细胞运输的正电子发射断层扫描成像:一种细胞放射性标记方法

该协议描述了一种用于放射性标记细胞和锆-89-DBN的逐步方法及其通过PET进行的非侵入性跟踪。该技术还提供了一种可靠且稳定的方法，通过将锆-89-DBN共价偶联到细胞表面蛋白的主要手段来放射性标记细胞。从事神经系统疾病和各种癌症细胞疗法的医生和科学家会发现该协议有助于通过非侵入性PET成像了解基于细胞的疗法的药代动力学。

详细的协议为新用户学习和采用这种放射性标记技术提供了指导。关键步骤中包含的其他节点将有助于为新用户解决问题。首先，用大约 100 毫克羟肟酸盐树脂制备色谱柱，然后用 8 毫升纯无水乙腈洗涤色谱柱，然后用 5 至 6 毫升空气冲洗来激活它。

将 2 毫升 0.5 生盐酸通入色谱柱。再冲洗五到六毫升空气后，将含有锆-89和天然钇的溶液缓慢加载到异羟肟酸盐树脂中。用 20 毫升两种普通盐酸洗涤异羟肟酸盐树脂中未结合的天然钇，然后用 10 毫升去离子水洗涤。

为了以磷酸氢锆-89 的形式逸出锆，向色谱柱中加入 0.5 毫升 1.2 摩尔磷酸二钾磷酸二氢钾缓冲液，并使其在色谱柱上静置 30 分钟。再加入 1.5 毫升 1.2 摩尔缓冲液，从色谱柱中洗脱锆。接下来，取约120微升在缓冲液中配制的磷酸锆-89磷酸氢锆，并用HEPES-KOH和碳酸钾中和溶液，使pH值达到7.528。

将 4 微升新鲜制备的 5 毫摩尔 DFO-Bn-NCS 加入约 285 微升中和的磷酸锆 89 氢盐中。并通过移液混合溶液。从钇中分离出锆后，向色谱柱中加入0.5毫升一摩尔草酸，让其在色谱柱上静置一分钟，以草酸锆-89的形式洗脱锆。

向色谱柱中再加入 2.5 毫升一摩尔草酸。要将草酸锆-89转化为氯化锆-89，请用6毫升乙腈清洗阴离子交换柱，然后用5至6毫升空气冲洗。然后，用 10 毫升生理盐水清洗色谱柱，然后再次冲洗空气。

慢慢地，将含有草酸锆-89的溶液加载到活化的阴离子交换柱上，然后用空气重新洗涤。然后，用 50 毫升去离子水洗涤色谱柱以除去未结合的草酸根离子。为了以氯化锆-89的形式逸出锆，向色谱柱中加入0.1毫升一种普通盐酸，并使其在色谱柱上静置一分钟。

用另外 0.4 毫升的一种普通盐酸从色谱柱中洗脱锆。将逸出的氯化锆-89放入V形小瓶中，在65摄氏度的加热块中，在稳定的氮气流下干燥10至30分钟，然后在水中重新配制干燥的氯化锆-89。在 1.5 毫升微量离心管中，在 500 微升 HEPES 缓冲的 HBSS 中制备 500 微升细胞悬液，其中约 600 万个细胞，并加入约 100 微升配制的锆-89-DBN。

用微量移液管轻轻上下移液溶液，混合锆-89-DBN和细胞悬浮液。将细胞和锆-89-DBN 混合物在振荡器上以约 550 RPM 的速度在 25 至 37 摄氏度下孵育 30 至 45 分钟以进行细胞标记。使用新鲜制备的放射性TLC溶剂对细胞放射性标记反应进行放射性TLC。

使用屏幕上显示的公式计算 Rf 等于 0.01 至 0.02 时的放射性百分比。在单独的 1.5 毫升微量离心管中，将约 100 微升配制的锆-89-DBN 与约 500 微升 HEPES 缓冲的 HBSS 混合，将其用作背景校正的无细胞对照。使用屏幕上显示的公式计算 Rf 等于 0.01 至 0.02 处的放射性百分比，然后通过减去两个计算出的放射性百分比来计算有效的细胞放射性标记。

确认放射性标记完成后，加入 600 μL 冷冻细胞适当完全培养基以执行放射性标记反应的淬灭。将细胞在 96G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。并弃去上清液。

用微量移液管上下移液培养基，将沉淀的细胞轻轻重悬于500微升的冷冻培养基中。将细胞在4摄氏度下以96G离心10分钟，弃去上清液。接下来，使用屏幕上显示的公式计算所有洗涤后的最终放射性标记效率。

为确保放射性标记细胞的质量，目视检查放射性标记细胞的最终悬浮液，如果不存在团块，则在放射性标记和洗涤步骤后一小时内使用在PBS中制备的0.4%台盼蓝溶液进行台盼蓝排阻性试验。DFO-Bn-NCS使用磷酸氢锆-89和氯化锆-89对锆-89的螯合效率是不同的，通过放射性TLC测量。这里显示了用锆-89放射性标记的各种细胞在7天内的稳定性。

发现放射性标记细胞对锆-89放射性的保留在所有研究的细胞中都是稳定的，在标记后7天内观察到的外排可以忽略不计。下表显示了使用锆-89-DBN的不同细胞类型中的细胞放射性标记效率。细胞放射性标记效率从 20% 到 50% 不等，因为洗涤后在放射性标记的细胞沉淀中观察到未校正的产量。

该协议最关键的步骤是将DFO-Bn-NCS添加到螯合混合物中以及放射性标记细胞的质量评估。该技术的应用将有助于了解基于细胞的疗法的药代动力学。它还会引发关于改变细胞疗法清除率的任何临床需求的问题。