体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像

小胶质细胞在海马体中的作用尚未完全明确。本方案可直接观察小胶质细胞如何接触并调控神经元。在活体中对海马体内的静息态小胶质细胞和神经元进行成像一直非常困难。

该方法可解决此问题。植入观察窗时，使用皮肤打孔器在颅骨上制作一个3毫米的圆形凹槽，确保凹槽与先前标记的区域对齐。当皮肤打孔器到达颅骨最内层但尚未接触下方硬脑膜时，用30号针头轻轻抬起中央的骨岛。

接下来，使用硬脑膜剥离器小心地去除硬脑膜。吸除表面的软脑膜、软脑膜血管及皮层组织。保持整个颅窗暴露区域的组织表面深度均匀，并逐渐加深吸除深度，直至暴露外囊纤维。

将吸管尖端置于颅窗头外侧端靠近侧脑室的外囊区域后，去除从尾内侧向头外侧方向走行的外囊表层。随后去除沿内侧-外侧方向走行的内层。通过观察海马伞表面和背侧海马连合是否完全暴露，确认外囊已完全清除。

在确认出血完全停止后，用无菌生理盐水将孔洞填充至颅骨表面水平。接着，将玻璃底金属管垂直插入孔洞中，同时吸除从管壁周围溢出的多余液体，直至玻璃底轻轻压在齿状回上，并使下方的CA1区部分变平。使用牙科树脂胶将插入管的管壁固定于周围颅骨上。

将小鼠放置在双光子显微镜物镜下方的头部固定装置中，并置于电动控制的XY扫描台上。随后，在玻璃底部与物镜之间填充水，避免产生气泡。在脉冲激光持续照射下，根据脑实质发出的荧光以及金属管边缘反射的光线，调整焦平面至CA1区域。

通过倾斜头部固定装置来调整小鼠头部的角度，使玻璃底部与成像平面平行。然后调节物镜的校正环，以在CA1区目标结构的深度处获得最高分辨率。接下来，确认从玻璃底部起深度为500微米处的齿状回（DG）分子层中的荧光细胞在整个视野中均能被清晰成像。

只有在手术成功的情况下，才能立即检测到齿状回（DG）信号。术后将小鼠单独饲养数周。将麻醉后的小鼠置于双光子显微镜下。

对海马体进行成像。确认术后水肿减轻后所采集图像的质量和强度是否优于或相当于手术当天所采集的图像。确保小胶质细胞已恢复其分支状形态。

然后对CA1区感兴趣层进行活体成像。手术后立即采集的CX3CR1-GFP小鼠小胶质细胞未显示明显活化。在成功完成手术且未诱导水肿的情况下，双光子成像深度超过整个CA1层，达到手术表面下500微米。

术后超过三周的慢性期小胶质细胞由于水肿和炎症减轻，表现出更高的荧光强度和分辨率，以及更均匀的分布。所有层的小胶质细胞均已恢复其分支状形态，并表现出固定的细胞体和高度动态的突起。在整个CA1区，高分辨率图像可维持数月之久。

荧光小胶质细胞的信号有助于识别海马各层。门层中的小胶质细胞具有细长的胞体，其突起沿轴突通路延伸。锥体细胞层中的小胶质细胞可通过其突起密度较低加以区分。

CA1与DG之间的边界可通过沿边界走行的粗大血管来识别，而使用硫代罗丹明101标记血管后该边界更易辨认。作为一个应用示例，同时对GFP阳性的小胶质细胞和tdTomato标记的锥体神经元进行了成像。神经元标记有助于明确CA1各层的精确结构。

最重要的要点是减少手术损伤。避免通过抽吸造成组织损伤。插入玻璃底板时应施加轻柔压力，并防止牙科水泥接触脑表面。

该方法将有助于确定小胶质细胞在海马体中的作用。例如，小胶质细胞如何与神经元相互作用，它们如何参与学习过程，以及它们如何调控脑部疾病。