利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

该方案可实现肌肉细胞中任意基因的敲除，从而进一步研究该基因在肌肉中的功能。其优势在于，相较于构建基因敲除动物模型来研究特定基因，该技术成本更低且耗时更短。例如，该技术可用于研究新发现的基因在肌病发生中的作用。

如果将此处所述技术应用于诱导多能干细胞（iPS细胞），则可实现任何类型细胞中任意基因的敲除。开始进行规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）介导的基因删除时，首先使用 ensembl.org 等基因组浏览器工具，确定目标基因及其两侧的DNA序列。

要获取基因外显子列表，首先点击蛋白质编码序列的转录本，然后点击“外显子”。接着点击“下载序列”，并仅选择“基因组序列”，以下载该基因的完整共识序列。滚动查看该基因的外显子和内含子列表，以选择目标外显子或内含子。

设计向导RNA时，首先选择位于目标序列上下游的内含子的核苷酸序列。然后访问诸如crispr.tefor.net之类的网站，利用所选序列设计两条向导RNA，每条长度为20个核苷酸，不含原间隔序列邻近基序（PAM），且两条序列之间相隔数百个碱基对。

接下来，确定每条向导RNA的反向互补序列并订购引物。为了构建用于质粒克隆的向导RNA表达盒，首先根据文中所述配方和程序，使用一组引物进行PCR扩增，然后在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中通过1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。随后切下300 bp的DNA片段，并使用试剂盒进行纯化。

类似地，在使用另一对引物进行另一轮 PCR 后，将一个长度为 400 个碱基对的 DNA 片段纯化至 20 µL 洗脱缓冲液中。为了将引导 RNA 表达盒插入慢病毒质粒骨架中，首先按照文中所述，用限制性内切酶 Xma I 和 Blp I 对质粒进行双酶切反应。将反应管在 37°C 下孵育 1 小时后，再于 65°C 下孵育 20 分钟，随后将酶切产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并使用合适的试剂盒纯化出长度约为 10 千碱基对的质粒。

同时通过测量光密度来定量纯化后的产品。为了将引导RNA片段与质粒连接，准备一个反应体系，包含纯化的引导RNA、线性化质粒DNA、酶和水，总体积为10微升，然后将反应管在50摄氏度孵育15分钟，以生成最终的质粒，命名为pGuide。进行慢病毒生产时，首先在含有高糖和丙酮酸的DMEM培养基中，加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素或链霉素，将100万个HEK 293细胞接种至145平方厘米培养皿中。

然后在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养细胞三天。第四天检查细胞，确保细胞融合度达到60%至65%。接着准备转染溶液，其中包含目的质粒、编码病毒包膜的质粒、慢病毒包装质粒psPAX2以及磷酸钙。

用水调整终体积至 1000 微升。然后在搅拌条件下，将转染溶液逐滴加入 1 毫升 2X HBS 中，室温孵育至少 10 分钟。之后，将溶液逐滴加入细胞中。

为了使转染溶液分布均匀，轻轻倾斜培养板至各个方向，然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育至少5小时。接着，从培养板中移除培养基，并用PBS洗涤细胞以去除转染试剂，然后加入12毫升新鲜培养基。在37摄氏度孵育48小时后，将所有培养板中的培养基收集至一个离心管中。

将离心管放入密封桶中，在4°C条件下以800 × g离心5分钟，然后使用0.45微米滤膜过滤上清液，并将滤液在4°C条件下使用摆桶转子以68,300 × g离心2小时。弃去上清液后，将离心管倒置放在生物安全柜内的纸巾上，静置5至10分钟，以最大限度去除沉淀中的残留液体。加入100微升HEC增殖培养基，将离心管置于4°C环境中至少2小时。

然后用移液器重悬沉淀。收集所有重悬的沉淀后，分装成10或25微升的等份，经液氢速冻后，于-80摄氏度保存。进行成肌细胞转导时，首先在96孔板的每孔中接种100微升增殖培养基，其中含有10,000个成肌细胞。

第二天，在生物安全柜中向细胞中加入预先计算好的LV向导RNA和LV Cas9的体积。孵育五天后，加入胰蛋白酶使细胞从孔中脱落。计数细胞数量后，将汇合度为40%至50%的孔中的细胞转移至新培养板中。

孵育5小时后，加入计算好体积的慢病毒杀伤剂，感染复数为20，继续孵育5至10天，或至少传代两次。为通过钙成像对基因编辑克隆进行功能表征，将50,000个细胞接种于经层粘连蛋白包被的35毫米培养皿中央。为诱导分化，请按照文中所述加入分化培养基。

孵育六天后，移除培养基，并用疏水性笔标记细胞区域。然后向已分化的成肌细胞管中加入50微升Fluo-4 Direct染料，该染料用分化培养基按1:1比例稀释。在37摄氏度孵育30分钟后，用添加了1毫克/毫升葡萄糖的Krebs缓冲液洗涤细胞两次。

接下来，使用倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜，配备10倍物镜，以每秒一帧的速率连续采集90秒的荧光变化图像，并选择包含至少10个肌管的视野。去除多余的Krebs缓冲液后，加入2毫升氯化钾溶液以诱导细胞膜去极化，或加入2毫升氟氯酚蓝间甲酚（florochloral metacresol）、4CmC，或直接刺激RyR1受体。刺激后观察荧光变化，随后对每个肌管的荧光变化进行定量分析。

该方案可成功用于从人成肌细胞中敲除RyR1基因，导致细胞中基因组DNA变短。在蛋白水平上也证实了RyR1的敲除，因为通过Western blot检测无法在靶向细胞中检测到RyR1蛋白。进一步通过Fluo-4钙成像验证了由RyR1敲除细胞分化而来的肌管中RyR1活性的缺失，分别采用4CmC直接激活RyR1或通过氯化钾诱导膜去极化进行间接刺激。

待删除的序列应为预测功能性蛋白所必需。该技术非常适合用于开发基因组后研究工具，以研究新基因在肌肉疾病中的作用。