固定胚胎小鼠组织以进行细胞内膜分析

因此，使用该协议，我们可以通过标准光学显微镜可视化整个胚胎中固定小鼠组织中的细胞介素。使用这种技术，我们可以探测沿着细胞介子传播的内源性信号蛋白，而不是依赖于使用荧光标记蛋白的遗传操纵小鼠模型。在尝试该方案时，重要的是要轻轻地处理组织切片，以最佳地保存细胞内膜。

演示这一程序的将是米里亚姆·迪拉德，我的小组的首席研究员，以及克里斯蒂娜·戴利，圣裘德研究生。首先，使用解剖剪刀和镊子在腹膜腔上做一个Y形切口。切除含有E 9.5胚胎的子宫。

在完整的DMEM生长培养基中解剖胚胎。使用镊子去除卵黄囊、胎盘和周围膜。冲洗HBSS中分离的胚胎以去除任何残留的羊膜组织和血液。

接下来，通过在HBSS中加入多聚甲醛来制备固定剂，工作浓度为4%多聚甲醛。向24孔板的每个孔中加入一毫升该溶液。将胚胎放入单个孔中。

在摇杆上轻轻搅拌胚胎孵育45分钟。孵育后，取出固定剂并洗涤胚胎三次，在PBS中加入钙，镁和0.1%海卫一洗涤30分钟。然后将胚胎在封闭溶液中孵育两次，每次一小时。

第二次孵育后，使用新鲜的封闭溶液冲洗胚胎。同时，通过在补充的PBS中稀释抗体来制备一抗溶液。冲洗完成后，取出封闭溶液，并向每个孔中加入一毫升一抗溶液。

将板在四摄氏度下孵育，轻轻旋转三天。一抗孵育后，用补充的PBS在摇杆上以20 RPM的速度洗涤胚胎五次，持续一小时。然后向每个孔中加入一毫升二抗溶液。

在黑暗中以四摄氏度的温和摇摆孵育板三天。取出二抗溶液，在补充的PBS中洗涤胚胎三次30分钟。在PBS中用钙和镁制备4%重量的低熔点琼脂糖溶液。

同时，将12孔板放入55摄氏度的珠浴中，并向每个孔中加入三毫升琼脂糖。接下来，将板放在台面上，并使用穿孔勺将胚胎转移到单个孔中。使用移液器吸头轻轻嵌入和定向胚胎，使其在溶液中居中。

胚胎取向后，将板置于零下20摄氏度10分钟以凝固。然后使用手术刀，从井中取出整个琼脂糖块。在胚胎周围切一个矩形块，每侧留下约0.3厘米的块。

沿着胚胎的尾端留下额外的块长度。要将胚胎安装在振动切片机上，首先在试样夹具上贴上一条胶带。将胚胎定向在块的上部的直立位置，并将琼脂糖块超级胶合到胶带上，使得叶片将在前后序列中产生轴向截面。

接下来，用冷的HBSS填充振动室以完全浸入样品，然后用冰包围室。设置振动切片机上的参数，并对胚胎进行连续的轴向切片。使用镊子将各个部分转移到装满HBSS的单独培养皿中。

请记住仅使用镊子来保持琼脂糖，以避免组织损伤和细胞介素的破坏。为了进行F-肌动蛋白染色，除去HBSS并将切片与补充PBS中的ActinRed和DAPI溶液一起孵育40分钟。孵育后，在补充PBS中洗涤切片三次20分钟。

使用疏水性记号笔，在带电显微镜载玻片的边缘周围画一个屏障，并向填充区域添加少量HBSS。然后，使用镊子将切片转移到幻灯片上。使用镊子去除多余的琼脂糖。

一旦所有部分都转移到载玻片上，通过移液和使用吸水毛巾的角落来去除多余的液体。然后将几滴安装介质添加到载玻片中。轻轻地将盖玻片放在滑轨上，以安装盖玻片。

对于分析，在共聚焦或任何高分辨率显微镜上对每个基因型至少三个胚胎的组织切片进行成像。此处显示了使用此协议准备的正确定向部分。与振动切片相比，组织的低温切片不能保留细胞延伸。

在凹槽和神经管的细胞之间以及低温恒温切片中相邻的神经管细胞之间检测到一些GFP阳性膜片段。然而，在低温恒温切片中，神经管周围间充质细胞中细胞延伸的F-肌动蛋白染色受损。振动切片确保了对整个胚胎和单个组织切片的破坏最小。

最佳处理切片允许检测相邻定位的底板神经上皮细胞和间充质细胞之间的ctyonemes。折叠或扣状部分通过神经管的切口和腹侧底板之间的大分离而明显。细胞膜延伸的损失在上皮细胞之间迁移。

F-肌动蛋白和DAPI染色切片在神经管和切口周围具有一致的间充质细胞和ctyones间距。切片的微小变形可能导致基于肌动蛋白的延伸片段化，并在细胞之间形成大间隙，这强调了精细处理的必要性。胚胎切片后，必须尽量减少组织切片的任何弯曲或折叠。

以防止细胞因子的破坏。使用这种技术，我们可以直接可视化信号分子（如形态原）如何在组织中传播。这为我们提供了关于组织和器官如何模式的新见解。