Name: 固定胚胎小鼠组织以进行细胞内膜分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习固定小鼠胚胎组织以进行细胞内膜分析的方法，使用多聚甲醛固定、免疫染色和振动切片技术。该方案可在标准光学显微镜下观察细胞内膜，帮助研究人员研究内源性信号蛋白在细胞间通讯中的作用。

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图像由圣裘德儿童研究医院细胞与分子生物学成像中心维护的显微镜采集。小鼠品系购自JAX。本研究由美国国立卫生研究院资助项目R35GM122546（SKO）以及圣裘德儿童研究医院ALSAC资助。

本方案遵循机构动物照护与使用委员会（IACUC）和圣裘德儿童研究医院批准的动物护理指南。所有品系均与C57BL/6J品系回交五代。
1. 胚胎分离与整体染色
<ol>
	<li>将6周龄雌鼠与雄鼠合笼交配，并观察阴道栓的出现。</li>
	<li>根据美国兽医协会（AVMA）指南18，通过CO2吸入法在CO2麻醉舱中对怀孕母鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。使用解剖剪和镊子在腹腔做Y形切口。根据机构批准的实验指南，取出含有E9.5胚胎的子宫。</li>
	<li>在完全培养基（DMEM高糖培养基，添加非必需氨基酸、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和10%胎牛血清）中解剖胚胎。使用镊子去除卵黄囊、胎盘及周围膜组织。 
	注意：如需进行胚胎基因型鉴定，应保留每个卵黄囊。</li>
	<li>用Hank's平衡盐溶液（HBSS）清洗分离出的胚胎，以去除残留的羊膜组织和血液。</li>
	<li>配制固定液。将多聚甲醛（PFA）加入HBSS中，配制成终浓度为4% PFA的工作液。 
	注意：PFA为有毒化学品，应避免吸入或皮肤直接接触。固定液的配制必须在通风橱中进行，并佩戴手套和实验服等适当的个人防护装备。</li>
	<li>向24孔板的每孔中加入1 mL固定液，并将每个胚胎放入单独的孔中。在摇床上以轻柔振荡（温和摇动）条件下，于固定液中孵育45分钟。 
	注意：关键步骤：所有洗涤和孵育步骤必须在摇床或旋转摇床上以轻柔振荡（最高20 RPM）进行，因为剧烈操作或移动胚胎会破坏固定的细胞突起（cytonemes）。使用移液器轻柔地吸除所有溶液。</li>
	<li>移除固定液，用含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲液（PBS）加0.1% Triton对胚胎进行3次洗涤，每次30分钟。</li>
	<li>洗涤后，在封闭液（含Ca2+和Mg2+的PBS，0.1% Triton，5%山羊血清）中以轻柔振荡方式孵育胚胎，每次封闭1小时，共封闭2次。第二次封闭孵育结束后，用新鲜封闭液快速冲洗胚胎一次。</li>
	<li>在第二次封闭过程中，配制一抗溶液11。将一抗用含Ca2+和Mg2+的PBS稀释至优化浓度，并加入0.1% Tween-20和5%山羊血清。 
	注意：为增强膜定位GFP的可视化效果，可使用鸡抗GFP抗体（1:250稀释）。</li>
	<li>移除封闭液，向每孔中加入1 mL一抗溶液。在4 °C下轻柔旋转孵育3天。</li>
	<li>一抗孵育结束后，在摇床上以20 RPM的转速，用含Ca2+和Mg2+的PBS、0.1% Tween-20和5%山羊血清对胚胎进行5次洗涤，每次1小时。</li>
	<li>使用F(ab')2片段标记的二抗，按1:1,000稀释比例，在含Ca2+和Mg2+的PBS、0.1% Tween-20和5%山羊血清中配制二抗溶液。 
	注意：使用F(ab')2片段可显著增强抗体在样本中的渗透性。</li>
	<li>向每孔中加入1 mL二抗溶液。在4 °C避光条件下轻柔振荡孵育3天。 
	注意：重要提示：从此步骤开始，应尽量减少胚胎暴露于直射光下。可选：为防止细菌生长，可在二抗溶液中添加0.2%叠氮化钠。</li>
	<li>移除二抗溶液，用含Ca2+和Mg2+的PBS、0.1% Tween-20和5%山羊血清对胚胎进行3次洗涤，每次30分钟。若不进行鬼笔环肽或其他肌动蛋白染料的染色，则在第一次洗涤后，向含Ca2+和Mg2+的PBS、0.1% Tween-20和5%山羊血清中加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），孵育1小时，随后按上述方法进行3次每次30分钟的洗涤。 
	&#8203;注意：此时，胚胎可在4 °C避光条件下保存于PBS或HBSS中过夜，直至次日进行包埋。但建议立即进行包埋和切片。</li>
</ol>
2. 胚胎包埋、切片与封片
<ol>
	<li>配制含有 Ca 的 HBSS 或 PBS 溶液，溶解 4% w/v 低熔点琼脂糖（LMP）2+ 和 Mg2+ 至每枚胚胎终体积约 3 mL。根据需要向 HBSS 或含 Ca 的 PBS 中加入适量的 LMP 琼脂糖2+ 和 Mg2+ 微波加热直至低熔点琼脂糖完全溶解。 
	注意：低熔点琼脂糖溶解后，应将溶液置于55 °C的珠浴、培养箱或水浴中保存，以防止低熔点琼脂糖溶液凝固。</li>
	<li>使用12孔板作为胚胎包埋模具。将12孔板置于55 °C的珠浴中。向每个将要容纳胚胎的孔中加入2.5–3 mL的4%低熔点琼脂糖。 
	注意：尽管可使用其他模具，但12孔板的体积最适合在后续阶段制备用于切片的琼脂糖块。</li>
	<li>使用带孔的勺子将胚胎转移至含有4% LMP琼脂糖溶液的各个孔中（图1A).
	<ol>
		<li>将12孔板从珠浴中转移至实验台。使用移液器吸头轻轻将胚胎嵌入并调整方向，使其位于溶液中央。胚胎定位完成后，将培养板置于-20 °C环境中10分钟，以促进包埋块快速凝固。 
		关键：确保胚胎位于包埋块的中央。若胚胎沉至底部或过于靠近模具边缘，在切片过程中很可能从琼脂糖块中脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用解剖刀将整个琼脂糖块从孔中取出，围绕胚胎切出一个矩形琼脂块，每侧保留约0.3 cm的琼脂。在胚胎尾端方向留出额外长度。当将样品安装至振动切片机时，使胚胎在琼脂块上部区域呈直立方向定位图1B).</li>
	<li>将一条胶带贴在切片机的样品架上，用快干胶将琼脂糖块固定在胶带上，方向应使刀片按从头端（颅侧）到尾端的顺序产生胚胎的横断面切片。</li>
	<li>用冷的HBSS填充振动切片机腔室，确保样品完全浸没，然后在腔室周围放置冰块。</li>
	<li>设置振动切片机 速度 至 0.2 mm/s 和 频率 5 到 7 之间（50-70 Hz）与 切片厚度 设定为 100 µm进行胚胎的连续轴向切片。 
	注意：切片时应使用慢速。若切割速度超过0.25 mm/s，可能导致胚胎撕裂或从包埋块上脱落。
	<ol>
		<li>在切片过程中，使用镊子将单个切片轻轻转移至盛有HBSS的另一个60 mm培养皿中。应用镊子夹持包埋块而非组织，以避免损伤组织和破坏细胞突起（cytonemes）。 
		注意：组织切片应保留在琼脂糖块内。若组织从块中脱落进入振动切片机腔室，应轻柔地将切片提起转移。切勿抓取或夹捏组织。关键：任何导致组织切片折叠或突然移动的操作均会破坏组织切片中固定的细胞突起（cytonemes）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若不进行F-actin染色，则继续执行步骤2.10。
	<ol>
		<li>进行F-肌动蛋白染色时，移除HBSS，将切片与用含Ca²⁺的PBS稀释的Actin-Red和DAPI溶液孵育40分钟2+ 和 Mg2+，0.1% Tween-20 和 5% 山羊血清，室温下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用含钙的 PBS 洗涤切片，每次 20 分钟，共洗 3 次2+ 和 Mg2+ 和 0.1% Tween-20。</li>
	<li>使用疏水性标记笔在带电荷的显微镜载玻片边缘绘制疏水屏障，并加入少量 HBSS 液体以充满该区域。</li>
	<li>使用镊子或带孔勺将切片转移至载玻片上。 
	注意：任何未包埋在琼脂糖中的组织切片均可转移 通过 移液管</li>
	<li>使用镊子去除多余的琼脂糖块。</li>
	<li>所有切片转移至载玻片后，除去多余液体 通过 使用移液器吸取少量液体，并用吸水纸的角落吸去多余液体，然后在载玻片上滴加数滴封片剂。封片剂的用量应足以覆盖整个盖玻片区域，固化后不出现边缘干燥。将盖玻片轻轻放置在载玻片上完成封片。 
	&#8203;注意：封片介质固化前，避免施加压力或扰动盖玻片。</li>
</ol>
3. 成像
<ol>
	<li>在任意共聚焦或更高分辨率的显微镜上对组织切片进行成像11。每种基因型至少分析三个胚胎。 
	注意：组织切片图像使用 TCS SP8 STED 3x 共聚焦显微镜采集，随后进行 LIGHTNING 去卷积处理。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本方案旨在保存胚胎组织切片中脆弱的细胞突起（cytonemes），以用于高分辨率荧光显微镜观察。迄今为止，在多种模式生物的组织中对细胞突起的可视化主要依赖于活体组织成像技术，通过异位表达荧光标记蛋白来实现。然而，荧光标记的活体成像技术通常难以用于内源性表达蛋白的分析，可能带来时间上的限制，并需要特殊的成像载台和显微镜设备。本文所述的染色与切片方法可有效保存细胞突起及其他细胞突起结构，从而允许进行免疫组织化学染色，以最终检测内源性表达的蛋白质。该技术将有助于深入理解形态发生素如何在不同组织间转运。

关键词：细胞突起，胚胎组织，免疫组织化学，高分辨率荧光显微镜，内源性蛋白检测，形态发生素转运 体内 并拓展了可研究细胞突起（cytonemes）的模式系统范围。
本方案采用整体染色和振动切片机进行厚切片，避免使用甘油等平衡溶液或蔗糖等冷冻保护剂溶液。其目的是尽量减少对切片组织的操作，以最大程度地保存细胞突起结构。切片后对组织的操作越少，细胞丝状伪足的整体保存效果越 consistently 好。因此，胚胎切片是成像前的最后步骤之一。
MEM-fix是一种为保存培养细胞的细胞突起而开发的固定技术，由戊二醛和多聚甲醛（PFA）组合而成，可实现对细胞固有结构的三维形态更佳的保存，其尺寸接近活体状态16,17。然而，MEM-fix不适用于胚胎固定，因为戊二醛可能产生自发荧光，并由于其强烈的蛋白质交联作用，严重限制抗体在细胞内的渗透以及表位结合22,23。因此，针对PFA固定后的胚胎组织，优化了切片方案，以实现对胚胎组织中细胞突起结构的保存。尽管PFA能够在胚胎组织中保存类似细胞突起的结构，但图像分析时应谨慎进行。PFA可能导致单个细胞和组织部分脱水，引起轻微的体积收缩，并在固定组织中形成微小的细胞外间隙。
本方案避免了用于冷冻保护和组织透明化的蔗糖再饱和额外步骤，因为蔗糖或甘油溶液可能导致组织轻微再水合24。由此引起的轻微肿胀可能破坏固定的细胞突起以及在细胞之间和组织间迁移的细胞丝状突起（cytonemes）。这一点在比较振动切片机厚切片与恒冷切片机切片时尤为明显。尽管增加组织厚度有助于更好地保存完整的细胞丝状突起，但经蔗糖再饱和处理的恒冷切片中可检测到的细胞丝状突起数量始终较低。
本方案的优化结果表明，100 µm 厚的切片最有利于完整保留细胞突起（cytonemes）。通常情况下，成像时会使用更薄的切片，因为大多数共聚焦显微镜在未进行组织透明化处理时，仅能在约 20–40 µm 的深度范围内以足够分辨率观察到细胞突起25。然而，在切取薄切片过程中，刀片对胚胎细胞施加的机械力和形变会破坏细胞突起。较厚的切片可在组织内保留更深层的区域，同时维持细胞突起结构的完整性。此外，使用较厚的切片也更便于操作，有助于防止组织切片过度折叠或起皱。
本方案已针对 E8-10.5 天小鼠胚胎组织中细胞突起（cytonemes）的最大程度保存进行了优化。切片后对组织的最小化操作 consistently 提高了细胞突起的整体保存效果。由于组织尺寸增大及结构复杂性增加，若将该技术应用于更晚的发育阶段或成体组织切片，可能需要进一步优化。这将涉及切片后进行免疫荧光染色。此类组织可能需要额外的透明化步骤，并在切片过程中调整组织处理方式，以保存类似细胞突起的结构。这些附加步骤需在本方案未来的应用中予以考虑并加以解决。

胚胎发育通过形态发生素信号通路的协调激活来调控。形态发生素是一类小分子分泌蛋白，可分为音猬因子（Sonic Hedgehog, SHH）、转化生长因子β（transforming growth factor β, TGF-β）/骨形态发生蛋白（bone morphogenic protein, BMP）、Wingless相关整合位点（WNT）以及成纤维细胞和表皮生长因子（fibroblast and epidermal growth factor, FGF/EGF）家族。在组织发育过程中，形态发生素由细胞组织中心产生并释放，在细胞组织区域中形成信号浓度梯度，从而指导组织形态建成1,2,3,4,5。形态发生素浓度梯度的一个典型例子存在于发育中的神经系统，其中中枢神经系统前体的模式形成依赖于形态发生素信号通路的激活。这一组织称为神经管，其腹侧最前端的脊索和底板分泌SHH，背侧的顶板分泌WNT和BMP，形成相对的浓度梯度，从而调控不同神经前体区域的模式建立6。神经管常被用于发育生物学研究中评估形态发生素梯度的完整性。
形态发生素浓度梯度的形成依赖于对信号扩散的严格调控7。其中一种细胞机制是通过形成称为细胞丝状伪足（cytonemes）的长距离信号突起，将形态发生素直接从信号产生细胞递送至特定的靶细胞群体。已观察到细胞丝状伪足可延伸数百微米，将形态发生素沉积在信号接收细胞的膜上8,9。细胞丝状伪足介导的形态发生素运输一旦受到干扰，会导致果蝇和脊椎动物在发育过程中出现异常，凸显了其在组织模式形成中的重要性10,11,12,13,14。
迄今为止，已记录到细胞突起（cytonemes）存在于 果蝇，鸡胚和斑马鱼模型，但对发育中哺乳动物胚胎结构的成像仍然具有挑战性8,9,15有效成像复杂哺乳动物组织中细胞突起的技术难题 原位 其薄而脆弱的特性使得它们容易受到传统固定方法的损伤8我们先前已开发并优化了一种改良的电子显微镜固定剂（MEM-fix）方案，用于在培养细胞中保存细胞突起（cytonemes），并使其能够通过共聚焦显微镜进行研究。16,17.
利用MEM-fix技术，已鉴定出部分参与SHH诱导细胞突起形成与功能的分子11,16,17。然而，要在神经管模式形成的生理相关背景下验证这些发现，还需开发新的技术以固定和成像小鼠胚胎组织。本文概述了一种固定小鼠胚胎的方案，该方法可保持细胞突起的完整性，并允许对胚胎组织进行免疫染色及后续切片，用于共聚焦显微分析。本方案的建立采用了膜锚定型绿色荧光蛋白（GFP）来标记发育中神经管内SHH产生细胞的膜突起。该方案的实施将有助于解答关于细胞突起在发育中的哺乳动物系统中普遍存在性及其重要意义的未解问题。

<table><tbody><tr><td>12孔板；Nunc 细胞培养处理&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>150628（Fisher Scientific 12-565-321）</td><td></td></tr><tr><td>24孔圆底Nunc板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿&amp;nbsp;</td><td>康宁，费尔康</td><td>353004（Fisher Scientific 08772F）</td><td></td></tr><tr><td>吸收性擦拭纸（Professional Kimtech Science Kimwipes）</td><td>金佰利 KIMTECH</td><td>34155（Fisher Scientific 06666A）</td><td></td></tr><tr><td>Actin Red 555 ReadyProbes 试剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>R37112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 片段驴抗鸡IgY（IgG）（H+L）</td><td>杰克逊免疫研究实验室股份有限公司</td><td>703-546-155</td><td>1:1,000 工作浓度</td></tr><tr><td>Bead Bath 6L 230V</td><td>Lab Armor</td><td>货号 #12L048（制造商型号 #74220-706）</td><td>设定为55 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>鸡抗GFP</td><td>Aves Labs</td><td>SKU GFP-1020</td><td>1:250 工作浓度</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 腔室</td><td></td><td></td><td>连接至 CO 的有机玻璃室&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 发射线&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>型号：Leica TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI溶液（1 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪（Vannas 剪）</td><td>世界精密仪器公司</td><td>14003</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 改良 Eagle 培养基，高糖，无谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 单通道移液器，0.1–2.5 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 单通道移液器，0.5-10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 单通道移液器，100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 单通道移液器，20-200 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>羽毛一次性手术刀 #10</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>货号 NC9999403</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，认证级，美国</td><td>赛默飞世尔科技，吉比科</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 细尖高精度镊子</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 标记胶带</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15-954</td><td></td></tr><tr><td>甲醛，16%，无甲醇，超纯EM级</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障笔&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X) 配备 LIGHTNING</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>显微镜软件</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖-超纯</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技，Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Moria MC 17 BIS 带孔勺</td><td>精细科学工具&amp;nbsp;</td><td>1037018</td><td></td></tr><tr><td>封片剂（ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂）&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技</td><td>P36961&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：B6.129X1(Cg)-Shh&lt;sup&gt;tm6Amc&lt;/sup&gt;/J（Shh）&lt;sup&gt;GFP/+&lt;/sup&gt;)</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：008466</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：B6.Cg-Shh&lt;sup&gt;tm1(EGFP/cre)Cjt&lt;/sup&gt;/J (Shh-Cre)</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：005622</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：C57BL/6J（B6）</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：000664</td><td></td></tr><tr><td>小鼠：Gt(ROSA)26Sor&lt;sup&gt;tm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo&lt;/sup&gt;/J（Rosa26 mTmG）</td><td>杰克逊实验室</td><td>品系编号：007576</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清&amp;nbsp;</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>005-000-121（Fisher Scientific NC9660079）</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; + Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技，吉布科</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>优质微量离心管：1.5 mL</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>SHARP 精准屏障吸头，适用于 P-10 和 Eppendorf 10，超长型 &amp;micro;L</td><td>德文特科学公司</td><td>P1096-FR</td><td></td></tr><tr><td>SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-1000 和 Eppendorf 1,000、1,250 &amp;micro;L</td><td>Denville Scientific</td><td>P1126</td><td></td></tr><tr><td>SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-20 和 Eppendorf 20 &amp;micro;L</td><td>德文特科学公司</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-200 和 Eppendorf 200 &amp;micro;L</td><td>Denville Scientific</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）（100倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技，吉布科</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>大猩猩</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 显微镜载玻片&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>TPP 离心管，体积 15 mL，聚丙烯材质</td><td>TPP Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>TPP 离心管，容量 50 mL，聚丙烯材质</td><td>TPP Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>移液管，聚乙烯</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z135003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Vari-Mix 平台摇床</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>09-047-113Q</td><td>设定为 20 RPM</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎组织固定用于细胞突起分析

Fixation of Embryonic Mouse Tissue for Cytoneme Analysis

发育过程中的组织模式形成以及发育后组织稳态的维持依赖于一类称为形态发生素（morphogens）的细胞信号的精确传递。形态发生素以浓度和时间依赖的方式发挥作用，调控不同的转录程序，从而指导并巩固细胞命运。确保形态发生素信号达到适当阈值的机制之一是通过一种特化的丝状伪足——即细胞丝状突起（cytonemes）——来递送信号蛋白。细胞丝状突起非常纤细（直径≤200 nm），长度可延伸至数百微米，这使得其在固定样本中难以完整保存，从而为静态图像分析带来挑战。本文介绍了一种优化的方法，用于轻柔处理小鼠胚胎，进行固定、免疫染色及厚切片制备，从而能够在标准共聚焦显微镜下实现对细胞丝状突起的可视化观察。该方案已成功应用于观察小鼠神经管发育过程中连接不同细胞信号区室的细胞丝状突起。此技术亦可推广至其他组织类型，以助力在前所未有的分辨率下探究发育过程中的信号传递机制。

使用较大的模具，在12孔板的每个孔中加入2.5–3 mL琼脂糖溶液，非常适合在短时间内包埋并悬浮多个胚胎（图1A）。多余的区域有利于在切割琼脂糖块以进行切片时实现正确的方向定位。切割琼脂糖块时，需注意在块底部保留适量的多余琼脂糖，以便将其粘附到样品托上的胶带上。胚胎应位于琼脂糖块的上半部分（图1B）。然而，底部部分不宜过大，因为过大的琼脂糖块在切片过程中刀片切入时更容易改变切面角度。正确取向的切片示例见（图1C、D）。
在开发本方案的过程中，对振动切片机切片与冷冻切片进行了比较。冷冻切片法对组织的细胞突起保存效果较差（图2 冷冻切片，以及 图3A,B 振动切片）。冷冻切片虽可检测到部分位于脊索与神经管细胞之间（图2A 箭头）以及相邻神经管细胞之间的GFP阳性膜碎片（图2B,B' 箭头），但对围绕神经管的高纤维化间充质细胞的F-actin细胞突起染色效果不佳（图2C,C' 箭头，对比 图3C,D）。这些冷冻切片结果表明，该方法仅能保留少量断裂的细胞突起痕迹。因此，为有效保存这些精细的细胞突起以供后续分析，推荐采用振动切片机切片法。
对整个胚胎和单个组织切片的最小化干扰对于高质量成像细胞突起至关重要。发生任何折叠或皱褶的组织切片会因缺乏脊索或出现较大分离而明显可见&gt;30 µm）位于脊索与神经管腹侧底板之间（图3B）。这通常伴随着正常情况下环绕神经管的间充质细胞的丢失（图3A，箭头所示）。受损区域还会导致上皮细胞间迁移的可见细胞膜突起消失。图3B 与……相比 图3A，箭头所示）。即使切片发生轻微变形，也可能导致基于肌动蛋白的突起断裂，并在细胞间形成较大间隙（图3D，箭头，与保存良好的相比 图3C），强调所有步骤中均需谨慎操作。
<img alt="胚胎发育阶段：培养皿、切片、荧光显微镜、组织染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：Shh-Cre; Rosa26 mTmG 胚胎在E9.5时期的染色、包埋与切片示例。（A）置于12孔板中的单个胚胎，包埋于4% LMP琼脂糖中。（B）琼脂糖块中正确朝向的胚胎示例，已修整至适合振动切片机安装的尺寸，底部保留部分多余琼脂糖块。（C）厚度为100 µm的胚胎切片明场图像，切片仍包埋于LMP琼脂糖中。（D）去除琼脂糖后切片的免疫荧光成像。抗GFP染色显示的mGFP（绿色）代表组织中Shh表达的细胞，其他细胞谱系表达膜定位的番茄红荧光蛋白（红色），DAPI染色呈蓝色。神经管（方括号标记）和mGFP阳性的脊索（箭头标记）清晰可见。标尺 = 1 cm（A），5 mm（B），100 µm（C,D）。缩写：LMP = 低熔点；mGFP = 膜绿色荧光蛋白；Shh = Sonic Hedgehog；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="双光子显微镜图像，mGFP、F-actin、DAPI、细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：冷冻切片显示神经管底板和脊索具有断裂膜突起的示例。（A）E9.5 Shh-Cre; Rosa26 mTmG19,20,21 小鼠胚胎20 µm厚切片，经GFP（绿色）、F-actin（红色）和DAPI（蓝色）染色。在脊索与底板之间可见mGFP点状信号（箭头），以及（B,B'）在神经管相邻细胞间迁移的信号。（C,C'）F-actin染色未能检测到围绕神经管的间充质细胞上存在明确的细胞质丝状突起（箭头）。比例尺 = 20 µm。缩写：mGFP = 膜绿色荧光蛋白；Shh = Sonic Hedgehog；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元生长，mGFP可视化；共聚焦显微镜图像，F-肌动蛋白，细胞结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64100/64100fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：神经管底板、脊索及周围细胞的振动切片与染色效果良好与不佳的示例。 轻柔处理的切片示例（A,C），与（B）折叠的组织切片和（D）处理不当的切片对比，后者来自 Shh-Cre; Rosa26 mTmG 和 ShhGFP/+ 胚胎19,20,21。处理得当的切片可检测到底板神经上皮细胞之间相邻延伸的细胞丝状伪足（A，箭头）。神经管邻近的脊索（A，表达mGFP）和间充质细胞（A，箭头）应清晰可见。（C,D）经F-肌动蛋白和DAPI染色的切片中，围绕神经管和脊索的间充质细胞应分布均匀，且基于F-肌动蛋白的细胞丝状伪足（箭头）应连续（C）。任何轻微的折叠或组织损伤均可能导致间隙及断裂的F-肌动蛋白片段（D，箭头）。比例尺 = 10 µm。缩写：mGFP = 膜绿色荧光蛋白；Shh = Sonic Hedgehog；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64100/64100fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文提供了一种优化的分步实验方案，用于固定、免疫染色及切片小鼠胚胎组织，以检测发育中小鼠组织中一种称为细胞质丝（cytonemes）的特化信号突起结构。

发育过程中的组织模式形成以及发育完成后的组织稳态依赖于对一类称为形态发生素（morphogens）的细胞信号分子的精确递送。形态发生素……

通过使用本方案，我们可以利用标准光学显微镜在整只小鼠胚胎的固定组织中观察到细胞突起（cytonemes）。利用该技术，我们能够检测沿细胞突起运输的内源性信号蛋白，而无需依赖表达荧光标记蛋白的基因改造小鼠模型。在实施本方案时，需轻柔处理组织切片，以确保细胞突起结构得到最佳保存。本实验操作将由我团队的首席研究员 Miriam Dillard 和圣犹大大学的研究生 Christina Daly 演示。首先，使用解剖剪和镊子在腹膜腔上做 Y 形切口。切除含有 E 9.5 胚胎的子宫。在完全DMEM培养基中解剖胚胎。使用镊子去除卵黄囊、胎盘及周围膜组织。用HBSS清洗分离的胚胎，以去除残留的羊膜组织和血液。接下来，通过将多聚甲醛加入HBSS中，配制终浓度为4%多聚甲醛的固定液。向24孔板的每个孔中加入一毫升该溶液。将胚胎放入各自的孔中。将胚胎置于摇床上，轻轻振荡孵育45分钟。孵育结束后，除去固定液，用含有钙、镁和0.1%吐温的PBS缓冲液清洗胚胎三次，每次30分钟。随后将胚胎置于封闭液中，轻轻振荡孵育两次，每次一小时。第二次孵育后，用新鲜的封闭液冲洗胚胎。同时，将抗体用添加了补剂的 PBS 稀释，配制一抗溶液。冲洗完成后，吸除封闭液，向每个孔中加入一毫升一抗溶液。将培养板置于4°C条件下，轻轻旋转孵育三天。一抗孵育结束后，在20 RPM的摇床中用添加了补充物的PBS洗涤胚胎，每次一小时，共洗涤五次。然后向每个孔中加入一毫升二抗溶液。将培养板置于四摄氏度避光环境中，轻轻振荡孵育三天。移除二抗溶液，用含钙镁的 PBS 缓冲液补充后洗涤胚胎三次，每次三十分钟。在含钙镁的 PBS 中配制质量分数为 4% 的低熔点琼脂糖溶液。同时，将一个12孔板放入55摄氏度的珠浴中，并向每个孔中加入三毫升琼脂糖。接着，将该板放置在实验台面上，使用带孔的勺子将胚胎转移至各个孔中。用移液器吸头轻轻包埋并调整胚胎方向，使其位于溶液中央。胚胎定位后，将培养板置于负20摄氏度下10分钟，以使凝固。然后使用解剖刀将整个琼脂糖块从孔中取出。在胚胎周围切割出一个矩形块，每侧保留约0.3厘米的琼脂糖。在胚胎尾端保留一段额外长度的琼脂糖块。将胚胎固定在振动切片机上时，首先在样品台上方贴一条胶带。将胚胎在琼脂糖块的上部直立放置，并用瞬间胶将琼脂糖块粘附在胶带上，使刀片能够从前向后依次产生轴向切片。接下来，将振动切片机的样品室充满冷的HBSS，以完全浸没样本，然后用冰包围样品室。设置振动切片机的参数，对胚胎进行连续的轴向切片。使用镊子将各个切片转移至另一个盛有HBSS的培养皿中。注意使用镊子仅夹取琼脂糖，以避免组织损伤和细胞突起的破坏。进行F-肌动蛋白染色时，移除HBSS，将切片在含补充剂的PBS中与ActinRed和DAPI溶液孵育40分钟。孵育后，用含补充剂的PBS洗涤切片三次，每次20分钟。用疏水性记号笔在带电荷的显微镜载玻片边缘画出屏障，并向填充区域加入少量 HBSS。然后用镊子将切片转移至载玻片上。用镊子去除多余的琼脂糖。将所有切片转移至载玻片后，用移液器吸取并用吸水纸的角落去除多余液体。然后在载玻片上加入数滴封片剂。将盖玻片轻轻放置在载玻片上进行封片。用于分析时，需使用共聚焦显微镜或任何高分辨率显微镜，对每种基因型至少三个胚胎的组织切片进行成像。本方案制备的正确取向切片如图所示。与振动切片机切片相比，使用冷冻切片机进行组织切片未能较好地保存细胞突起结构。在冷冻切片中，于脊索和神经管细胞之间以及相邻的神经管细胞之间检测到少量GFP阳性膜碎片。然而，在冷冻切片中，围绕神经管的间充质细胞的细胞突起的F-actin染色受到破坏。振动切片机切片可最大程度地减少对整个胚胎及单个组织切片的损伤。经过最佳处理的切片可检测到位于相邻的底板神经上皮细胞与间充质细胞之间的细胞突起。当脊索与神经管腹侧底板之间出现较大分离，以及上皮细胞间迁移的细胞膜突起消失时，表明切片存在折叠或屈曲现象。F-肌动蛋白和DAPI染色切片显示，围绕神经管和脊索的间充质细胞及细胞突起分布间距一致。切片过程中可能出现轻微形变，导致基于肌动蛋白的突起发生断裂，并在细胞间形成较大间隙，这凸显了操作需格外轻柔的重要性。胚胎切片后，必须尽量避免组织切片发生任何弯曲或折叠。以防止细胞突起断裂。利用该技术，我们可以直接观察信号分子（如形态发生素）在组织中的扩散方式，从而为组织和器官的模式形成提供新的见解。

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