Name: 剥离印迹技术:一种冷冻电镜样品制备方法，用于从多层或浓缩生物样品中分离单层 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学习剥离印迹技术，这是一种冷冻电镜样品制备方法，可将多层浓缩生物样品分离为单层，降低厚度并提高浓度，从而促进图像处理和高通量数据采集。

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本工作的部分研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL090630（ISK）的资助。

1. 剥离印迹技术的准备步骤
注意：准备过程中需将以下物品放置在彼此相邻的位置。
<ol>
	<li>叠加两片孔径为 20–25 µm 的滤纸（参见材料表）。</li>
	<li>将一片长约 8 cm × 10 cm 的石蜡膜放置在滤纸旁边，滤纸朝上。</li>
	<li>将一片亚微米级滤纸置于另外两片 #4 滤纸之上（图 1-1）。</li>
	<li>将防反毛细管镊子放置成弯曲端朝上、直端朝下。然后选择一片光滑/有光泽面朝上的 600 目载网。将镊子置于培养皿或其他抬高的表面上，以避免洁净载网接触其他物品。</li>
	<li>从石蜡膜上取下纸片，并拉伸两侧（约 5 mm）形成一个小边缘。用移液器在石蜡膜一端短边约 1–2 cm 处滴加两滴 150 µL 的 4% 海藻糖溶液，两滴之间相距约 1 cm。</li>
	<li>在另一个实验台或地面上，将液氮倒入一个小的聚苯乙烯泡沫容器中（参见材料表）。 
	注意：必须接受相关培训，并佩戴手套和面罩，以防冻伤。</li>
	<li>将一个小型冷冻电镜载网盒放入液氮中，并用无尘擦拭布盖住聚苯乙烯泡沫容器。</li>
</ol>
2. 将碳膜放置到载网上
<ol>
	<li>使用Dumont #5镊子（见材料表）将碳膜从云母片上漂浮下来：将云母片一侧以轻微向下倾斜的角度（约20°–40°）接触海藻糖溶液液滴的一侧，缓慢向下移动云母片，利用水的表面张力使碳膜脱离云母片。当碳膜漂浮在液滴表面时，松开云母片。</li>
	<li>目视检查碳膜，避免使用带有裂纹等损伤的碳膜。</li>
	<li>用抗毛细作用力镊子夹住载网，以一定角度（约20°–30°）插入邻近碳膜下方的海藻糖液滴中，随后将载网中心对准碳膜下方，拾取碳膜（图1-2）。</li>
	<li>保持载网方向不变，缓慢将其放入第二个海藻糖液滴的表面，注意不要破坏液滴的表面张力，以去除可能缠绕在载网边缘并附着于粗糙面的多余碳膜。</li>
</ol>
3. 将多层二维晶体分离为单层
<ol>
	<li>旋转防毛细管镊子（参见材料表），将其放置在培养皿中，使载网的碳膜面朝下（图1-3）。</li>
	<li>用移液器吸取1.3 µL样品，加入到载网上方微小的海藻糖弯月面中。将溶液上下吹打约8–10次，以混合并使海藻糖和样品均匀分布在载网两侧。</li>
	<li>在溶液孵育1分钟的同时，将一滴或多滴1.7 µL海藻糖溶液滴加到石蜡膜上。</li>
	<li>将载网旋转回原始位置，使碳膜面朝上。</li>
	<li>使用防毛细管镊子将载网压在亚微米滤纸上（图1-4）。待滤纸吸收溶液且碳膜完全展平后，等待3秒，然后提起载网并垂直转移至1.7 µL海藻糖溶液液滴中（图1-5）。 
	注意：对于高度堆积的样品，需重复此步骤多次；否则，载网即可进入下一步的玻璃化冷冻制备。</li>
	<li>将载网在两片滤纸上轻轻吸去多余液体，然后从滤纸上提起载网（图1-6）。根据湿度和样品缓冲液的不同，大约13秒后，将载网迅速浸入小型聚苯乙烯泡沫容器中的液氮中，并将载网放入冷冻电镜载网盒中，或直接用于冷冻电镜筛选或数据采集。 
	注意：为快速优化实验方案，此步骤可对剥离后吸滤的载网进行负染色处理，而非将其浸入液氮。负染色方法为：在载网上加入3 µL 1% 醋酸铀溶液，孵育30秒，然后用撕成小块的20–25 µm孔径滤纸吸去多余染液。在海藻糖、单宁酸或葡萄糖中玻璃化的二维晶体载网通常采用手动浸入法进行冷冻，因为海藻糖、单宁酸和葡萄糖可在手动浸入的冷却速率下抑制结晶冰的形成2。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

作者不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

剥离印迹法是一种强大的方法，可用于克服多层二维晶体及类似样品在冷冻电镜数据采集和图像处理过程中存在的堆叠和厚度问题。是否使用剥离印迹法需根据样品的生物学参数来决定，并且在获得三维冷冻电镜模型后还需进一步评估。在此评估中，相互作用界面的生物学重要性以及接触区域可能存在的柔性尤为关键。
剥离印迹的数量将首先确定 通过 标准负染网格制备后的观察，若存在过多层或过厚的情况，则需采用不同于常规冷冻电镜网格制备的替代策略。对于层间有序堆叠的薄多层晶体，可直接用于微晶电子衍射（microED）分析3&#160;或对较厚的晶体进行聚焦离子束（FIB）切削4双层二维晶体通常无需进行剥离印迹，因为当两层晶体对齐时，可单独或同时处理各层。5这种方法可能有利于在溶液中剥离印迹前以及最终剥离印迹步骤后，使膜蛋白二维晶体的两侧均暴露于配体或抑制剂。此外，减小大尺寸、高度有序的双层二维晶体的尺寸可能有助于实现电子衍射...

为了将膜蛋白的堆叠二维晶体分离成单层，从而获得适合进行冷冻电镜二维和三维数据采集的足够薄的样品，并促进图像处理，开发了剥离印迹（peel-blot）技术1。该方案同样适用于其他类型的多层膜样品，也可用于在不增加样品Z方向厚度的情况下，在载网上实现上述任一样品类型的高浓度分布。
通过结合毛细压力和剪切力，该方案在原有反向注射法的基础上进行了大幅扩展和改进，可将样品层数减少至单层2。第一步为 blotting 步骤，使用亚微米级滤纸而非反向注射法中常用的 20–25 µm 孔径滤纸，使多层样品在 blotting 过程中紧密夹在碳膜与载网金属条之间，并牢固附着。当载网垂直压在海藻糖液滴上时，夹层结构受到强制分离，碳膜被推离载网金属条，从而实现单个样品层的分离或剥离（图 1）。下一步中，将载网再次用亚微米级滤纸进行 blotting，使碳膜进一步从其最初与载网金属条的接触点移开。这些步骤的重复次数可根据具体样品进行优化。此外，该方案还可用于提高样品浓度，同时避免在 Z 方向上发生聚集。由于该方法依赖样品对载网金属条和碳膜的附着性以及强制分离过程，因此可能不适用于某些高度脆弱的分子，例如特定的不稳定蛋白或蛋白复合物。
剥印法既不需要特殊设备，也不需要昂贵的耗材。然而，针对特定样品的应用需仔细考虑生物学参数。对于二维晶体，决策较为简单，因为需要碳膜以确保平整性，但操作过程仍需谨慎。 通过 剥片印迹技术可能影响样品的生物完整性或晶体有序性。该技术适用于单颗粒样品的情况仅限于那些需要碳膜且能耐受操作处理的颗粒，且需经测试验证。对于层间存在关键生物相互作用的样品，由于该技术会破坏此类相互作用，因而可能不适用于剥片印迹技术的表征。
通过在室温下使用负染色或未染色样品进行透射电子显微镜（TEM）测试与筛选，可最快地优化剥离印迹技术（&#34;peel-blot&#34;）。一旦确定了最佳的剥离印迹循环次数，即可确定玻璃化前控制样品厚度所需的时间。

<table><tbody><tr><td>600目网格</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>防毛细作用镊子</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>用于镀覆云母的碳膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜</td><td></td><td></td><td>冷冻电镜网格可在120 kV或200 kV下进行筛选。&amp;nbsp; 高分辨率数据在300 kV下采集。</td></tr><tr><td>Dumpont #5镊子</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>冷冻电镜样品储存盒</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes擦拭纸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>云母</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>云母需镀碳膜，并切割成略大于透射电镜网格的正方形。&amp;nbsp; 碳膜厚度可能需要优化，以避免在多次剥离 blot 操作时碳膜过薄而易破裂。</td></tr><tr><td>负染</td><td></td><td></td><td>1–2% 醋酸铀适用于多种样品。&amp;nbsp; 也可使用其他染料，如磷钨酸。</td></tr><tr><td>Parafilm封口膜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯容器</td><td></td><td></td><td>用于玻璃化剥离 blot 网格。可回收聚苯乙烯运输容器，并内衬铝箔使用。</td></tr><tr><td>亚微米滤纸</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>任何在80–120 kV加速电压下运行的透射电镜均适用于负染网格的筛选。</td></tr><tr><td>海藻糖</td><td></td><td></td><td>配制4%海藻糖溶液。</td></tr><tr><td>Whatman #4滤纸</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>对应本方案中孔径为20–25 &amp;mu;m的滤纸。</td></tr></tbody></table>

剥离印迹技术：一种用于从多层或高浓度生物样品中分离单层结构的冷冻电镜样品制备方法

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

去层- blot 冷冻电镜载网制备技术是一种经过显著改进的反向注射方法，旨在减少多层样品的层数。在样品速冻之前去除部分层次，有助于将样品厚度降低至适合冷冻电镜数据采集的水平，改善样品的平整性，并促进图像处理。该去层-blot 技术可将多层膜结构分离为单层，将层状二维晶体分离为独立的晶体，同样也可将可溶性蛋白堆叠的片状结构分离成单层。这类样品通常厚度较大，给冷冻电镜数据采集和图像处理带来难以克服的困难，尤其是在需要倾斜显微镜载物台进行数据采集时更为明显。此外，利用该技术可制备出高浓度的载网样品，从而实现高效的数据采集，因为在载网制备前可提高样品浓度，并通过调整去层-blot 技术获得密集分布的单层样品。

成功的剥离印迹实验将获得通常为高浓度的单层样品。可以预期的是，在大多数网格方格中，部分区域仍会存在多层结构，尤其是在剥离印迹步骤的迭代次数较少时。然而，大多数网格方格中将出现大范围的单层区域，如人源白三烯C4合酶的二维晶体（图2）和脂质体（在步骤3.2中加入，图3）所观察到的结果。对于未表现出理想层数减少的样品，可能需要测试额外的剥离印迹步骤。
成功完成剥离印迹实验最重要的指标，是高分辨率冷冻电镜数据采集和图像处理后所观察到的数据质量和生物学完整性。在数据分析时，需要仔细考虑层间接触区域可能发生的损伤或形变。
发生剥离印迹的电镜载网区域通常比未发生该现象的区域具有更高的样品浓度。这种明显的浓缩效应是由于多层样品附着在碳膜和载网条表面所致，随后在剥离印迹制样过程中，当两表面反复分离、轻微重新定位并再次接触时，样品进一步附着于这两个表面。结果是原始多层样品的不同层被展开，分布到更大的横向区域...

peel-blot 技术是一种冷冻电镜载网制备方法，可将多层且浓集的生物样品分离为单层，从而降低样品厚度、提高样品浓度，并有助于图像处理。

剥膜印迹冷冻电镜载网制备技术是一种经过显著改进的反向注射法，旨在减少层数……

剥离印迹法可将多层且高浓度的生物冷冻电镜样品分离为单层，从而降低样品厚度、提高浓度，并有助于图像处理。在载网制备前即可提高样品浓度，且可通过调节剥离印迹步骤，获得高密度分布的单层样品，实现高效的数据采集。操作开始时，将两片孔径为20–25微米的滤纸叠放在一起，并在其旁边放置一段长的石蜡膜，滤纸朝上。将一片亚微米滤纸放在另外两片滤纸上。将防反冲镊子弯曲的一端朝上、直的一端朝下放置，并选择一个600目筛网，光滑面或有光泽的一面朝上。将镊子置于培养皿或其他抬高的表面上，以避免洁净的筛网与其他物品接触。将纸张从石蜡膜上取下，拉伸边缘以形成一个小凸缘。用移液器滴加两滴150微升的4%海藻糖溶液，距离石蜡膜一端短边约一至两厘米处。两滴溶液之间应相距约一厘米。接下来，在另一个实验台或地面上，将液氮倒入一个小型聚苯乙烯泡沫容器中，并将一个小的冷冻电镜载网容器放入液氮中。用无尘擦拭布盖住聚苯乙烯泡沫容器。为使碳膜从云母上漂浮下来，使用Dumont 5号镊子，以略微向下倾斜的角度触碰云母的一侧，将其轻触于海藻糖溶液的液滴之一上。将云母向下移动，使水的表面张力缓慢将碳膜剥离。当碳膜漂浮在液滴表面时，松开云母。目视检查碳膜，避免使用带有裂纹等损伤的碳膜。用防毛细作用的镊子夹住载网，以20-30度的角度插入海藻糖液滴中，位置应紧邻碳膜下方，然后将载网置于碳膜正下方中心位置。拾取碳膜时保持载网方向不变，并缓慢将载网降至第二滴海藻糖液滴表面，避免破坏液滴的表面张力。此操作可去除可能包裹在载网边缘并延伸至粗糙面的多余碳膜。旋转防毛细作用镊子，将载网碳膜面朝下放置于培养皿中。用移液器吸取1.3 µL样品，加入载网上方轻微凸起的海藻糖弯月面中。然后，将溶液上下吹打约8–10次，以混合并使海藻糖和样品均匀分布在载网两侧。将样品海藻糖溶液在载网上孵育1分钟的同时，用移液器吸取一滴或多滴1.7微升的海藻糖溶液滴加到石蜡膜上。将载网旋转回初始位置，使碳膜朝上，用抗毛细作用镊子将载网压在亚微米滤纸上。待溶液被滤纸吸收且碳膜完全展平后，等待3秒，然后提起载网，垂直转移至1.7微升的海藻糖溶液液滴上。根据样品情况，这些步骤可重复一至三次或更多次。将载网在两张滤纸上轻压吸去多余液体，然后从滤纸上提起载网。大约13秒后（具体时间取决于湿度和样品缓冲液），将载网迅速浸入盛有液氮的小泡沫塑料容器中，并将其放入冷冻电镜载网盒内，或直接转移用于冷冻电镜筛选或数据采集。此处展示的是采用剥离印迹法处理的人类白三烯C4合成酶二维晶体样品。箭头左侧区域位于碳膜与载网条之间的接触部位，经过剥离印迹并发生位移后，大部分已减薄为单层二维晶体。箭头右侧区域则未受到剥离印迹的影响。图像的下半部分代表了由于进行剥离印迹（peel-blot）而形成的、具有较大面积且主要为单层磷脂双分子层的区域。上半部分未处于载网条与碳膜之间的接触区域，因此含有完整的脂质体，具有两层磷脂双分子层。400目载网的网格方格显示了载网条的印迹足迹、由此产生的剥离印迹区域，以及未与载网条接触或经历较少剥离印迹次数的区域。这些图像显示了通过在亚微米滤纸上进行反向注射并使用超薄碳膜制备的电镜载网的印迹情况。图像分别为载网与膜接触瞬间、接触后1,000毫秒和接触后2,000毫秒的单帧图像。箭头指示的是毛细压力导致碳膜破裂的网格区域。避免碳膜产生裂纹，并将亚微米滤纸与1.7 µL海藻糖液滴结合，通过吸液后分离各层，是关键步骤。经剥离印迹的样品可用于高分辨率冷冻电镜数据采集，随后进行图像处理以解析结构。剥离印迹法使得单层蛋白质二维晶体的结构解析成为可能，而此类样品此前因过厚而无法用于冷冻电镜研究。此外，它可将多种样品浓缩至碳膜上的单层。

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科研

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生物化学

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