Name: 使用慢病毒介导的CRISPR / Cas9基因编辑开发敲除肌肉细胞系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建肌肉细胞敲除模型，以高效研究基因在肌肉发育和肌病中的功能。该方法比传统动物模型更快速经济。

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本工作由法国肌病协会（AFM-Téléthon）和奥弗涅-罗讷-阿尔卑斯大区（AURA）的资助项目提供经费支持。

<ol><li>Claussnitzer, M., Susztak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gaining+insight+into+metabolic+diseases+from+human+genetic+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries.</a> Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).</li>
<li>Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR+tools+for+variant+interpretation+and+disease+modeling+in+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies.</a> Genes. 11 (5), 473(2020).</li>
<li>Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+therapeutics%3A+current+challenges+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+correction+of+muscular+dystrophy+by+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).</li>
<li>Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+specificity+of+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Target specificity of the CRISPR-Cas9 system.</a> Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).</li>
<li>Merienne, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-inactivating+KamiCas9+system+for+the+editing+of+CNS+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes.</a> Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).</li>
<li>Marty, I., Fauré, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation-contraction+coupling+alterations+in+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Excitation-contraction coupling alterations in myopathies.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).</li>
<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).</li>
<li>Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick%2C+cost-free+method+of+purification+of+DNA+fragments+from+agarose+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel.</a> Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).</li>
<li>Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+and+type+1+ryanodine+receptors+are+localized+in+triads+of+the+same+mammalian+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).</li>
<li>Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+linear+Lowry--Folin+assay+for+both+water-soluble+and+sodium+dodecyl+sulfate-solubilized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins.</a> Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).</li>
<li>Garibaldi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dusty+core+disease%27+%28DuCD%29%3A+expanding+morphological+spectrum+of+RYR1+recessive+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3(2019).</li>
<li>Marty, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+for+a+complex+involving+Dihydropyridine+receptor+and+Ryanodine+receptor+in+triad+junctions+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).</li>
<li>Oddoux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triadin+deletion+induces+impaired+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>Cacheux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+central+core+disease+RyR1+mutation+%28p.Y4864H%29+associated+with+quantitative+defect+in+RyR1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).</li>
<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
<li>Leenay, R. T., Beisel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering%2C+communicating%2C+and+engineering+the+CRISPR+PAM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).</li>
<li>Salmon, P., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titration+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Production and titration of lentiviral vectors.</a> Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对参与病理过程但功能未知的基因进行表征，其关键步骤之一是建立相关的细胞模型以研究这些基因的功能。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的研究领域正在呈指数级增长，而本文所介绍的基因敲除模型的构建正是其中应用最广泛的技术之一。在此背景下，我们提出了一种通用的实验方案，用于构建针对任意目的基因的人源细胞系敲除模型，从而能够在相关的人类细胞模型中对该基因进行功能表征。本方案适用于永生化成肌细胞以及诱导多能干细胞（iPSC），因此理论上可应用于构建任何目的基因的人源细胞敲除模型。
该方法的局限性在于，应将其应用于永生化细胞，因为该过程需要数周的培养、细胞克隆以及多次连续扩增。或者，也可使用能够扩增并维持培养数周至数月的细胞。采用此方法，针对目的基因（此处为 RYR1 基因）敲除的人类永生化肌肉细胞系可在约3至4个月内构建完成（不包括细胞功能表征所需时间）。
该策略适用于难以转染的细胞（如肌细胞），因为它依赖慢病毒将所有工具导入靶细胞，因此比转染或电穿孔等其他方法更有效。其主要缺点是会整合到宿主基因组中；为避免慢病毒对...

随着基因测序技术的进步以及在特定组织中发现功能未知基因的突变，建立相应的细胞模型以研究新靶基因的功能并验证其在相关病理生理机制中的作用，已成为一项至关重要的工具。此外，这些模型对于未来的治疗开发具有重要意义1,2，并且相较于直接构建基因敲除动物模型，它们提供了一种符合国际减少实验动物使用建议的可行替代方案。利用CRISPR/Cas9进行基因编辑是目前最强大的工具之一，已成功用于构建大量基因敲除/敲入模型，而基于CRISPR/Cas9的靶向基因验证也是该技术应用最为广泛的领域之一3。基因编辑的成功依赖于将CRISPR工具（即向导RNA和核酸酶Cas9）有效递送至目标细胞模型，然而在许多转染困难的细胞（如肌细胞）中，这一过程仍具挑战性4。使用病毒载体（通常为慢病毒）可克服这一难题，其主要优势在于能够高效转导多种细胞类型并递送外源基因。但其主要缺点是外源基因会整合到宿主细胞基因组中，可能导致整合位点附近基因发生改变，并引起外源基因的持续表达；以核酸酶Cas9为例，其长期表达可能带来严重的细胞损伤5。Merienne及其同事提出了一种巧妙的解决方案6，即向细胞中导入一种靶向Cas9基因自身的向导RNA，从而实现Cas9的失活。本文介绍的是一种对该策略的改进方案，提供了一种用户友好且用途广泛的实验流程，可用于在转染困难的细胞中实现几乎任意基因的敲除。
本方案旨在诱导永生化肌肉细胞中目标基因的失活。该方法可用于在不同类型的永生化细胞中敲除任何目标基因。本文所述方案包括设计向导RNA并将其克隆至慢病毒质粒、在慢病毒载体中构建CRISPR工具、利用不同慢病毒感染细胞，以及对细胞进行单克隆筛选以获得均一的基因编辑细胞系。
利用本实验方案，已成功构建出缺失1型兰尼碱受体（RyR1）的永生化人骨骼肌细胞系。RyR1是一种参与细胞内钙释放及肌肉收缩的关键钙离子通道7。该基因的敲除（KO）已在蛋白水平通过Western blot检测确认，并在功能水平通过钙成像技术加以验证。

<table><tbody><tr><td>抗CACNA1S抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>CalPhos 哺乳动物转染试剂盒</td><td>Takara</td><td>631312&amp;nbsp;</td><td>转染试剂盒</td></tr><tr><td>Easy blot 抗小鼠IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP二抗</td></tr><tr><td>Easy blot 抗兔IgG</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP二抗</td></tr><tr><td>Fluo-4 direct</td><td>Molecular Probes</td><td>F10472</td><td>钙成像</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) 兔单克隆抗体&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>一抗</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>连接试剂盒</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity with GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>含高保真Taq DNA聚合酶和dNTPs的PCR反应混合液</td></tr><tr><td>肌球蛋白重链抗体</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>一抗</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&amp;nbsp;740424</td><td>质粒纯化用大提试剂盒</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>DNA纯化</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952</td><td>从细胞中提取DNA的试剂盒</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 化学感受态&amp;nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>化学感受态细胞</td></tr><tr><td>质粒 #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>编码SpCas9的慢病毒质粒（用于LV-Cas9）</td></tr><tr><td>质粒 #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>用于插入向导序列盒的慢病毒骨架质粒（用于LV-guide-target）</td></tr><tr><td>质粒 #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>编码慢病毒包装蛋白GAG POL的慢病毒质粒</td></tr><tr><td>质粒 #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>编码包膜蛋白的慢病毒质粒，用于产生慢病毒和MuLV逆转录病毒颗粒</td></tr><tr><td>V5标签单克隆抗体</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&amp;nbsp;</td><td>一抗</td></tr><tr><td>XL10-Gold 超感受态细胞</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>化学感受态细胞</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>限制性内切酶</td></tr></tbody></table>

利用慢病毒介导的crispr/cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 的一个重要应用是构建基因敲除细胞系，特别是用于研究在遗传诊断过程中发现的与疾病相关的新基因/蛋白质的功能。在构建此类细胞系时，需要解决两个关键问题：一是将CRISPR工具（Cas9和向导RNA）高效导入目标细胞，二是将Cas9的活性限制在特异性删除目标基因的范围内。本文所述的方案专门针对难以转染的细胞（如肌肉细胞）中CRISPR工具的导入。该方案基于使用慢病毒进行递送，所用质粒公开可得，并详细描述了所有克隆步骤，以靶向特定目的基因。Cas9活性的控制则采用了一种此前报道的KamiCas9系统的改良版本，即通过慢病毒转导表达靶向Cas9的向导RNA，从而逐步消除Cas9的表达。本方案已成功应用于构建RYR1基因敲除的人源肌肉细胞系，并在蛋白水平和功能水平上对该细胞系进行了进一步表征，以确认这一关键钙离子通道基因的敲除效果；该基因参与肌肉细胞内钙释放及兴奋-收缩耦联过程。本文所述方法可轻松推广至肌肉细胞或其他难转染细胞中其他基因的研究，为在人源细胞中研究这些基因提供有价值的工具。

本方案应用于来自健康受试者的永生化成肌细胞15（即所谓的人类成肌细胞，简称HM细胞），其中RyR1已得到先前表征16，旨在敲除编码RyR1蛋白的RYR1基因。向导RNA的设计目标是删除包含基因第101外显子部分区域及第101内含子的序列。预计第101外显子部分区域的缺失将导致读码框中断。此外，第101外显子编码蛋白的孔道区域，因此对于功能性钙通道的形成至关重要。许多患有严重RyR1相关肌病的患者在该基因区域存在突变7。我们使用Crispor软件预测并选择最优向导RNA，以尽可能减少脱靶效应，同时保持最高编辑效率。我们选择在同一病毒载体中同时使用两条向导RNA，以确保大部分细胞实现基因敲除，并便于通过PCR检测编辑后克隆中的缺失情况。两条选定的向导RNA（见表2和图1）分别位于第101外显子末端和第101内含子起始端，导致326 bp片段的缺失及随后的读码框移位。这可确保编辑后的细胞为<...

本方案介绍了如何从设计向导RNA开始，到细胞克隆及基因敲除克隆的鉴定，利用CRISPR/Cas9技术生成敲除型成肌细胞。

利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

CRISPR/Cas9 的一个重要应用是构建基因敲除细胞系，……

该方案可实现肌肉细胞中任意基因的敲除，从而进一步研究该基因在肌肉中的功能。其优势在于，相较于构建基因敲除动物模型来研究特定基因，该技术成本更低且耗时更短。例如，该技术可用于研究新发现的基因在肌病发生中的作用。如果将此处所述技术应用于诱导多能干细胞（iPS细胞），则可实现任何类型细胞中任意基因的敲除。开始进行规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）介导的基因删除时，首先使用 ensembl.org 等基因组浏览器工具，确定目标基因及其两侧的DNA序列。要获取基因外显子列表，首先点击蛋白质编码序列的转录本，然后点击“外显子”。接着点击“下载序列”，并仅选择“基因组序列”，以下载该基因的完整共识序列。滚动查看该基因的外显子和内含子列表，以选择目标外显子或内含子。设计向导RNA时，首先选择位于目标序列上下游的内含子的核苷酸序列。然后访问诸如crispr.tefor.net之类的网站，利用所选序列设计两条向导RNA，每条长度为20个核苷酸，不含原间隔序列邻近基序（PAM），且两条序列之间相隔数百个碱基对。接下来，确定每条向导RNA的反向互补序列并订购引物。为了构建用于质粒克隆的向导RNA表达盒，首先根据文中所述配方和程序，使用一组引物进行PCR扩增，然后在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中通过1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。随后切下300 bp的DNA片段，并使用试剂盒进行纯化。类似地，在使用另一对引物进行另一轮 PCR 后，将一个长度为 400 个碱基对的 DNA 片段纯化至 20 µL 洗脱缓冲液中。为了将引导 RNA 表达盒插入慢病毒质粒骨架中，首先按照文中所述，用限制性内切酶 Xma I 和 Blp I 对质粒进行双酶切反应。将反应管在 37°C 下孵育 1 小时后，再于 65°C 下孵育 20 分钟，随后将酶切产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，并使用合适的试剂盒纯化出长度约为 10 千碱基对的质粒。同时通过测量光密度来定量纯化后的产品。为了将引导RNA片段与质粒连接，准备一个反应体系，包含纯化的引导RNA、线性化质粒DNA、酶和水，总体积为10微升，然后将反应管在50摄氏度孵育15分钟，以生成最终的质粒，命名为pGuide。进行慢病毒生产时，首先在含有高糖和丙酮酸的DMEM培养基中，加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素或链霉素，将100万个HEK 293细胞接种至145平方厘米培养皿中。然后在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中培养细胞三天。第四天检查细胞，确保细胞融合度达到60%至65%。接着准备转染溶液，其中包含目的质粒、编码病毒包膜的质粒、慢病毒包装质粒psPAX2以及磷酸钙。用水调整终体积至 1000 微升。然后在搅拌条件下，将转染溶液逐滴加入 1 毫升 2X HBS 中，室温孵育至少 10 分钟。之后，将溶液逐滴加入细胞中。为了使转染溶液分布均匀，轻轻倾斜培养板至各个方向，然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育至少5小时。接着，从培养板中移除培养基，并用PBS洗涤细胞以去除转染试剂，然后加入12毫升新鲜培养基。在37摄氏度孵育48小时后，将所有培养板中的培养基收集至一个离心管中。将离心管放入密封桶中，在4°C条件下以800 × g离心5分钟，然后使用0.45微米滤膜过滤上清液，并将滤液在4°C条件下使用摆桶转子以68,300 × g离心2小时。弃去上清液后，将离心管倒置放在生物安全柜内的纸巾上，静置5至10分钟，以最大限度去除沉淀中的残留液体。加入100微升HEC增殖培养基，将离心管置于4°C环境中至少2小时。然后用移液器重悬沉淀。收集所有重悬的沉淀后，分装成10或25微升的等份，经液氢速冻后，于-80摄氏度保存。进行成肌细胞转导时，首先在96孔板的每孔中接种100微升增殖培养基，其中含有10,000个成肌细胞。第二天，在生物安全柜中向细胞中加入预先计算好的LV向导RNA和LV Cas9的体积。孵育五天后，加入胰蛋白酶使细胞从孔中脱落。计数细胞数量后，将汇合度为40%至50%的孔中的细胞转移至新培养板中。孵育5小时后，加入计算好体积的慢病毒杀伤剂，感染复数为20，继续孵育5至10天，或至少传代两次。为通过钙成像对基因编辑克隆进行功能表征，将50,000个细胞接种于经层粘连蛋白包被的35毫米培养皿中央。为诱导分化，请按照文中所述加入分化培养基。孵育六天后，移除培养基，并用疏水性笔标记细胞区域。然后向已分化的成肌细胞管中加入50微升Fluo-4 Direct染料，该染料用分化培养基按1:1比例稀释。在37摄氏度孵育30分钟后，用添加了1毫克/毫升葡萄糖的Krebs缓冲液洗涤细胞两次。接下来，使用倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜，配备10倍物镜，以每秒一帧的速率连续采集90秒的荧光变化图像，并选择包含至少10个肌管的视野。去除多余的Krebs缓冲液后，加入2毫升氯化钾溶液以诱导细胞膜去极化，或加入2毫升氟氯酚蓝间甲酚（florochloral metacresol）、4CmC，或直接刺激RyR1受体。刺激后观察荧光变化，随后对每个肌管的荧光变化进行定量分析。该方案可成功用于从人成肌细胞中敲除RyR1基因，导致细胞中基因组DNA变短。在蛋白水平上也证实了RyR1的敲除，因为通过Western blot检测无法在靶向细胞中检测到RyR1蛋白。进一步通过Fluo-4钙成像验证了由RyR1敲除细胞分化而来的肌管中RyR1活性的缺失，分别采用4CmC直接激活RyR1或通过氯化钾诱导膜去极化进行间接刺激。待删除的序列应为预测功能性蛋白所必需。该技术非常适合用于开发基因组后研究工具，以研究新基因在肌肉疾病中的作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用慢病毒介导的CRISPR / Cas9基因编辑开发敲除肌肉细胞系

CRISPR/Cas9 系统有望使靶向基因组编辑技术在科学界变得易于获取且成本低廉。本实验方案旨在演示如何利用 CRISPR/Cas9...

高滴度CRISPR逆转录病毒与慢病毒的设计、包装及通过立体定位注射递送

近年来，在体细胞系中进行基因操作的能力取得了显著进展，为基础研究和应用研究带来了巨大潜力。本文介绍了两种在哺乳动物细胞系中利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除并进行筛选的方法，一种使用可选择标记，另一种则不使用可选择标记。...

基于选择依赖性与非依赖性的CRISPR/Cas9介导的哺乳动物细胞基因敲除生成方法

关键词：CRISPR/Cas9，基因敲除，哺乳动物细胞，选择标记，非选择性筛选，基因编辑

本文描述了一种在小鼠和人类原代造血细胞中快速进行CRISPR/Cas9介导基因敲除的实验方案。通过电穿孔将Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物导入细胞，其中sgRNA通过体外转录生成 体外...

利用CRISPR/Cas9高效破坏小鼠和人类造血祖细胞中的基因

在此，我们介绍一种利用基因修饰技术改造原代或扩增的人自然杀伤（NK）细胞的实验方案 Cas9 核糖核蛋白复合物 (Cas9/RNPs)。通过使用本方案，我们获得了人类自然杀伤细胞中特定基因缺陷的 转化生长因子-β受体2 （TGFBR2）和 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1...

利用Cas9核糖核蛋白生成敲除型原代及扩增人自然杀伤细胞

本文描述了利用CRISPR/Cas9系统对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPC）进行高效基因组编辑的实验方案，以快速构建具有造血系统特异性基因修饰的小鼠模型系统。...

慢病毒CRISPR/Cas9介导的基因组编辑用于疾病模型中造血细胞的研究

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

随着CRISPR相关技术方案变得越来越实用且易于获取，在特定实验条件下仍可能出现复杂情况和障碍。本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术构建受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）基因敲除人源细胞系的步骤，并重点指出了在此过程中可能遇到的潜在挑战。...

使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。...

CRISPR-Cas9 介导的无饲养层培养条件下人多能干细胞基因敲除

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

本文详细介绍了如何利用基于全基因组测序的遗传图谱进行QTL定位，以鉴定Toxoplasma...

QTL定位与CRISPR/Cas9编辑技术用于鉴定Toxoplasma gondii中的药物抗性基因

学习利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建肌肉细胞敲除模型，以高效研究基因在肌肉发育和肌病中的功能。该方法比传统动物模型更快速经济。

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