检测胎儿组织来源肠的上皮通透性

该方案的意义在于测试早产上皮体外模型上肠样的总概率。该技术的主要优点是测量模拟肠腔环境的封闭腔的通透性。该协议可用于研究诱导或减轻肠漏疾病的因素。

它也可以应用于内皮或血管系统，以研究可能诱发血管渗漏的条件。该协议需要一些练习。我们建议在将整个过程放在一起之前分别练习每个部分。

首先，将肠段转移到60×15平方毫米的培养皿中，用冰冷的Dulbecco的PBS和两性霉素，并在冰上浸泡20分钟。使用带一把剪刀的手术刀，将肠段切成三到五毫米的碎片，然后将一到两块放入含有 0.5 至 1 毫升类器官生长培养基的 35 x 15 平方毫米培养皿中冰上。使用解剖微型剪刀和镊子纵向切开肠管。

然后用镊子从筋膜上刮掉上皮细胞。取下筋膜并旋转培养皿以打破细胞团块。然后，使用20微升移液器切割尖端，以5至10微升的增量将细胞和培养基转移到基底膜基质混合物中，制成285微升溶液。

通过使用200微升切割尖端在冰上的基底膜基质中移液来混合细胞。混合后，将五个50微升的细胞基底膜基质混合物条放入预热的六孔板的一个孔中，该板保持在温暖的泡沫砖上。将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育10分钟，以使基底膜基质聚合和硬化。

基质条固化后，将两毫升肠样生长培养基加入孔中，然后将板放回培养箱中。将肠样转移到六孔或12孔板的孔中后，每隔一天用新培养基更换旧培养基。随着肠样开始茁壮成长，每五到七天通过一次细胞。

对于免疫荧光染色，将500微升一抗在封闭缓冲液中加入到每个肠样孔中，并在4摄氏度下孵育过夜。第二天，取出抗体溶液并用PBS洗涤肠杆菌三次。在1至400稀释的二抗溶液中孵育后，然后在DAPI中孵育，用PBS洗涤肠样肠3次。

为了保留肠样的三维结构，请使用薄硅橡胶板或玻璃盖玻片的切口在底部载玻片和盖玻片之间创建0.5至1毫米的空间。对于镶嵌，用70%甘油洗涤染色的类肠。然后，使用一微升接种环或切开的200微升尖端，将肠样从平板中取出并用甘油安装到玻璃显微镜载玻片上。

准备一个覆盖有透明薄膜盖的培养皿，并在薄膜上加入两到四滴一微升的葡聚糖-FITC液滴。使用微型机械手，在体视显微镜下将微量移液器吸头驱动液体内部和薄膜上方，然后轻轻拉动注射器以将葡聚糖FITC撤回微量移液器中。在微量移液器中注入两到四微升葡聚糖-FITC 后，推动注射器以去除移液器吸头上的任何空气。

此外，检查微量移液器中注入的材料柱，以确保没有气穴，并记录微量移液器内Dextran-FITC的体积。接下来，打开连接到气动泵的气源，然后打开泵并将泵持续时间设置为 10 到 15 毫秒。然后转动注射器上的旋塞阀以打开从泵到微量移液器的管路。

从培养箱中取出肠样，并将培养皿放在有盖容器中的温泡沫砖上，以尽量减少微注射后的光照。将带有肠样的培养皿放在体视显微镜下，并移动微型机械手旋钮，将微量移液器尖端与水平表面成35至45度角。可视化并识别球形肠，目标是每只培养皿注射三到五个肠样。

接下来，通过显微镜目镜观察将尖端推进到目标肠样。然后，以精确的缓慢运动推进Z轴旋钮，用微量移液器尖端刺穿肠。一旦尖端穿过肠表面，前进应该停止，肠表面会凹陷并弹出。

用一只脚轻敲泵踏板，用绿色的葡聚糖-FITC溶液填充肠，直到膨胀。记录泵的次数以计算泵送体积和葡聚糖浓度。该方案通过用免疫荧光抗体染色肠上皮特异性的各种生物标志物来显示胎儿组织来源的类肠的特征，确认其小肠上皮起源。

此处显示了不同阶段的肠样。7 到 10 天大的肠样小而厚。而准备进行显微注射的肠样肠很大，有管腔和薄壁。

显微注射后两天的肠仍然含有大量的葡聚糖-FITC药物。通过测量培养基中的葡聚糖浓度来评估显微注射后肠的通透性。已知EGTA可增加紧密连接的膜通透性，被用作阳性对照。

葡聚糖测量测定进一步表明，LPS诱导的渗透性增加，较高的LPS浓度诱导更高的渗透性。固定和染色最重要的是不要破坏肠样的形状或在此过程中丢失它们。显微注射后，可以收集培养基进行细胞因子测定，并且可以收获类肠进行RNA测序。