剥离印迹技术：一种用于从多层或高浓度生物样品中分离单层结构的冷冻电镜样品制备方法

剥离印迹法可将多层且高浓度的生物冷冻电镜样品分离为单层，从而降低样品厚度、提高浓度，并有助于图像处理。在载网制备前即可提高样品浓度，且可通过调节剥离印迹步骤，获得高密度分布的单层样品，实现高效的数据采集。操作开始时，将两片孔径为20–25微米的滤纸叠放在一起，并在其旁边放置一段长的石蜡膜，滤纸朝上。

将一片亚微米滤纸放在另外两片滤纸上。将防反冲镊子弯曲的一端朝上、直的一端朝下放置，并选择一个600目筛网，光滑面或有光泽的一面朝上。将镊子置于培养皿或其他抬高的表面上，以避免洁净的筛网与其他物品接触。

将纸张从石蜡膜上取下，拉伸边缘以形成一个小凸缘。用移液器滴加两滴150微升的4%海藻糖溶液，距离石蜡膜一端短边约一至两厘米处。两滴溶液之间应相距约一厘米。

接下来，在另一个实验台或地面上，将液氮倒入一个小型聚苯乙烯泡沫容器中，并将一个小的冷冻电镜载网容器放入液氮中。用无尘擦拭布盖住聚苯乙烯泡沫容器。为使碳膜从云母上漂浮下来，使用Dumont 5号镊子，以略微向下倾斜的角度触碰云母的一侧，将其轻触于海藻糖溶液的液滴之一上。

将云母向下移动，使水的表面张力缓慢将碳膜剥离。当碳膜漂浮在液滴表面时，松开云母。目视检查碳膜，避免使用带有裂纹等损伤的碳膜。

用防毛细作用的镊子夹住载网，以20-30度的角度插入海藻糖液滴中，位置应紧邻碳膜下方，然后将载网置于碳膜正下方中心位置。拾取碳膜时保持载网方向不变，并缓慢将载网降至第二滴海藻糖液滴表面，避免破坏液滴的表面张力。此操作可去除可能包裹在载网边缘并延伸至粗糙面的多余碳膜。

旋转防毛细作用镊子，将载网碳膜面朝下放置于培养皿中。用移液器吸取1.3 µL样品，加入载网上方轻微凸起的海藻糖弯月面中。然后，将溶液上下吹打约8–10次，以混合并使海藻糖和样品均匀分布在载网两侧。

将样品海藻糖溶液在载网上孵育1分钟的同时，用移液器吸取一滴或多滴1.7微升的海藻糖溶液滴加到石蜡膜上。将载网旋转回初始位置，使碳膜朝上，用抗毛细作用镊子将载网压在亚微米滤纸上。待溶液被滤纸吸收且碳膜完全展平后，等待3秒，然后提起载网，垂直转移至1.7微升的海藻糖溶液液滴上。

根据样品情况，这些步骤可重复一至三次或更多次。将载网在两张滤纸上轻压吸去多余液体，然后从滤纸上提起载网。大约13秒后（具体时间取决于湿度和样品缓冲液），将载网迅速浸入盛有液氮的小泡沫塑料容器中，并将其放入冷冻电镜载网盒内，或直接转移用于冷冻电镜筛选或数据采集。

此处展示的是采用剥离印迹法处理的人类白三烯C4合成酶二维晶体样品。箭头左侧区域位于碳膜与载网条之间的接触部位，经过剥离印迹并发生位移后，大部分已减薄为单层二维晶体。箭头右侧区域则未受到剥离印迹的影响。

图像的下半部分代表了由于进行剥离印迹（peel-blot）而形成的、具有较大面积且主要为单层磷脂双分子层的区域。上半部分未处于载网条与碳膜之间的接触区域，因此含有完整的脂质体，具有两层磷脂双分子层。400目载网的网格方格显示了载网条的印迹足迹、由此产生的剥离印迹区域，以及未与载网条接触或经历较少剥离印迹次数的区域。

这些图像显示了通过在亚微米滤纸上进行反向注射并使用超薄碳膜制备的电镜载网的印迹情况。图像分别为载网与膜接触瞬间、接触后1,000毫秒和接触后2,000毫秒的单帧图像。箭头指示的是毛细压力导致碳膜破裂的网格区域。

避免碳膜产生裂纹，并将亚微米滤纸与1.7 µL海藻糖液滴结合，通过吸液后分离各层，是关键步骤。经剥离印迹的样品可用于高分辨率冷冻电镜数据采集，随后进行图像处理以解析结构。剥离印迹法使得单层蛋白质二维晶体的结构解析成为可能，而此类样品此前因过厚而无法用于冷冻电镜研究。

此外，它可将多种样品浓缩至碳膜上的单层。