Name: 使用双极电极通过电点燃杏仁核创建颞叶癫痫小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习使用双极电极在小鼠杏仁核进行电点燃以建立颞叶癫痫模型。该低成本方案适用于神经科学和电生理学研究，可记录癫痫活动并探索内侧颞叶结构机制。

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本研究得到国家自然科学基金（编号：82030037、81871009）和北京市卫生健康委员会（11000022T000000444685）的资助。在本论文撰写过程中，我们感谢 TopEdit（www.topeditsci.com）提供的语言学协助。

本实验经首都医科大学宣武医院实验动物伦理委员会批准。所有小鼠均饲养于首都医科大学宣武医院的动物实验室。本方案分为四个部分：前两部分介绍使用滑环构建电极及电路连接脑电记录/刺激设备的方法；第三部分描述电极植入的手术操作方法；第四部分介绍用于杏仁核癫痫模型的脑电记录与刺激参数。
1. 电极的制备
<ol>
	<li>准备好以下预先制备的材料：两段长度为 3 cm 的聚四氟乙烯涂层钨丝（裸丝直径：76.2 µm），一段相同长度的银丝（裸丝直径：127 µm），以及一组 2 x 2 规格的排针。</li>
	<li>使用打火机烧灼每根钨丝的一端，以去除约 5 mm 的绝缘涂层。 
	注意：去除绝缘层后的钨丝端部会变黑；该变黑部分的钨丝称为上端。</li>
	<li>剥开一段极细的多股导线，并从底部开始向上缠绕至钨丝开始变暗的位置，继续缠绕至顶端。通过捏住一端并轻轻扭转另一端，将这种超细导线（质地柔软）与钨丝结合，使两种材料易于紧密绞合在一起。</li>
	<li>轻轻拉紧以确保缠绕牢固，并剪去多余的超细导线。在整个过程中尽量保持钨丝笔直。</li>
	<li>将排针固定在焊接台的夹具上，使针脚较长的一侧朝外。用注射器针头取适量焊膏，涂抹在针脚上。将焊接烙铁加热至 320 °C，用烙铁尖端熔化并涂抹无铅锡丝。</li>
	<li>将钨丝的上端与排针的一个针脚重叠，使用烙铁上的焊料将钨丝焊接到针脚上。 
	注意：若无超细导线辅助，直接将钨丝与针脚焊接将非常困难。</li>
	<li>以相同方式将另一根钨丝和银丝焊接到排针上，使每根导线对应一个针脚（见图 1,i）。</li>
	<li>裁剪两段略长于钨丝上端的热缩管，套在两根钨丝的焊点上，确保导电部分完全被热缩管覆盖，从而使两根钨丝的电路不形成串联。 
	注意：尽管共有三根导线，但若其中两根被绝缘，则三者不会串联；也可在银丝上加装热缩管。</li>
	<li>将电极从焊接台夹具上取下，用大钳子轻轻夹持电极，因为在加热热缩管时电极易变形；建议使用导热性良好的夹具并稍加力度固定。</li>
	<li>打开热风枪并加热至 320 °C，对热缩管吹热风数秒，直至其收缩紧贴（见图 1,ii）。</li>
	<li>若在焊接过程中针脚与塑料基体分离，可用热熔胶将焊接部位与塑料基体粘接固定（见图 1,iii）。注意避免将胶涂抹在接口处，以免影响后续接口插入。</li>
	<li>握住两根钨丝并将其相互绞合，保持末端分开（见图 1,iv）。将绞合后的钨丝修剪至约 10 mm 长，使末端间距不超过 0.5 mm。 
	&#8203;注意：此步骤也可在电极植入前进行，以便灵活调整电极长度。</li>
	<li>加热胶枪，并在电极周围均匀涂布胶水。</li>
	<li>使用万用表检查电极：将万用表的一个表笔接触排针未焊接的一侧，轻轻将钨丝或银丝的末端接触另一表笔，检查电路是否导通。确保各线路之间未形成串联。</li>
</ol>
2. 滑环连接与电路说明
注意：当将小鼠的电极连接至脑电图（EEG）设备时 通过 在自由活动条件下，当小鼠移动和转身时，电缆可能发生缠绕。这会导致电缆变短，最终阻碍小鼠活动，甚至导致电缆从其头部脱落。本文所述方法中引入了一个四通道滑环系统，以防止电缆脱落。四个通道在图中以四种不同颜色表示 图1B.
<ol>
	<li>在每端剥离 5 mm 的绝缘层，以露出内部的金属导线。</li>
	<li>在每个定子导线上套上一段热缩管。</li>
	<li>将每根导线与脑电设备连接器插头进行焊接。</li>
	<li>用热风使热缩管收缩。</li>
	<li>在每个转子导线上套上一段热缩管。</li>
	<li>将红色和橙色导线的导电部分拧在一起，并焊接至接线端子上的一个焊点，以适配排针。</li>
	<li>将另外两根导线分别焊接到接线端子的其他焊点上。 
	&#8203;注意：对应银色导线的棕色通道连接至脑电设备用于接地。红色和橙色通道接收来自同一根钨丝的信号，其中橙色通道作为脑电设备的参考通道。红色通道中的信号无实际意义，但必须与黑色通道共存以形成电流刺激。黑色通道中的信号是大脑中真实的电信号。可通过多通道滑环设计不同的电路，以适配不同的设备。</li>
</ol>
3. 植入手术
<ol>
	<li>动物
	<ol>
		<li>使用8周龄C57BL/6野生型雄性小鼠，体重24–26 g，进行手术。</li>
		<li>在温度可控的环境中（22 ± 1 °C）以12小时光照-黑暗循环（光照时间：8:00–20:00）饲养，并提供水和饲料 随意摄取.</li>
		<li>使用额外的加热垫在手术期间保持动物体温。</li>
		<li>术后，皮下注射美洛昔康（10 mg/kg）作为首次镇痛给药。随后将动物分别置于单独的笼具中，以优化恢复条件。术后第一周内在动物饮食中添加美洛昔康。</li>
		<li>实验结束后，在麻醉条件下用4%多聚甲醛灌注小鼠左心室，取脑组织进行电极靶点的组织学验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称重小鼠，并通过腹腔注射1%戊巴比妥溶液进行麻醉。将所有待用的手术器械和耗材（包括钻头、电极、牙科水泥等）进行高压灭菌消毒。</li>
	<li>当小鼠完全麻醉后，用剃刀剃除从眼睛到耳朵区域的毛发。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪上，前上门齿置于门齿杆，双侧耳棒等深插入耳道。为防止术中强光导致眼睛干涩或失明，涂抹红霉素眼膏于眼部。</li>
	<li>用碘伏和75%酒精以交替方式对术区进行三次环形擦拭消毒。然后，从该切口中点向前做矢状切口，并剪开切口两侧的皮肤，形成一个三角形窗口。</li>
	<li>将一小团棉球用3%过氧化氢浸湿，轻轻擦拭暴露的颅骨区域，去除附着的软组织，直至前囟和后囟清晰可见。</li>
	<li>调整前后高度，使前囟和后囟处于水平位置。以前囟的位置作为坐标轴的原点。</li>
	<li>使用钻头在左侧小脑颅骨处打磨出一个平整的表面，固定一枚不锈钢螺钉，确保螺钉有半部分露出颅骨。</li>
	<li>确保杏仁核点燃坐标的定位为前囟后方 −1.67 mm、外侧 −2.7 mm、腹侧 −4.9 mm。调整立体定位仪以定位该位置并做标记。</li>
	<li>在标记位置使用直径为0.5 mm的颅骨钻头钻孔。</li>
	<li>将电极固定在立体定位仪的定位杆上，将电极垂直置于孔上方，缓慢下降至 -4.9 mm 位置。将银丝在螺钉上缠绕三圈，操作过程中注意避免晃动电极本体。</li>
	<li>混合牙科水泥，并轻轻将其涂抹于电极和颅骨表面。待牙科水泥硬化后，修整外部形态，使包埋固定电极的水泥呈圆锥形。</li>
	<li>当水泥固化后，松开立体定位仪上的电极。皮下注射美洛昔康（10 mg/kg）以缓解动物因疼痛引起的不适。术后第一周内，在动物饲料中添加美洛昔康以发挥镇痛作用。将小鼠取出并放回笼中，单独饲养，避免与其他小鼠接触。</li>
</ol>
4. 电点燃
<ol>
	<li>手术后让小鼠至少休息1周再进行点燃，以确保术后恢复并使炎症消退。 
	注意：通常情况下，未充分恢复的小鼠对点燃反应不佳。</li>
	<li>将小鼠放入定制的盒子中，通过滑环电缆连接小鼠头部的电极和脑电图（EEG）设备。将电缆从盒子盖上的孔中穿过，并调整盒内电缆长度，使小鼠能够自由活动。</li>
	<li>打开EEG设备，检查其是否正常工作。将刺激器设置为输出持续1秒、频率60 Hz、脉宽1 ms的单相方波脉冲。</li>
	<li>首次刺激时使用50 µA的电流强度；监测脑电图中的后放电现象，其特征为高频尖峰。若未观察到后放电，则在下一次刺激时增加25 µA，每10分钟重复此过程，直至观察到持续5秒的后放电。 
	注意：如果实验无需诱发放电，可跳过步骤4.4；300 µA的电流强度已足以引发点燃。</li>
	<li>使用步骤4.3确定的电流强度，每隔15分钟刺激一次小鼠，每日不超过20次。</li>
	<li>监测小鼠对刺激的行为反应。 
	注意：连续出现三次V级发作被视为完全点燃，结合Racine评分标准17。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

癫痫是一组具有多种表现形式和不同病因的疾病18；需要注意的是，没有单一模型适用于所有类型的癫痫，研究人员必须根据具体研究选择合适的模型。本研究介绍了一种最易实现的电极制备方法。该方法的各个部分均可调整，以适应不同的实验条件。
该方法采用兼具刺激和记录功能的电极，减少了因分别植入刺激电极和脑电图（EEG）记录电极而对动物大脑造成的损伤。在制备电极时，可选择不同尺寸的排针。大号排针能够与滑环实现最牢固的连接；然而，当需要在动物头部植入多个器件时，可选用占用空间更小、操作更方便的小型排针，并使用多通道滑环连接所有植入的电极。滑环可焊接不同类型接口，以满足不同实验室脑电设备的需求。此外，滑环可使动物自由活动，避免导线缠绕。
为确保电极在长时间内不会脱落，需在颅骨完全干燥后涂抹牙科水泥。预先在颅骨表面做几条横向和纵向切口，也可增强固定效果。术后动物至少需要恢复一周时间，以使炎症消退，必要时可适当使用抗炎药物以促进恢复。在此期间不建议进行其他实验。
<p class="jove_co...

颞叶癫痫（TLE）是最常见的癫痫类型，且易发展为耐药性癫痫。选择性杏仁核海马切除术等外科手术是治疗TLE的有效方法，但该疾病的致痫机制和发作机制仍在研究中1,2。研究表明，TLE的发病不仅发生在海马，还广泛涉及杏仁核3,4。例如，杏仁核硬化和杏仁核增大均被频繁报道为TLE发作的起源5,6。杏仁核的重要性不容忽视；建立杏仁核模型对于研究癫痫发生至关重要，目前迫切需要对该模型进行清晰的阐述。
已有多种方法被提出用于在动物模型中诱导癫痫发作。过去，通常在早期阶段通过腹腔注射致痫药物7。尽管该方法操作简便，但癫痫灶的位置不确定。随着立体定位技术的发展以及详细的动物脑图谱的建立，颅内给药被应用于解决定位问题8。然而，在急性期缺乏对严重发作的有效干预，导致较高的死亡率，且慢性自发性发作常伴随发作间期和发作频率不稳定的问题9,10。最终，电点燃法被发展起来；该方法通过周期性地多次刺激特定脑区，能够精确控制癫痫发作的位置和起始时间11。
该方法的一个优点是，颅内电极植入具有最小的侵入性12。此外，通过终止刺激可控制癫痫发作的严重程度，从而降低由发作引起的死亡率。这些改进克服了以往方法的不足。值得注意的是，该模型能够充分模拟人类癫痫发作，尤其适用于癫痫持续状态（SE）的研究，因为它能够快速诱导SE13。该模型还可用于抗癫痫药物筛选14以及癫痫发病机制的相关研究。最后，众所周知，杏仁核与记忆调节、奖赏处理和情绪密切相关15。这些心理功能障碍在癫痫患者中常有发生，因此，杏仁核癫痫模型可能是研究癫痫相关情绪问题的更优选择16。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的驴抗兔 IgG</td><td>invitrogen</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>c-Fos 抗体</td><td></td><td>ab222699</td><td></td></tr><tr><td>颅骨钻</td><td>SANS</td><td>SA302</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>NISSIN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脑电图记录与刺激设备</td><td>Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd</td><td>NSHHFS-210803</td><td></td></tr><tr><td>无铅锡线</td><td>BAKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>插针排/插座排</td><td>XIANMISI</td><td></td><td>间距为 1.27 mm</td></tr><tr><td>银线</td><td>A-M systems</td><td>786000</td><td></td></tr><tr><td>滑环</td><td>Senring Electronics Co.,Ltd</td><td>SNM008-04</td><td></td></tr><tr><td>钨丝</td><td>A-M systems</td><td>796000</td><td></td></tr><tr><td>超细多股线</td><td>深圳成兴线缆</td><td>UL10064-FEP</td><td></td></tr><tr><td>焊接设备</td><td>BAKON</td><td>BK881</td><td></td></tr></tbody></table>

利用双极电极通过杏仁核电点燃建立颞叶癫痫小鼠模型

Using a Bipolar Electrode to Create a Temporal Lobe Epilepsy Mouse Model by Electrical Kindling of the Amygdala

杏仁核是癫痫发作最常见的起源之一，杏仁核小鼠模型对于癫痫研究至关重要。然而，目前很少有研究详细描述该模型的实验方案。本文详细阐述了杏仁核电点燃癫痫模型制备的完整过程，并介绍了一种双极电极的制备方法。该电极兼具刺激与记录功能，可避免因植入分别用于刺激和记录的独立电极而造成的脑组织损伤。为实现长期脑电图（EEG）记录，实验中采用滑环装置，以消除因导线缠绕或脱落导致的记录中断。
在对基底外侧杏仁核（前囟后 1.67 mm，外侧 2.7 mm，腹侧 4.9 mm）进行周期性刺激（60 Hz，每次 1 秒，每 15 分钟一次），平均刺激 19.83 ± 5.742 次后，六只小鼠均出现完全点燃现象（定义为根据 Racine 评分标准出现三次连续的 V 级发作）。在整个点燃过程中持续记录颅内脑电图，点燃后观察到杏仁核区域持续 20–70 秒的癫痫样放电。因此，该方法是一种可靠的模拟起源于杏仁核的癫痫模型，适用于研究杏仁核在颞叶癫痫中的作用。本研究为今后探讨内侧颞叶癫痫的发病机制及新型抗癫痫发生药物提供了重要基础。

电极和电路可实现脑电图的记录并发挥刺激作用（图1）；该设计避免了分别植入记录和刺激电极的复杂性，并最大限度地减少对脑组织的损伤。滑环的应用使得电极能够与各类设备连接。
我们对六只健康的成年雄性C57BL/6小鼠进行了电极植入手术，术后2周开始进行电刺激。随着刺激次数的增加，行为性癫痫发作程度逐渐加重，分级依据Racine评分标准：1分 = 口部或面部自动症；2分 = 两次或以下肌阵挛性抽动；3分 = 三次或以上肌阵挛性抽动和/或前肢阵挛；4分 = 前肢和后躯强直-阵挛性伸展；5分 = 伴有直立和跌倒的前肢和后躯强直-阵挛性伸展；6分 = 伴有疯狂奔跑或跳跃的前肢和后躯强直-阵挛性伸展14。记录达到完全点燃所需的刺激次数（表1）。
完全点燃后进行刺激的脑电图代表性结果如图2所示。后放电持续5-15秒；随后，颅内自发性放电增强，并开...

杏仁核在颞叶癫痫的发生和传播中起着关键作用，该癫痫起源于此结构并由此扩散。本文详细描述了兼具记录和刺激功能的深部脑电极的制备方法，并介绍了一种起源于杏仁核的内侧颞叶癫痫模型。

杏仁核是癫痫发作最常见的起源之一，杏仁核小鼠模型对于阐释癫痫机制至关重要。然而，少数……

本方案提出了一种以杏仁核为起源的癫痫模型。该模型为研究内侧颞叶结构奠定了基础，可被视为本实验的理论依据。由于该方案成本较低且效率高，因此可在大多数实验室快速开展。演示该实验操作的是本实验室的研究生Yongchang Lu。首先准备预先制备好的组件，包括长度为2厘米、涂有聚四氟乙烯的钨丝，其线径为76.2 µm。取一段长度相同的直径为127微米的银丝，以及一组2×2规格的绳状插针。使用打火机灼烧每根钨丝的一端，以去除五毫米长的绝缘涂层。剥离一段超细多股导线的绝缘层。从底部开始向上端解开，直至颜色变深并继续延伸至顶端。通过夹住一端并轻轻扭转另一端，将这种超细金属丝与钨丝结合，使两种材料易于相互缠绕。轻轻拉拽以确保金属丝紧密缠绕，并剪去多余的超细金属丝。在整个过程中尽量保持钨丝笔直。将绳状引脚固定在焊接台的夹具上，引脚较长的一端朝外。用注射器针头取适量焊膏，并将其涂抹到引脚上。将焊接烙铁加热至 320 摄氏度。用烙铁尖端熔化并涂抹一些无铅锡丝。将钨丝的上端与绳状针的一根针重叠，并利用烙铁上的焊料将钨丝焊接到针上。以相同方式将另一根钨丝和另一根银丝焊接至绳状针脚，使每根导线对应一根针。剪取两段略长于钨丝上端的热缩管，套在两根钨丝的焊点上，确保导电部分完全被热缩管覆盖，从而使两根钨丝的电路不会串联在一起。将电极从焊接台夹具上取下，并用大钳子轻轻夹住电极，因为在加热热缩管时电极易变形。使用导热性能良好的夹具，并稍加用力夹紧。打开通风装置并加热，直至温度达到320摄氏度。用热风枪吹热缩管数秒钟，直至其收缩紧固。使用热熔胶加固电极。捏住两根钨丝，将其相互绞合，但保持末端彼此分离。将扭曲的钨丝剪至约10毫米长，使末端间距不超过0.5毫米。使用万用表检测电极：将万用表的一个表笔接触绳状引脚未焊接的一端，轻轻将钨丝或银丝的末端接触另一个表笔，检查电路是否通畅。确保线路不要串联。将每根导线末端的绝缘外皮剥离五毫米，以露出内部的金属导线。在每根起始导线上套入一段热缩管。将每根导线与脑电图设备连接器插头焊接。使用热风收缩热缩管。在每个转子导线上加一段热缩管。将红色和橙色电线的导电部分拧在一起，并焊接至接头和接线端子，以适配绳状插脚。将另外两根电线分别焊接在接线端子的每个接头上。称量小鼠的体重。当小鼠完全麻醉后，用剃刀剃除从眼睛到耳朵区域的毛发。将小鼠固定在立体定位仪上，将上门齿放入门齿杆中，并将双侧耳棒以相同的深度插入耳朵中。涂抹红霉素眼膏以防止手术期间因强光照射导致的眼睛干燥和失明。使用碘伏和75%酒精交替擦拭，至少对手术区域进行三次消毒。作纵向切口以充分暴露手术区域，或作三角形切口，只要能暴露前囟和后囟以及电极植入位置即可。将一小块棉花揉成球状，用3%过氧化氢润湿。用棉球轻轻擦拭暴露的颅骨区域，去除附着的软组织，直至观察到前囟和后囟。调整前部和后部高度，使前囟和后囟处于水平位置。以前囟的位置作为坐标轴的原点。将不锈钢螺钉固定于左侧小脑颅骨处。根据前囟确定杏仁核点燃的坐标，并调整立体定位仪以定位该位置，做好标记。使用直径为0.5毫米的颅骨钻头在标记位置钻孔。将电极固定在立体定位仪的定位杆上。将电极垂直置于孔上方，并缓慢下降至负4.9毫米位置。将银丝在螺丝上缠绕三圈，操作时注意不要晃动电极主体。混合牙科水泥，并轻轻涂抹于电极和颅骨表面。当牙科水泥硬化后，修整其外部，直至包埋固定电极的水泥呈圆锥形。然后将电极从立体定位仪上松开。取出小鼠并放回笼中。将其与其他小鼠分开放置。将小鼠放入一个定制的盒子中，盒内有滑环电缆连接小鼠头部的电极和脑电图（EEG）设备。将电缆从盒盖上的孔中穿过，并调整盒内电缆的长度，以允许小鼠自由活动。打开脑电图设备并确保其正常工作。将刺激器参数设置为在10次刺激周期中，以60赫兹频率、持续1秒的串脉冲，输出持续时间为1毫秒的单相方波脉冲。首次刺激的电流强度从50微安开始。监测脑电图（EEG）中是否出现以高频尖波为特征的发作后放电。若未观察到发作后放电，则在下一次刺激时增加25微安电流，并每10分钟重复此过程，直至观察到持续至少五秒的发作后放电为止。以确定的电流强度每15分钟对小鼠进行一次刺激，每日刺激次数不超过20次。监测动物对刺激的行为反应。对六只健康的成年雄性C57黑6小鼠进行了电极植入手术，并在术后两周开始进行电刺激。随着刺激次数的增加，行为性癫痫发作程度逐渐加重，并记录达到完全点燃所需的刺激次数。放电后的脑电图持续时间为5到15秒。随后，颅内自发性放电增强，并开始出现行为学症状。癫痫发作持续时间通常少于一分钟，这降低了因严重抽搐导致呼吸暂停而引发的死亡风险。完全点燃后两小时，通过免疫组织化学法检测脑组织中 c-Fos 的表达。结果显示，同侧杏仁核中 c-Fos 的表达显著增加，验证了该模型的可行性。钨丝末端的间距不应超过半毫米，否则将无法穿过脑部小孔。电极的长度不应过长，否则会影响小鼠的活动能力。

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来源：Slezia, A. et al. 电泳递送γ-氨基丁酸（GABA）至癫痫灶可预防小鼠癫痫发作。J. Vis. Exp.

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利用双极电极通过杏仁核电点燃建立颞叶癫痫小鼠模型

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