Name: 细胞运输的正电子发射断层扫描成像:一种细胞放射性标记方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习使用锆-89-DBN对细胞进行放射性标记并通过PET成像进行无创追踪的方法。该技术为细胞治疗研究提供稳定可靠的体内药代动力学分析手段，适用于神经疾病和癌症研究。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 5R21HL127389-02、NIH 4T32HL007111-39、NIH R01HL134664 和美国能源部（DOE）资助项目 DE-SC0008947、国际原子能机构（维也纳）、梅奥诊所核医学科、放射科及梅奥诊所再生医学中心（罗切斯特，明尼苏达州）提供支持。所有插图均使用 BioRender.com 制作。

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<li>Bansal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+89Zr+cell+labeling+approach+for+PET-based+cell+trafficking+studies%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies.</a> EJNMMI Research. 5, 19(2015).</li>
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<li>Nicolas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+cell+therapy+by+ectopic+hepatocyte+transplantation+treats+the+porcine+tyrosinemia+model+of+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).</li>
<li>Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+89Zr-labeled+synthons+for+direct+labeling+and+tracking+of+white+blood+cells+and+stem+cells+in+healthy+athymic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice.</a> Scientific Reports. 12 (1), 15646(2022).</li>
<li>Behfar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+cardiopoiesis+enhances+therapeutic+benefit+of+bone+marrow+human+mesenchymal+stem+cells+in+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).</li>
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<li>Fogli, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+next+steps+in+the+advancement+of+immunotherapy%3A+summary+of+the+2018+and+2020+National+Cancer+Institute+workshops+on+cell-based+immunotherapy+for+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048(2021).</li>
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<li>de Vries, I. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+tracking+of+dendritic+cells+in+melanoma+patients+for+monitoring+of+cellular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy.</a> Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).</li>
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作者没有经济利益冲突，但均为本技术的发明人（专利号：US20210330823A1）。

以下是该方案中需要优化的关键步骤，以实现有效的细胞放射性标记。在方案步骤 1.2 和 1.3 中，根据所使用的 [89Zr]Zr(HPO4)2 或 [89Zr]ZrCl4 的体积，必须使用适当体积（微升）的碱；中和 [89Zr]Zr(HPO4)2 时必须使用 1.0 M K2CO3 溶液，而中和 [89Zr]ZrCl4 时必须使用 1.0 M Na2CO3 溶液，以达到 pH 7.5–8.0 的范围。在步骤 2.1 中，当 [89Zr]Zr-DBN 配方由 [89Zr]ZrCl4 制备时，必须向其中加入由 K2HPO4/KH2PO4 和 HEPES 组成的细胞相容性混合物，以提高细胞...

干细胞疗法和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正日益受到关注，并正在积极研究用于治疗多种疾病，例如心肌衰竭1,2、视网膜变性2、黄斑变性2、糖尿病2、心肌梗死3,4,5以及癌症6,7,8,9,10。在干细胞疗法的两种可能机制中，干细胞可直接移植至病变部位以引发治疗反应，也可不黏附于病变部位，而是通过改变病变部位的微环境来启动间接治疗反应。间接治疗反应可通过释放因子改变病变部位的微环境，从而修复或治疗疾病5。这些干细胞治疗机制可通过放射性标记干细胞的无创成像进行评估。无创成像可将放射性标记细胞在病变部位的摄取情况与治疗反应相关联，从而解析直接与间接治疗反应之间的差异。
此外，基于免疫细胞的疗法正在被开发用于治疗多种癌症，包括CAR T细胞6,7,8,9,10和树突状细胞免疫疗法11,12。从作用机制上看，在CAR T细胞免疫疗法6,7,8,9,10中，T细胞被改造以表达一种表位，该表位可结合需要治疗的肿瘤上的特定抗原。这些经过改造的CAR T细胞在给药后，通过表位-抗原相互作用与肿瘤细胞表面的特定抗原结合。结合后，结合的CAR T细胞被激活，随后增殖并释放细胞因子，从而向宿主免疫系统发出信号，以攻击表达该特定抗原的肿瘤。相比之下，在树突状细胞疗法11,12中，树突状细胞被改造以在其表面呈递特定的肿瘤抗原。这些经过改造的树突状细胞在给药后会归巢至淋巴结，并与淋巴结中的T细胞结合。T细胞在与给药的树突状细胞表面的特定肿瘤抗原结合后被激活/增殖，进而启动宿主针对表达该特定抗原的肿瘤的免疫应答。因此，通过成像放射性标记的CAR T细胞和树突状细胞，可以评估给药后的CAR T细胞向肿瘤部位的迁移9,10以及树突状细胞向淋巴结的归巢11,12，从而判断免疫疗法的疗效。此外，非侵入性的细胞迁移成像有助于更深入理解治疗潜力，明确直接与间接治疗反应之间的差异，并预测和监测基于干细胞和免疫细胞疗法的治疗反应。
已探索用于细胞示踪的不同成像方式3,4,9,10,12，包括光学成像、磁共振成像（MRI）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET）。这些技术各有优缺点。其中，PET 因其定量性和高灵敏度而成为最有前景的成像方式，这对于基于成像的细胞示踪中细胞的可靠定量至关重要3,4,9,10。
正电子发射放射性同位素89Zr的半衰期为78.4小时，适用于细胞标记。它可实现对细胞迁移长达1周以上的PET成像，且可通过广泛可用的低能医用回旋加速器便捷地生产13,14,15,16,17。此外，已有商业化供应的适当功能化螯合剂——对异硫氰酸苄基去铁胺（DFO-Bn-NCS），可用于合成89Zr标记的即用型细胞标记前体化合物[89Zr]Zr-对异硫氰酸苄基去铁胺，也称为[89Zr]Zr-DBN18,19,20,21,22,23,24,25。&#160;[89Zr]Zr-DBN介导的细胞标记原理基于细胞膜蛋白上的伯胺与[89Zr]Zr-DBN中的异硫氰酸酯（NCS）基团发生反应，形成稳定的共价硫脲键。
基于[89Zr]Zr-DBN的细胞标记与成像已被用于追踪多种不同类型的细胞，包括干细胞18,23,25、树突状细胞18、心源性干细胞19、蜕膜基质细胞20,&#160;骨髓来源巨噬细胞20、外周血单个核细胞20、Jurkat/CAR T细胞21、肝细胞22,24以及白细胞25。以下方案提供了使用[89Zr]Zr-DBN进行细胞放射性标记的制备及操作步骤，并描述了针对特定细胞类型在放射性标记方案中可能需要的调整。为便于理解，本文所述的细胞放射性标记方法分为四个部分。第一部分介绍通过将89Zr&#160;与DFO-Bn-NCS螯合来制备[89Zr]Zr-DBN的方法。第二部分描述制备一种可用于细胞放射性标记的生物相容性[89Zr]Zr-DBN制剂。第三部分涵盖细胞放射性标记前的预处理步骤，包括使用无蛋白的磷酸盐缓冲盐水（PBS）和HEPES缓冲的Hanks平衡盐溶液（H-HBSS）洗涤细胞，以去除可能干扰或竞争[89Zr]Zr-DBN与细胞表面蛋白上的伯胺发生反应的外源性蛋白。最后一部分提供了细胞实际放射性标记过程中的操作步骤及质量控制分析方法。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>α最低必需培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>12571063</td><td></td></tr><tr><td>阴离子交换柱</td><td>Macherey-Nagel, Inc., D&amp;uuml;ren, Germany</td><td>731876</td><td>Chromafix 30-PS-HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;SPE 45 mg 羧tridge</td></tr><tr><td>锥形离心管（15 mL）</td><td>Corning Inc., Glendale, AZ, USA</td><td>352096</td><td>Falcon 15 mL 高透明度聚丙烯（PP）锥形离心管</td></tr><tr><td>树突状细胞</td><td>美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA</td><td>CRL-11904</td><td></td></tr><tr><td>DFO-Bn-NCS</td><td>Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA</td><td>B-705</td><td>p-SCN-Bn-去铁胺</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>剂量校准仪</td><td>Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA</td><td>5130-3234</td><td>CRC -55tR 剂量校准仪&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基&amp;nbsp;</td><td>美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Hanks 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>14025092</td><td>用于配制 H-HBSS</td></tr><tr><td>盐酸（痕量金属级）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>A508P212</td><td></td></tr><tr><td>黑色素瘤细胞</td><td>美国模式培养物集存库，Manassas, VA, USA</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>30108442</td><td>Protein LoBind 微量离心管</td></tr><tr><td>小鼠 GM-CSF</td><td>R&amp;D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA</td><td>415-ML-010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 和 Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>用于洗涤细胞</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Covidien LLC, Mansfield, MA, USA</td><td>1020</td><td>0.9% 无菌生理盐水溶液</td></tr><tr><td>振荡器&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>T1317</td><td>Thermomixer</td></tr><tr><td>硅胶-放射-薄层色谱纸板&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA</td><td>SGI0001</td><td>iTLC-SG</td></tr></tbody></table>

细胞追踪的正电子发射断层成像：细胞放射性标记方法

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

干细胞和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正逐渐成为器官再生以及多种癌症免疫治疗的有前景的治疗手段。尽管这些领域已取得显著进展，但仍需进一步研究以更深入地理解治疗性细胞在活体系统中的药代动力学和药效动力学。对于无创、 体内 使用正电子发射断层扫描（PET）对细胞进行示踪，一种新型[89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN介导的细胞放射性标记方法已得到开发，利用 89Zr (t1/2 78.4 小时）。本方案描述了一种[89Zr]Zr-DBN介导的即用型放射标记合成子，可用于直接标记多种细胞，包括间充质干细胞、谱系导向的心源性干细胞、再生肝细胞、白细胞、黑色素瘤细胞和树突状细胞。该方法可实现细胞迁移的无创PET成像，追踪时间长达给药后7天，且不影响放射标记细胞的生物学特性或功能。此外，本方案还描述了一种分步放射合成[89Zr]Zr-DBN，一种生物相容性制剂89Zr]Zr-DBN、细胞放射性标记前的准备，以及使用[Zr]Zr-DBN对细胞进行放射性标记89Zr]Zr-DBN，包含细胞成功放射性标记所需的所有复杂细节。

本文所展示的代表性结果源自先前的[89Zr]Zr-DBN合成及细胞放射性标记研究18,19,22,23,24,25。简言之，使用7.5–15 µg的DFO-Bn-NCS，在25–37 °C条件下反应约30–60分钟，可成功将89Zr与DFO-Bn-NCS形成络合物（表2）。细胞放射性标记效率在洗涤后的放射性标记细胞沉淀中测得的未校正产率范围内为20–50%（表1）18,19,<sup class="...

本文介绍一种使用正电子发射断层扫描（PET）放射性同位素对细胞进行放射性标记的实验方案。 89Zr (t1/2 78.4 小时），使用即用型放射性标记合成子 [89Zr]Zr-p-异硫氰酸苄基-去铁胺([89Zr]Zr-DBN）。使用 [89Zr]Zr-DBN 可实现对体内注射的放射性标记细胞进行长达7天的非侵入性追踪与PET成像。

干细胞与嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法正作为器官再生和免疫治疗的新兴治疗手段而崭露头角

本方案描述了一种对细胞和锆-89-DBN进行放射性标记的逐步方法，并通过正电子发射断层扫描（PET）实现无创追踪。该技术还提供了一种可靠且稳定的方法，通过将锆-89-DBN共价结合至细胞表面蛋白的伯胺基团来实现细胞的放射性标记。从事神经系统疾病及多种癌症细胞治疗研究的临床医生和科研人员，可通过本方案借助无创PET成像深入理解细胞治疗药物的药代动力学特征。本详细实验方案为初学者学习和掌握该放射性标记技术提供了指导。在关键步骤中增加的附加说明有助于新手用户排查问题。首先，准备一个装有约100毫克羟肟酸树脂的层析柱，用8毫升纯无水乙腈洗涤层析柱以活化树脂，随后用5至6毫升空气冲洗。向柱中加入2毫升0.5 N的盐酸。再通入5至6毫升空气冲洗后，缓慢将含有锆-89和天然钇的溶液上样至羟肟酸树脂。用20毫升2 N盐酸洗涤羟肟酸树脂，去除未结合的天然钇，随后用10毫升去离子水冲洗。为了以锆-89磷酸氢盐的形式洗脱锆，向柱中加入0.5毫升1.2摩尔的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液，并让其在柱上静置30分钟。再加入1.5毫升1.2摩尔的缓冲液以将锆从柱中洗脱出来。接下来，取约120微升用缓冲液配制的锆-89磷酸氢盐，用HEPES-KOH和碳酸钾中和溶液，使pH值达到7.528。将4微升新配制的5毫摩尔DFO-Bn-NCS加入约285微升中和的锆-89磷酸氢盐溶液中，用移液器混匀。在将锆与钇分离后，向层析柱中加入0.5毫升1摩尔草酸，静置1分钟，以草酸锆-89的形式洗脱锆。向柱中再加入 2.5 毫升 1 摩尔的草酸。为将草酸锆-89 转化为氯化锆-89，先用 6 毫升乙腈洗涤阴离子交换柱，随后用 5 至 6 毫升空气冲洗。然后，用 10 毫升生理盐水洗涤柱子，再用空气冲洗一次。缓慢将含有草酸锆-89的溶液上样至活化的阴离子交换柱，然后用空气重新洗涤。接着用50毫升去离子水洗涤柱子，以去除未结合的草酸根离子。为以氯化锆-89的形式洗脱锆，向柱中加入0.1毫升1当量的盐酸，并使其在柱上静置1分钟。用额外的0.4毫升1摩尔盐酸将锆从柱中洗脱。将洗脱的氯化锆-89置于V型小瓶中，在65摄氏度的加热块中，持续通入氮气流10至30分钟，使其干燥，然后将干燥的氯化锆-89溶于水中。在1.5毫升微量离心管中，用500微升HEPES缓冲的HBSS制备约含600万个细胞的500微升细胞悬液，并加入约100微升配制好的锆-89-DBN。使用微量移液器轻轻吹打溶液，将锆-89-DBN 与细胞悬液混合。将细胞与锆-89-DBN 混合物置于摇床中，在 25 至 37 摄氏度、约 550 RPM 条件下孵育 30 至 45 分钟，以实现细胞标记。使用新配制的放射性 TLC 溶剂对细胞放射性标记反应进行放射性薄层色谱分析。使用屏幕上显示的公式计算 Rf 值为 0.01 至 0.02 时的放射性百分比。在另一个

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