。</li>
	<li>将左肺置于10%中性福尔马林缓冲液中固定24小时，然后进行石蜡包埋。</li>
	<li>苏木精-伊红染色（H&amp;#38;E染色）
	<ol>
		<li>将固定的肺组织在脱水机中进行脱水。</li>
		<li>将脱水的肺组织块置于56 °C的融蜡盒中1 h。</li>
		<li>包埋时，将熔化的石蜡倒入模具盒中，然后迅速将浸透石蜡的组织块置于模具盒底部，冷却并凝固。</li>
		<li>将包埋的蜡块固定在切片机上，上下调节切片台至适当位置，推进刀片，调整刻度，切出厚度为4 µm的切片。用镊子将切片放入盛有水的展片盒中（正面朝上）以展平。</li>
		<li>修补并烘烤切片。当石蜡切片完全展平后，以135°角将载玻片贴近石蜡切片，用镊子将切片移至载玻片上，提起载玻片，并根据需要调整石蜡切片的位置。将贴好切片的载玻片置于47 °C恒温台上1 min，使切片再次充分展平；待切片完全平整后，将载玻片放入62 °C培养箱中孵育1 h。</li>
		<li>脱蜡：将烘烤后的切片先后浸入二甲苯中，每次20分钟，共两次。</li>
		<li>用于复水，将切片置于梯度酒精系列中以复水肺组织切片：100% 酒精中 2 分钟，95% 酒精中 1 分钟，90% 酒精中 1 分钟，85% 酒精中 1 分钟，75% 酒精中 1 分钟，最后置于蒸馏水中 3 分钟&#160;最小</li>
		<li>将切片置于苏木精染液中染色5分钟，用流水冲洗1分钟，重复两次；然后放入0.5%盐酸酒精分化液中5秒，再用流水冲洗1分钟，重复两次；接着置于蓝染液中8–10秒，用自来水冲洗两次；最后用伊红染色30秒。</li>
		<li>染色后脱水与脱色：将染色切片依次置于75%乙醇中1分钟、85%乙醇中1分钟、90%乙醇中1分钟、95%乙醇中1分钟、100%乙醇中1分钟，再放入二甲苯中2次，每次1分钟，最后用吸水纸吸去所有残留液体。</li>
		<li>封片时，在切片中央滴加一滴中性树胶封片剂，然后盖上盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠肺组织形态学分级标准
	<ol>
		<li>根据 Ashcroft 等人描述的方法，由一名对实验分组不知情的研究人员从每个样本中随机选取三个显微视野，在100倍放大下观察肺纤维化程度：0级，肺组织正常；1级，肺泡轻度肿胀，局部轻度纤维化；2级，明显纤维化（肺泡壁厚度超过正常的三倍），伴有纤维灶；3级，连续性纤维化区域（肺泡壁厚度为正常的三倍以上）；4级，纤维灶融合，纤维化区域占肺组织面积不足10%；5级，纤维灶融合，纤维化区域占10%至50%，肺泡结构显著破坏；6级，大范围连续纤维灶（占肺组织面积大于50%）；7级，肺泡腔被纤维组织填充，出现肺大疱；8级，完全纤维化。</li>
		<li>为每个视野分配与等级相对应的分数（例如，等级4等于4分），并对每组六个样本分别评分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Raghu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+idiopathic+pulmonary+fibrosis.+An+official+ATS%2FERS%2FJRS%2FALAT+clinical+practice+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of idiopathic pulmonary fibrosis. An official ATS/ERS/JRS/ALAT clinical practice guideline.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 198 (5), e44-e68 (2018).</li>
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<li>Jenkins, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+thoracic+society+workshop+report%3A+use+of+animal+models+for+the+preclinical+assessment+of+potential+therapies+for+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An official American thoracic society workshop report: use of animal models for the preclinical assessment of potential therapies for pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (5), 667-679 (2017).</li>
<li>Moeller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bleomycin+animal+model%3A+A+useful+tool+to+investigate+treatment+options+for+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The bleomycin animal model: A useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

经气管注射博来霉素可在双肺诱发急性炎症和纤维化反应，可被视为建立人类间质性肺疾病实验小鼠模型的有效方法。经气管给药是最常用的给药途径。2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12药物进入气管后，通过直立旋转使博来霉素在肺组织中均匀分布，从而导致肺部一致性的纤维化。博来霉素可被给予 通过</e...

肺纤维化是一种进行性疾病，其特征是肺间质中细胞外基质成分（主要为I型胶原）过度沉积，导致肺功能受损1。肺纤维化的病理生理机制复杂，目前的治疗选择十分有限。小鼠模型仍是研究该疾病发生与发展相关致病机制以及新药研发策略的重要工具。
多种肺纤维化动物模型依赖于博来霉素的气管内灌注2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12然而，博来霉素（BLM）在肺部引起的纤维化改变分布并不均匀，且动物在灌注过程中存在窒息风险。尽管腹腔注射BLM可诱导肺部产生相对均匀的纤维化改变，但由于药物靶向性不足，需要多次给药。经气管雾化给药 通过 喉镜给药无需气管切开或穿刺，药物在肺部的分布效果最佳。然而，气溶胶颗粒较大（5–40 µm），因此无法到达肺组织的胸膜下区域。
本研究通过鼻腔雾化给予博来霉素（BLM）。雾化过程中，小鼠自主呼吸并吸入药物颗粒。雾化颗粒的大小为2.5–4 µm，不仅可在肺内均匀分布，还能到达胸膜下区域。在低倍镜下，特发性肺纤维化（IPF）患者最显著的肺组织病理学特征包括：病变程度不一、分布不均、不同阶段的病变呈交替分布，以及间质性炎症、纤维化病变和蜂窝肺改变与正常肺组织交替存在。这些病理改变主要累及外周胸膜下实质或细支气管周围的肺小叶间隔。因此，由于该方法能使BLM颗粒到达肺部胸膜下区域，该模型能够很好地模拟人类疾病的临床特征。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;博来霉素</td><td>Bioway/Nippon Kayaku Co Ltd</td><td>&amp;nbsp;DP721</td><td>纤维化模型药物</td></tr><tr><td>注射用0.9%生理盐水</td><td>贝朗医疗（天津）有限公司</td><td></td><td>博来霉素配制</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>BD</td><td>300481</td><td>动物麻醉</td></tr><tr><td>10%中性福尔马林缓冲液</td><td>泰和立达生物科技有限公司</td><td></td><td>肺组织固定</td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>麻醉前准备</td></tr><tr><td>20 &amp;deg;C冰箱</td><td>New-fly集团</td><td>BCD-213K</td><td>药物储存</td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C冰箱</td><td>New-fly集团</td><td>BCD-213K</td><td>药物储存</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC2020</td><td>Adobe</td><td></td><td>图像处理</td></tr><tr><td>蓝色背衬液</td><td>北京化工厂</td><td></td><td>组织染色</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>苏州苏洁净化设备有限公司</td><td></td><td>博来霉素配制</td></tr><tr><td>分化液</td><td>北京化工厂</td><td></td><td>组织染色</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>AA-160</td><td>麻醉前准备</td></tr><tr><td>伊红染液</td><td>北京益利精细化学品有限公司</td><td></td><td>组织染色</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>HIDOM</td><td></td><td>小鼠孵育</td></tr><tr><td>苏木精染液</td><td>北京益利精细化学品有限公司</td><td></td><td>组织染色</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>清洗肺组织</td></tr><tr><td>Photoshop绘图软件</td><td>Adobe</td><td></td><td>图像处理</td></tr><tr><td>SCIREQ INEXPOSE</td><td>EMKA生物技术（北京）有限公司</td><td></td><td>雾化装置</td></tr><tr><td>正置荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>观察切片</td></tr></tbody></table>

通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

A Mouse Model of Pulmonary Fibrosis Induced by Nasal Bleomycin Nebulization

肺纤维化是多种人类肺部疾病的特征，这些疾病由不同病因引起。由于治疗选择较为有限，小鼠模型仍然是开发新型抗纤维化策略的重要工具。本研究通过鼻腔雾化给予博来霉素（BLM），建立一种能紧密模拟临床疾病特征的肺纤维化小鼠模型。C57BL/6小鼠通过鼻腔雾化接受BLM（7 U/mL，每日30分钟），连续给药3天，并于第9、16或23天处死，以观察肺组织中的炎症和纤维化变化。经鼻腔雾化的BLM直接作用于肺部，导致广泛且均匀的肺部炎症和纤维化。因此，我们成功构建了一种典型的人类肺纤维化实验小鼠模型。该方法可广泛用于研究不同鼻腔雾化制剂对肺部病理生理的影响，并可用于验证新型抗炎和抗纤维化治疗手段。

通过雾化博来霉素（BLM）诱导肺损伤，对照组动物则雾化等体积的生理盐水。小鼠每天雾化一次，每次30分钟，连续3天，BLM浓度为7 U/mL。在给予BLM后的第9、16和23天处死小鼠，进行H&amp;E染色（图2B）。与对照组小鼠相比，接受BLM的小鼠肺组织中出现弥散性肺炎性病变，表现为正常肺泡结构丧失、间隔增厚、肺泡扩大，以及间质和支气管周围区域炎性细胞浸润增加。通过观察显微镜下视野，评估每份肺组织切片中纤维化改变的严重程度，并以平均严重程度评分（Ashcroft评分）表示。BLM-D9、BLM-D16和BLM-D23组小鼠的Ashcroft评分均高于对照组小鼠（图2C）。
<img alt="静力平衡；轴实验装置；应力分析；示意图与实验室实验配置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64097/64097fig01.jpg" data-altupdatedat="178828245...

已采用博来霉素建立多种肺纤维化动物模型，以阐明肺纤维化的发病机制并寻找新的药物靶点。然而，大多数针对肺组织的肺纤维化模型存在药物分布不均的问题。本文提出一种通过鼻腔雾化博来霉素诱导的均匀性肺纤维化模型。

肺纤维化是多种病因所致人类肺部疾病的特征。鉴于治疗选择较为有限，小鼠……

本研究通过鼻腔雾化给予博来霉素进行肺间给药，以建立一种肺纤维化小鼠模型，该模型可高度模拟临床疾病的特征。麻醉小鼠后，用食指和拇指按压其足趾，以确认肢体回缩反射已消失。仪器校准后，使用柔软的网状覆盖物固定麻醉的小鼠。使用移液器将工作浓度的 BLM 溶液加入暴露塔顶部的雾化头中，并运行雾化器 30 分钟，以实现稳定的雾化。现在双击 FlexiWare 8 图标，选择实验会话，然后点击新建研究按钮。编辑实验名称、标题和所有者。然后选择 IX-4DIO 模板。输入操作员信息，然后点击确认按钮。在欢迎窗口中，单击“下一步”。在泵选择窗口中，选择“泵”选项卡，然后单击“下一步”。这将进入名为“测试设置-泵 4”的窗口。单击“下一步”按钮，将弹出泵输出调整窗口，然后再次单击“下一步”。接着在“结果-泵4”窗口中单击“完成”按钮。单击“连续1L/min”的设置。选择 DIO1 并将占空比设置为 25%。然后单击“确定”，并依次设置 DIO2、DIO3 和 DIO4 的占空比百分比。现在单击顶部的绿色按钮开始实验程序，单击红色按钮停止。单击右上角的 X 退出。与对照组相比，BLM处理的小鼠肺部出现弥散性肺炎性病变，表现为正常肺泡结构丧失、间隔增厚、肺泡扩大，以及间质和支气管周围区域炎性细胞浸润增加。BLM组小鼠在第9、16和23天的Ashcroft评分均高于对照组。气溶胶颗粒的粒径为2.5至4微米，可使博来霉素在肺内均匀分布，并到达胸膜下区域。

a-mouse-model-pulmonary-fibrosis-induced-nasal-bleomycin

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

鼻腔博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

本文介绍了一种通过插管将博来霉素直接注入小鼠气管的快速简便方法。该方法的主要优点在于具有高度可重复性、易于掌握，且无需特殊设备或漫长的恢复时间。...

一种改进的小鼠气管快速插管方法

我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。...

一种基于显微CT与荧光分子断层成像的多模态成像方法用于小鼠博来霉素诱导肺纤维化的纵向评估

本文介绍了一种有效的方法，用于研究经尾静脉输注来源于C57BL/6小鼠脐带全长的人类间充质基质细胞在博来霉素经气管注射诱导肺损伤后所表现出的抗纤维化活性。该方案可轻松扩展应用于其他治疗药物的临床前测试。...

经气管注射博来霉素诱导小鼠肺损伤

本文介绍了通过向气道注射博来霉素建立与肺纤维化相关的肺动脉高压（PF-PH）大鼠模型的方法。同时提供了对该动物模型进行验证的逐步操作流程。...

建立并验证与肺纤维化相关的肺动脉高压大鼠模型

本方案演示了在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中应用的经口咽部吸入技术。...

小鼠肺纤维化模型中博来霉素的口咽部给药

本方案阐述了一种通过反复经口咽给予博来霉素在小鼠中诱导肺纤维化的方法，所产生的病理特征与特发性肺纤维化高度相似。...

改良的小鼠特发性肺纤维化模型

在此，我们介绍一种通过气溶胶化博来霉素递送在小鼠中建立肺纤维化模型的实验方案 通过 气管。该优化方法能够在无需手术切口的情况下实现均匀、定量且精确的递送，从而提高博来霉素诱导纤维化的可重复性和可靠性。...

一种改进的基于气溶胶的经气管博来霉素递送方法，用于建立可重复且微创的小鼠肺纤维化模型

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内...

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

在小鼠中每72小时重复进行眶后静脉注射阳离子脂质体/siRNA/ITSN-1s复合物，持续24天，可高效将siRNA双链递送至小鼠肺微血管系统，使ITSN-1s的mRNA和蛋白表达水平降低75%。该技术在动物模型中具有高度可重复性，无不良反应，且不会导致动物死亡。...

通过阳离子脂质体重复递送特异性siRNA实现小鼠肺组织中Intersectin-1s的长期沉默。利用电子显微镜评估基因敲低效果

关键词：Intersectin-1s，siRNA，阳离子脂质体，肺组织，基因沉默，电子显微镜，基因敲低

了解通过鼻腔博来霉素雾化给药建立肺纤维化小鼠模型的方法。该模型可实现药物在肺部的均匀分布，模拟临床疾病特征，有助于研究肺纤维化的发病机制及药物靶向策略。

通过鼻内博来霉素雾化诱导的肺纤维化小鼠模型

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