Name: 用于动态界面共聚焦显微镜可视化的微量天体测量仪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 了解微量天体测量仪与共聚焦显微镜联用技术，用于高时空分辨率研究弯曲液-液界面。该方法可同时测量界面张力与表面流变学特性，实时分析表面活性材料的结构-功能关系，为肺表面活性物质研究及呼吸窘迫综合征治疗提供新思路。

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所有共聚焦显微镜图像均使用尼康A1RHD多光子直立共聚焦显微镜获得。我们感谢明尼苏达大学大学影像中心支持人员，特别是Guillermo Marques，在实验过程中的指导与协助。本研究由美国国立卫生研究院资助项目HL51177支持。SI获得了露丝·L·柯什斯坦国家研究服务培训项目F32 HL151128的资助。

1. 毛细管的制备
<ol>
	<li>将毛细管放入毛细管拉制仪中，运行所需的拉制程序，制备出两根尖端外径（OD）约为 1 µm 的锥形毛细管。 
	注意：拉制前毛细管的外径必须符合微张力计样品池中毛细管夹持器所要求的规格。毛细管的内径（ID）可有所变化，但会影响拉制后毛细管的临界半径。应选择合适的拉制程序，使拉制初期毛细管的外径和内径迅速减小，随后接近目标外径和内径的半径，之后直径减小速度变慢。这样可获得更长的毛细管段，便于划痕断裂后获得内径为 30–100 µm 的可用毛细管。</li>
	<li>在毛细管尖端选定位置进行划痕，使其内径达到 30–100 µm，然后折断尖端。此时毛细管尖端的外径和内径即为所需的半径（图 1A）。毛细管可保存至进行第 2 步。 
	注意：毛细管切割边缘必须为 90° 的整齐断裂。任何切割边缘缺陷都会导致气泡在毛细管上的固定不良，从而影响表面性质的测量结果。锥形毛细管尖端极为脆弱，若接触除溶液以外的任何物体（如小瓶壁、气流喷嘴），均会被破坏。</li>
</ol>
2. 毛细管的疏水化处理
<ol>
	<li>准备拉制好的玻璃毛细管、酸洗液、塑料镊子、去离子水（DI水）、疏水化溶液（乙醇中含2%硅烷）、真空泵和乙醇溶液。详见材料表。 
	警告：酸洗液具有急性毒性，可导致皮肤和眼睛腐蚀/刺激，并具有氧化性。疏水化溶液对皮肤、眼睛和呼吸道有刺激性。操作时须佩戴护目镜、实验服和手套，并在通风橱内进行。</li>
	<li>毛细管酸洗 
	注意：酸洗可去除毛细管内部的有机残留物，并为玻璃表面进行硅烷化反应做好准备，从而使毛细管具有疏水性。
	<ol>
		<li>用镊子牢固夹住毛细管靠近其宽端的位置。</li>
		<li>将锥形尖端浸入酸洗液中，同时将真空泵的软管连接到毛细管的宽端，使溶液被吸入毛细管内。 
		注意：可在毛细管软管末端连接一个移液枪头，以更好地与毛细管末端贴合。</li>
		<li>当酸洗液填充至毛细管约一半长度时停止。 
		注意：将毛细管尖端从酸洗液中取出后，毛细管外壁的溶液常在尖端附近形成液滴。可轻轻将毛细管尖端触碰试剂瓶瓶颈处，以去除多余液体。</li>
		<li>让酸洗液在毛细管中静置至少30分钟，确保液柱始终位于毛细管的锥形端。</li>
		<li>用镊子牢固夹住毛细管，通过真空软管从毛细管宽端抽出酸洗液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冲洗毛细管
	<ol>
		<li>将毛细管的锥形端浸入去离子水中，确保浸入深度足以覆盖之前接触过酸洗液的外部区域。在尖端浸没状态下，使用真空软管将去离子水抽过毛细管。将毛细管从水中取出后，再用真空软管吸除残留水分。</li>
		<li>重复上述步骤至少4次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重复步骤2.3，但以乙醇代替去离子水。</li>
	<li>持续抽吸，直至乙醇完全从毛细管内部蒸发。乙醇开始蒸发时，毛细管会变得浑浊并触感变凉，约30至45秒后重新变得透明。</li>
	<li>用疏水化溶液对毛细管进行涂层处理
	<ol>
		<li>将毛细管的宽端短暂浸入约2%硅烷的乙醇溶液中。毛细作用会使涂层溶液在毛细管内上升。当溶液在毛细管内上升形成约1 cm长的液柱时，即将毛细管从溶液中取出。</li>
		<li>将毛细管调整为锥形尖端朝下，使涂层溶液在重力作用下流向尖端。</li>
		<li>让涂层溶液在毛细管中静置至少3分钟。 
		注意：与锥形尖端内壁接触的液柱中不得存在气泡。若出现气泡，则可能是步骤2.5中毛细管内部干燥不充分所致。此时应根据需要重复步骤2.4–2.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以与步骤2.3相同的方式，用乙醇对毛细管冲洗一次。</li>
	<li>固化毛细管上的疏水涂层
	<ol>
		<li>将洁净干燥的闪烁瓶放入设定为120 °C的真空烘箱中。将已涂覆的毛细管放入闪烁瓶内（理想情况下每瓶一根），使其宽端平放在瓶底。让毛细管在烘箱中至少保持6小时（建议过夜），以实现疏水性硅烷层与毛细管的永久键合。毛细管可保存至步骤4使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品制备与保存
<ol>
	<li>将表面活性剂和荧光染料溶液混合后，置于洁净的酸洗小瓶中保存，以避免污染。 
	注意： commercially available lipids 必须为最高纯度，并在使用期间于 -20 °C 下储存。陈旧或受污染的脂质常导致实验结果难以重复。</li>
</ol>
4. 设置微张力计
<ol>
	<li>按照所述方法组装CPM细胞 图2.
	<ol>
		<li>将毛细管的较粗一端插入CPM细胞的顶部，直至其穿透至细胞的底部。</li>
		<li>轻轻拧紧PEEK塞子以固定毛细管，然后将微流控泵的管路连接到毛细管的较粗一端。注意不要触碰毛细管的锥形尖端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>必要时，将储液罐交换和/或温度控制管路连接至CPM细胞的相应入口和出口图2）；否则，应堵塞未使用的进口和出口。</li>
	<li>将CPM细胞固定在共聚焦显微镜载物台上，大致对准CFM物镜、CPM相机和CPM光源（图3).</li>
	<li>打开微流控泵的气体流量，调节至泵推荐的工作压力（本实验所用微流控泵为150 mbar），并确保毛细管的流路畅通。</li>
	<li>启动CPM虚拟界面补充编码文件 1: 微张力计虚拟界面.vi) 在 压力控制 模式下，毛细管压力振荡频率和振幅均设为零（图4-7). 图4 显示虚拟界面的截图。对于去离子水和半径约为35 µm的毛细管，约20 mbar的压力可确保水不会进入毛细管。</li>
	<li>使用移液器将水注入CPM细胞中。</li>
	<li>使用微张力计相机对准毛细管尖端进行聚焦。</li>
	<li>使用CFM对准毛细管尖端。如果难以找到毛细管，可利用CPM相机定位CFM物镜，以大致确定CFM物镜与气泡之间的距离，从而获得正确的工作距离。</li>
	<li>当环面（绿色扇区投影）居中于气泡后，手动调节焦距，使气泡边缘清晰可见（图4-3). 
	注意：环形的位 置、起始角度和终止角度以及内半径和外半径均可调整 通过 视图窗口下方的菜单。</li>
	<li>点击 重置气泡，并确保形成一个新的气泡（可听到旧气泡破裂的声音，且可通过控制面板的观察窗看到新气泡）。 图4-3）。如果气泡未破裂，则增加 重置压力 或增加 重置延迟时间 在 气泡重置 观察窗口下方的标签。检查表面张力是否约为 73 mN/m（适用于生理盐水或水/空气气泡）图4-9).</li>
	<li>取出水 通过 直接进样至细胞的注射器（图3-13），清空后重新安装。样品现已准备好，可进行上样以运行实验。</li>
</ol>
5. 吸附研究
<ol>
	<li>使用已灭菌的移液器将所需样品加入测量池中，同时保持CPM软件处于压力控制模式。当形成新的气泡界面时，确保初始表面张力约为73 mN/m。</li>
	<li>测定新形成气泡的半径，并将该值输入中心线面积控制区域（图4-7），然后点击面积控制选项卡（图4-8）切换控制类型至面积控制。 
	注意：也可使用恒定压力控制，但这会导致随着界面表面张力的变化，气泡半径持续改变。这种不断变化的面积可能使表面活性剂吸附速率的分析复杂化，并在实验过程中导致气泡破裂。</li>
	<li>开始记录共聚焦视频。</li>
	<li>点击重置气泡（图4-5），然后立即点击采集数据&#160;（图4-6）。按钮上的信号灯将变为绿色。</li>
	<li>通过滑动图4-6中所示的滑块，根据样品浓度调整数据记录速率。对于较慢的吸附过程，应使用较慢的记录速率。若实验初期需要较高的记录速率，而在长时间实验中后期更倾向于较低速率以减小文件大小，可在运行过程中进行调整。</li>
	<li>实验结束后（当表面张力达到最终稳定平台期时），选择正确的文件路径（图4-1）并点击保存 按钮（图4-2）保存文件。</li>
	<li>同时在CFM上停止并保存录像记录。</li>
</ol>
6. 振荡/松弛研究
<ol>
	<li>使用已灭菌的移液器将样品加入测量池中，并保持CPM软件处于压力控制模式。当形成新的气泡界面时，确保表面张力约为73 mN/m。</li>
	<li>等待样品完全吸附至界面。此步骤可在完成吸附研究后直接进行，无需重新创建新的气泡界面。</li>
	<li>通过选择相应的选项卡（图4-8）并输入所需的基线值、振荡百分比和振荡频率（图4-7），确定振荡类型为压力振荡、面积振荡或曲率振荡。 
	注意：锯齿波、方波和三角波面积振荡也可通过其他面积振荡选项卡中的下拉菜单选择。</li>
	<li>开始共聚焦视频的录制，并点击CPM软件中的采集数据&#160;（图4-6）。</li>
	<li>启动振荡。为获得最佳结果，请确保至少记录七个振荡周期。选择合适的数据采集速率（图4-6），以保证每个振荡周期内有足够数量的数据点。</li>
	<li>若需使用其他振荡幅度或频率，可在实验过程中更改相应参数值。</li>
	<li>按照步骤5.6和5.7保存实验结果。</li>
</ol>
7. 溶剂交换研究
<ol>
	<li>使用已灭菌的移液器将样品加入样品池中，同时保持CPM软件处于压力控制模式。当形成新的气泡界面时，确保表面张力约为73 mN/m。 
	注意：可在溶剂交换实验之前进行吸附和/或振荡研究。</li>
	<li>将进液管与所需交换溶液的瓶子连接（图3-11），并连接至蠕动泵（图3-10）。</li>
	<li>在共聚焦软件中开始视频录制，并在CPM软件中点击采集数据（图4-6）。</li>
	<li>设置蠕动泵的转速。该参数将控制液体交换的速率，需根据实验需求进行选择，即根据所需溶剂交换速度确定。</li>
	<li>若需更换多种液体，应先停止蠕动泵，然后将进液管切换至另一种交换溶液。</li>
	<li>交换完成后（约20分钟），按照步骤5.6和5.7保存结果。</li>
</ol>
8. 不溶性表面活性剂的吸附
注意：如果待吸附的表面活性剂在储液中不溶解，可使用此方法将单层膜从细胞的气/水界面转移到气泡表面。许多形成双层膜的脂质在生理盐水中几乎不溶，当悬浮于储液中时，不会自发吸附到气泡表面。
<ol>
	<li>使用已灭菌的移液器将样品加入细胞中，同时保持 CPM 软件运行 压力控制 模式。当形成新的气泡界面时，确保表面张力约为 73 mN/m。</li>
	<li>在细胞的气-水界面处，从挥发性有机溶液中沉积一层不溶性表面活性剂。使用注射器将少量液滴加至界面，待溶剂挥发后，脂质即在界面形成一层薄膜。 
	警告：氯仿用作磷脂（如磷脂酰胆碱）和脂肪酸的溶剂。铺展溶液通常含有脂质0.01–0.02 mg/mL溶剂。氯仿具有急性毒性，可引起皮肤和眼睛刺激，且具有致癌性。操作时应佩戴适当的眼部防护装备、实验服和手套，并在通风橱内配制溶液。</li>
	<li>减小表面积 通过 中心线压力控制（图4-7将气泡压至接近扁平状态。这可以防止表面活性剂吸附后气泡破裂。</li>
	<li>移除细胞中的储液 通过 将直连细胞的注射器推至气/水界面越过毛细管尖端。虽然可以使用注射泵，但此步骤也可通过手动操作注射器完成。</li>
	<li>将储液器中的液面高度调至初始水平。 
	注意：尖端重新浸入后，由于表面活性剂已吸附在界面，气泡会变大。此时单分子层已准备好进行振荡或溶剂交换实验。</li>
</ol>
9. 清理
<ol>
	<li>关闭 CFM。</li>
	<li>切换至 压力控制 模式。</li>
	<li>使用移液器将样品从样品池中移除。用去离子水（DI 水）冲洗样品池，并将压力调至约 50 mbar，使气泡持续从毛细管中逸出，从而清洁毛细管尖端。重复此步骤 2 次。</li>
	<li>关闭安全阀，通过点击左上角的红色按钮关闭 CPM，关闭光源和蓝色压力控制面板，并切断压力源。</li>
	<li>从共聚焦显微镜载物台上取下样品池。用乙醇和去离子水冲洗样品池。从 CPM 样品池中取出毛细管。</li>
</ol>
10. 清洗细胞
<ol>
	<li>拆卸细胞装置。用牙刷在去离子水下冲洗内壁，然后将各部件浸入乙醇中，超声处理约30分钟。</li>
	<li>用去离子水多次冲洗所有部件。通过氮气吹扫或在真空烘箱中干燥的方式将部件干燥。</li>
</ol>
11. 振荡分析
<ol>
	<li>运行 Dilatational_Rheology_Analysis.m 代码（补充代码文件 2），选择从 CPM 虚拟界面保存的所需文件。示例数据包含在补充文件中。</li>
	<li>将显示压力随时间变化的曲线图，如 补充图 1 所示。用鼠标左键单击振荡开始的位置，再左键单击振荡结束的位置。如果数据包含多个振荡周期，请对所有振荡重复此操作。
	<ol>
		<li>当所有起始点和终止点均完成左键单击后，在任意位置右键单击鼠标。例如，如 补充图 1 所示，可在点 1、2、3 和 4 处依次左键单击，然后进行一次右键单击。 
		注意：代码将计算膨胀模量和相位角，并将结果写入原始文件位置的一个新 .csv 文件中。示例数据的结果可参见 补充代码文件 2 中提供的代码输出结果。MATLAB 还将生成多个数据的图形表示，如 补充图 2 所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

联合使用的共焦显微拉曼光谱法（CPM/CFM）是一种研究界面动力学、平衡状态及形貌的有力工具。本实验方案描述了利用CPM/CFM获取数据所需的各个步骤。
图2展示了带有毛细管、溶剂和热交换通道的池体设计。溶剂交换的入口应位于池体底部，出口应位于顶部，以确保在交换过程中池体不会溢出。实际操作中，即使使用相同的蠕动泵，入口和出口的流速也可能略有不同。这种池体设计的一个常见问题是发生泄漏。这通常是由于池体与某个连接部件之间的密封不良所致；但如果所有连接处均干燥且无泄漏，则可能是由于紧固池体周围的螺栓时过度拧紧，导致玻璃片出现裂纹所致。
图3展示了各种泵与细胞之间的连接关系，以及细胞与共聚焦显微镜（CFM）和明场显微镜（CPM）物镜的对准情况。CPM相机（4）用于在运行期间成像气泡的形状。CPM相机必须配备一个光学滤光片，以防止CFM激发激光进入CPM相机。否则，CFM激光会使CPM相机中的图像噪声极大，难以通过图像...

被表面活性剂膜覆盖的气-液界面在日常生活中普遍存在。表面活性剂-水混合物的注入被用于提高枯竭油藏的原油采收率，也用作页岩气和页岩油开采中的水力压裂液。气-液泡沫和液-液乳液在许多工业和科学过程中常见，例如作为润滑剂和清洁剂，并广泛存在于食品中。在包装、储存和给药过程中，界面处的表面活性剂和蛋白质可稳定抗体的构象1,2,3,4,5，维持眼部泪膜的稳定性6,7,8，以及参与肺部力学调节9,10,11,12,13,14,15。
表面活性剂在界面处的吸附行为及其性质的研究历史悠久，已有多种不同的实验技术16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。近年来发展出毛细管压力微张力计（CPM），可在更高曲率的界面、更小的尺度下研究界面性质，且所需样品量远少于其他常用方法9,23,24,25。共聚焦荧光显微镜（CFM）可用于研究CPM中气-水界面22或Langmuir槽上脂质和蛋白质的形态结构20,26,27,28,29。本文将CPM与CFM相结合，旨在将形态学现象与动态及平衡状态下的界面性质相关联，从而建立生物与技术界面的结构-功能关系。
在CPM-CFM可检测的界面表面活性剂体系中，存在多个重要参数。在CPM中，一个30-200 µm 直径为一定大小的气泡被固定在玻璃毛细管末端。在早期版本的CPM中，通过调节气泡内外的毛细压力差来控制 通过 水柱与振荡式注射泵9,30 ；本文所述的新版本用一种更高精度、由计算机控制的微流控泵替代了原有装置。表面张力（γ）的测定采用 通过 拉普拉斯方程 ΔP = 2γ/R，其中 ΔP 为泵设定的界面两侧压力降，R 为通过光学分析测得的气泡曲率半径。在可溶性表面活性剂溶液与本体液体接触形成新气泡后，可实现以 10 ms 时间分辨率测定界面的动态表面张力。表面活性剂的吸附动力学过程可用经典的 Ward-Tordai 方程描述。10,31 以确定表面活性剂的关键性质，包括扩散系数、表面覆盖率以及体相浓度与平衡表面张力之间的关系。当达到平衡表面张力后，可通过振荡界面面积来测量扩张模量。 <img alt="流变学方程 E*=A₀(∂γ/∂A)，用于描述流体动力学研究中的应力-应变关系。" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1">通过记录气泡表面积微小变化所引起 的表面张力变化， A32对于会形成自身内部结构（如缠结的聚合物或蛋白质）的更复杂界面，表面张力 γ 被更广义的表面应力所取代4,33, <img alt="方程：τ:E* = A₀(∂τ/∂A)，用于数学研究中动态平衡的描述。" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 2">.
呼吸过程中肺部的稳定性可能直接与维持肺泡气液界面的低表面张力和高膨胀模量有关9,10。所有肺部内表面均被一层连续的、厚度为微米级的上皮衬液薄膜覆盖，以维持组织的水合状态34。这种上皮衬液主要成分为水，还含有盐类以及多种蛋白质、酶、糖类和肺表面活性物质。与任何弯曲的液-气界面一样，毛细压力会在肺泡（或气泡）内部产生，且内部压力高于外部。然而，如果肺内各处的表面张力保持恒定，根据拉普拉斯方程 ΔP = 2γ/R，较小的肺泡内部压力将高于较大的肺泡，导致小肺泡内的气体流向压力较低的大肺泡。这种现象被称为“拉普拉斯不稳定性”9,35。其最终结果是，最小的肺泡会塌陷并被液体填充，难以重新扩张，导致部分肺组织塌陷，而其他区域则会过度膨胀，这两种情况均为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的典型症状。然而，在功能正常的肺中，随着呼吸过程中肺泡气-上皮液界面面积的扩张与收缩，表面张力会动态变化。如果 <img alt="静态平衡方程 ΔP/R, 2γ/R 求解；数学公式分析。" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3">，或 <img alt="不等式公式 (2E*−γ)&gt;0，用于静态平衡分析。" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4">，则拉普拉斯压力随半径减小而降低，随半径增大而升高，从而消除拉普拉斯不稳定性，实现肺部稳定9。因此，<img alt="复数模量 E*(ω)，粘弹性行为，材料分析，频域。" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 5"> 及其对频率、单分子层形态与组成以及肺泡液成分的依赖性，可能对肺部稳定性至关重要。CPM-CFM 还首次展示了界面曲率对表面活性剂吸附25、单分子层形态22和膨胀模量9的影响。CPM 中储液池体积较小（约 1 mL），可快速引入、移除或更换液相，并显著减少昂贵蛋白质或表面活性剂的使用量10。
CPM-CFM 图像中的对比度源于荧光标记的脂质或蛋白质在界面上的微小分布差异16,27。二维表面活性剂单分子层常因表面张力或表面压的变化而发生侧向相分离，<img alt="静态平衡方程 π=γ₀−γ；流体力学中表面张力差的概念" src="/files/ftp_upload/64110/64110eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 6"> 其中 π 表示洁净流体-流体界面的表面张力 γ0 与表面活性剂覆盖界面的表面张力 γ 之间的差值。π 可被视为界面上表面活性剂分子相互作用所产生的二维“压力”，其作用是降低纯流体的表面张力。在低表面压下，脂质单层处于类似液体的无序状态，称为液相扩展（LE）相。随着表面压升高，每个脂质分子所占面积减小，脂质分子之间发生取向排列，并可能发生一级相变，转变为长程有序的液相凝聚（LC）相16,20,27。在不同表面压下，LE 相与 LC 相可共存，且由于荧光标记的脂质被排除在 LC 相之外而富集于 LE 相，因此可通过成像观察到。因此，在 CFM 成像中，LE 相呈现亮区，而 LC 相呈现暗区16。
本文的目标是描述构建和操作组合式共聚焦显微镜微张力仪所需的步骤。这将使读者能够在微米尺度的气/水或油/水界面上，同时开展吸附研究、测量表面张力、流变行为以及观察界面形貌。内容包括如何拉制、切割和进行毛细管的疏水化处理，使用压力、曲率和表面积控制模式的操作说明，以及将不溶性表面活性剂转移至微张力仪弯曲界面的界面转移方法。

<table><tbody><tr><td>1.5 O.D. Tygon 软管</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>软管</td></tr><tr><td>A1RHD 多光子直立共聚焦显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>酸性清洗液</td><td></td><td></td><td>浓硫酸与 Alnochromix 按体积比 50% 用水稀释，待溶液澄清后方可进一步稀释</td></tr><tr><td>Alnochromix</td><td>Alconox</td><td>2510</td><td>与硫酸按包装说明混合后稀释，用于制备酸性清洗液</td></tr><tr><td>陶瓷玻璃切割器</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650471</td><td>HPLC Plus</td></tr><tr><td>Curosurf</td><td>Chiesi</td><td></td><td>&amp;nbsp;肺表面活性物质</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td>18.5 M&amp;Omega; - cm</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>任意品牌</td><td></td><td>200 proof 用于疏水化处理，变性乙醇用于清洗</td></tr><tr><td>Fiber-Lite Model 190 光纤照明系统</td><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td>281900100</td><td>光源；其他光源亦可使用</td></tr><tr><td>Flow EZ F69 mbar 带 Link 模块</td><td>Fluigent</td><td>LU-FEZ-0069</td><td>微流控泵</td></tr><tr><td>Fluigent SDK VIs</td><td>Fluigent</td><td></td><td>CPM 虚拟界面所必需</td></tr><tr><td>氟橡胶垫圈</td><td></td><td></td><td>由 1 mm 厚 Viton 片材加工而成，见图 3</td></tr><tr><td>气体过滤器</td><td>Norgren</td><td>F07-100-A3TG</td><td>安装于微流控泵与压力调节器之间</td></tr><tr><td>气体调节器</td><td>Norgren</td><td>10R0400R</td><td>将气源压力降至泵的工作范围，连接至气体过滤器，压力范围为 2–120 psi</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10</td><td>硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>任意品牌</td><td></td><td>75 mm × 25 mm</td></tr><tr><td>玻璃注射器</td><td>Hamilton</td><td>84878</td><td>25 &amp;mu;L 玻璃注射器</td></tr><tr><td>疏水化试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>667420</td><td>1H,1H,2H,2H-八氟辛基三乙氧基硅烷，纯度 98%；其他疏水性三乙氧基硅烷可替代</td></tr><tr><td>不溶性表面活性剂</td><td>Avanti</td><td>850355C-200mg</td><td>16:0 DPPC 溶于氯仿</td></tr><tr><td>LabVIEW 软件</td><td>National Instruments</td><td></td><td>2017</td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>ThorLabs</td><td>FEL0650</td><td>650 nm 长通滤光片，波长需能滤除激发激光频率</td></tr><tr><td>Lyso-PC</td><td>Avanti</td><td>855675P</td><td>16:0 Lyso PC 1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酰胆碱</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 可调速模拟控制泵系统，配&amp;nbsp;Easy-Load II 泵头</td><td>Masterflex</td><td>HV-77916-20</td><td>蠕动泵</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>R2019</td></tr><tr><td>微电极拉制仪 P-1000</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>毛细管拉制仪</td></tr><tr><td>微张力计样品池及支架</td><td></td><td></td><td>样品池由 PEEK 材料加工而成，支架由铝材加工而成，见图 3 和图 4</td></tr><tr><td>微张力计物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 &amp;infin;/0 WD 2.0 mm</td></tr><tr><td>NI 视觉开发模块</td><td>National Instruments</td><td></td><td>CPM 虚拟界面所必需</td></tr><tr><td>PEEK 手拧接头</td><td>IDEX</td><td>F-120x</td><td>10-32 锥形接口</td></tr><tr><td>PEEK 堵头</td><td>IDEX</td><td>P-551</td><td>10-31 锥形接口</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Eppendorf</td><td>22492225</td><td>100 &amp;mu;L - 1000 &amp;mu;L，已高压灭菌</td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>Thermo Scientific</td><td>6320-0010</td><td></td></tr><tr><td>塑料注射器</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>管路配件</td><td>Fischer Scientific</td><td></td><td>三通阀及其他管路配件，用于连接软管</td></tr><tr><td>Research Plus 单通道 100 &amp;mu;L&amp;ndash;1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td>微量移液器</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>任意品牌</td><td></td><td>用于配制酸性清洗液</td></tr><tr><td>T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm</td><td>Nikon</td><td></td><td>共聚焦显微镜物镜</td></tr><tr><td>Texas Red DHPE 三乙基铵盐</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>1395MP</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Gast</td><td>DOA-P704-AA</td><td></td></tr></tbody></table>

用于共聚焦显微镜观察动态界面的微张力测定仪

Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces

表面活性分子在流体-流体界面的吸附在自然界中普遍存在。表征这些界面需要测量表面活性剂的吸附速率，评估平衡表面张力随体相表面活性剂浓度的变化，并分析平衡后界面面积变化引起的表面张力响应。利用高速共聚焦显微镜进行荧光成像，可同时实现对界面的可视化，从而直接评估结构与功能之间的关系。在毛细管压力微张力仪（CPM）中，一个半球形气泡被固定在毛细管末端，浸入1 mL液体储液池中。通过调节气泡界面的毛细管压力实现控制 通过 一种商用微流控流体控制器，可根据拉普拉斯方程实现基于模型的压力、气泡曲率或气泡面积控制。与传统的朗缪尔槽和悬滴法等技术相比，该系统的测量与控制精度及响应时间显著提升；毛细压力的变化可在毫秒级时间内施加并实现精确控制。气泡界面的动态响应过程可被实时可视化观察。 通过 随着气泡的膨胀与收缩，通过第二片光学透镜进行观测。将气泡轮廓拟合为圆形轮廓，以确定气泡的曲率半径 R，以及任何偏离圆形的程度，后者可能导致结果无效。利用拉普拉斯方程计算界面的动态表面张力。在达到平衡后，可通过计算机控制的微流控泵施加微小的压力振荡，使气泡半径发生振荡（频率范围为 0.001–100 周/分钟），以测定扩张模量。该系统的整体尺寸足够小，可使微张力仪置于高速共聚焦显微镜的物镜下方，从而以亚微米级的横向分辨率对荧光标记的化学物质进行定量追踪。

测量误差的一个主要来源是毛细管在切割过程（图5A、B）或涂层过程（图5D）中产生的缺陷。这两类缺陷均会导致光学图像分析系统在确定气泡形状和尺寸时出现误差，从而导致表面张力值不准确。在将毛细管插入CPM之前，必须在光学显微镜下仔细检查每一根新制备的毛细管。有切割缺陷的毛细管必须弃用；而涂层不良的毛细管则可通过酸洗清洁后重新涂层，以改善毛细管末端的气泡钉扎效果（实验方案步骤2）。毛细管的最佳工作状态要求其端面切割完全垂直于毛细管轴线（图5C），且气泡恰好在毛细管末端处钉扎（图5E）。随着使用，毛细管上的疏水涂层在钉扎气泡方面的效果会逐渐下降，因此需要对毛细管进行重新清洗和重新涂层。
表面活性剂吸附随时间变化的代表性数据见图6。以往用于测量表...

本文描述了一种微张力计/共聚焦显微镜的设计与操作方法，可用于在观察界面形貌的同时，同步测量界面张力和界面膨胀流变学性质。该方法可实时构建在技术和生理过程中具有重要意义的界面结构-性能关系。

表面活性分子在流体-流体界面的吸附在自然界中普遍存在。表征这些界面需要测量表面活性剂……

该方法结合了共聚焦显微镜与毛细管压力微张力仪，形成一种强大的工具，可用于在高空间和时间分辨率下研究弯曲的流体-流体界面。该技术通过同时测量表面特性以及高度弯曲界面上的表面形貌共聚焦图像，能够探究表面活性物质的结构与功能关系。我们假设炎症产物会抑制肺表面活性物质，从而导致与急性呼吸窘迫综合征相关的呼吸问题。该装置可用于研究肺表面活性物质的性质和形态，以及肺在接触此类材料时的稳定性。首先，通过将毛细管的粗端插入细胞顶部，直至其穿过至细胞底部，从而组装CPM细胞。轻轻拧紧峰连接器以固定毛细管，然后将微流控泵的管路连接到毛细管的粗端。根据需要，将溶剂交换储液罐和/或温度控制浴连接至CPM细胞装置上相应的入口和出口。若不使用，则将未使用的入口和出口用堵头封闭。将CPM细胞装置固定于共聚焦显微镜载物台上，并大致对准CFM物镜、CPM相机和CPM光源。打开气体流量，使微流控泵在推荐的工作压力下运行，并确保毛细管的流量畅通。启动CPM虚拟界面，将基线压力设为25毫巴，并切换至压力控制模式。然后使用移液器将水注入CPM细胞中。使用微张力计相机对准毛细管尖端，并调整环形区域使其与气泡重叠。将共聚焦显微镜的浸没物镜与样品池中的液体接触，并使用共聚焦显微镜对气泡进行聚焦。点击“重置气泡”按钮，并确保形成一个新的气泡。如果气泡未破裂，请增加气泡重置选项卡中的重置压力或延长重置延迟时间，该选项卡位于观察窗口下方。通过直通进样器将水取出，排空后重新安装。用所需样品填充进样室。使用已灭菌的移液管，并将CPM软件保持在压力控制模式，确保当新气泡界面形成时，初始表面张力约为73毫牛顿每米。确定新形成气泡的半径后，将该数值输入中心线面积控制区域，然后单击面积控制标签，将控制类型切换为面积控制。开始记录共聚焦视频，随后单击“重置气泡”，并立即单击“采集数据”。通过滑动滑块，根据样品的总吸收时间调整数据记录速率。实验结束后，选择正确的文件路径并点击保存按钮以保存文件。同时在CFM上停止并保存记录。输入所需的基线值振荡百分比和振荡频率，并通过选择适当选项卡来确定振荡类型，即压力振荡、面积振荡或曲率振荡。开始记录共聚焦视频，并在CPM软件中点击采集数据。选择合适的数据采集速率，以确保每个振荡周期内获得足够数量的数据点。如果需要其他振荡幅度或频率，可在实验过程中更改相应数值并保存结果。首先，将蠕动泵的进液管插入装有所需置换溶液的瓶子中，将出液管插入废液容器中。在共聚焦软件中开始录制视频，然后点击CPM软件上的采集数据按钮。接下来，设置蠕动泵的转速。如果需要更换多种液体，请先停止蠕动泵，然后将入口连接至另一种更换溶液。交换过程结束后，按之前的方法保存结果。恒定压力吸收的微张力测定结果显示，气泡表面积在实验过程中显著增加，导致吸收速度远慢于表面积恒定的情况。在吸收过程中，界面的荧光信号初始较低，随着表面活性剂吸附至界面而逐渐增强。如果表面活性剂形成表面区域，则可观察到这些区域的形成和生长过程。在进行振荡研究时，只有被控制的参数的振荡才是真正的正弦波形。如图所示，在表面面积控制实验中，这一点在计算表面膨胀模量时非常重要，因为面积的振荡必须是正弦波形。通过振荡实验获得的表面张力和面积数据，可直接用于计算表面活性剂层的界面膨胀模量。在振荡磷脂单分子层时，可在连续的彩色液相扩展相中观察到黑色液体凝聚区域的运动。随着弯曲气泡上的振荡进行，界面上的这些明显区域会重组形成分支状网络结构，并逐渐扩展覆盖整个界面。这一点通过表面张力和表面膨胀模量的同时变化得到了证实。在对肺表面活性物质单分子层进行溶剂交换实验时，先使用缓冲溶液，然后加入Lasso PC溶液，随着交换过程的进行，其成膜区域的形态发生了显著变化。在实验过程中，必须通过视觉观察气泡的振荡和固定情况，以确保毛细管处于垂直状态且气泡保持球形。除了气-液界面外，还可以通过研究油-水界面来确定乳状液的稳定性和性质。该技术提供了一种单一变量方法，用于构建曲面界面的结构-性能关系，使得能够探索以往仅在平面界面上研究过的界面形态影响因素。

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科研

JoVE Journal

Engineering

工程

用于动态界面共聚焦显微镜可视化的微量天体测量仪

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

在本视频中，我们介绍了干涉反射显微镜（IRM）技术，用于在适当缓冲液存在下，对盖玻片表面生长的微管进行可视化观察。当入射光照射时，盖玻片-缓冲液界面和缓冲液-微管界面均会反射光线，这些反射光相互叠加形成干涉图样，从而能够在明亮背景上以高对比度图像清晰显示微管结构。...

无需标记的微管动力学干涉反射显微成像

整合素张力在多种细胞功能中发挥重要作用。利用一种整合式张力传感器，可对整合素张力进行皮牛顿（pN）级灵敏度的校准，并以亚微米分辨率成像。...

以整合型张力传感器实现亚微米分辨率的整合素张力与细胞力成像

本方案旨在指导如何在标准荧光显微镜上实施干涉反射显微技术，用于体外表面实验中对微管进行无标记、高对比度、高速成像。...

无标记、高速微管成像的干涉反射显微镜技术实现

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

同时可视化交联微管与单体微管的动力学行为 体外 通过全内反射荧光显微镜

TGT 表面是一种用于研究生长因子与整合素串扰的创新平台。该平台采用灵活的探针设计、特异性的黏附配体以及对刺激条件的精确调控，可对 EGFR 与整合素之间的相互作用进行可靠的定量评估。研究结果表明，EGFR...

用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

本方案详细描述了如何构建单物镜光片荧光显微镜，并用于观察细胞骨架网络。...

可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。...

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

了解微量天体测量仪与共聚焦显微镜联用技术，用于高时空分辨率研究弯曲液-液界面。该方法可同时测量界面张力与表面流变学特性，实时分析表面活性材料的结构-功能关系，为肺表面活性物质研究及呼吸窘迫综合征治疗提供新思路。

用于共聚焦显微镜观察动态界面的微张力测定仪

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