Name: 用于下游无循环DNA应用的标准化液体活检前分析方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 26 s
Description: 学习标准化血液样本处理与储存方案，用于循环游离DNA液体活检应用。该方案减少不同实验室间的差异，提高肿瘤学研究下游分析的精确性与可靠性。

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我们感谢癌症生物医学研究网络（CIBERONC）提供的支持以及以下项目资助：LB CIBERONC PLATFORM：用于液体活检标准化与推广的CIBERONC平台。项目负责人Rodrigo Toledo（CIBERONC），2019–2021年。

在采集血样之前，已从参与的研究中心获得伦理审批。血清和血浆分离的以下操作步骤均依照生物医学研究的伦理原则进行。
注意：开始本实验方案前需考虑以下事项。在生物医学研究中使用人源样本前，必须获得相应的伦理审批及知情同意。处理血液样本时需使用二级生物安全柜。整个操作过程中应穿戴实验服、防护手套和护目镜，以避免血液传播病原体感染。血清样本处理至少需要30分钟。采集无抗凝剂的采血管血液后，于室温（RT）放置30-45分钟，以使血液充分凝固。血浆制备至少需要40分钟，使用乙二胺四乙酸（EDTA）采血管时，样本应在采血后4小时内完成处理；若使用细胞稳定化采血管或专用的无细胞DNA采血管，则应在24-48小时内处理。然而，根据部分制造商说明，这些特殊采血管中的样本在两周内保持稳定。处理时需注意检查是否发生溶血，溶血会使血浆或血清组分呈现红色。有关溶血样本的处理建议，请参见讨论部分的故障排除章节。
1. 液体活检研究的血清制备
注意：执行此步骤所需的总时间为 30 分钟（图 1）。
<ol>
	<li>采集4-10 mL血液至不含抗凝剂的试管中（红色或红/灰黑色盖子），室温放置30-45分钟。在采样后4小时内完成这些样本的处理。</li>
	<li>在专门设计的样本数据库中记录样本采集的时间、日期以及受试者编号（ID）。</li>
	<li>穿戴实验服、防护手套和护目镜，在室温（15 °C–25 °C）下以1,600（± 150）× g 离心10分钟，使用最大刹车速度，对含有新鲜血液的试管进行离心。</li>
	<li>离心后，小心地从离心机中取出试管；上层血清上清液应呈清澈淡黄色（图2）。检查样本是否出现溶血迹象（图3），必要时记录溶血情况。</li>
	<li>在II级生物安全柜中，将血清以250 µL为一份分装至收集管中。 
	注：分装体积需根据研究要求进行调整。</li>
	<li>立即将血清直立放置于储存盒中，并在-80 °C下冷冻保存，同时记录样本储存时间。</li>
	<li>确认样本已在规定的4小时内完成处理。</li>
</ol>
2. 液体活检研究的血浆制备
注意：完成此步骤所需的总时间为 40 分钟（图 4）。
<ol>
	<li>使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集4-10 mL血液。在采血后4小时内处理样本。</li>
	<li>在专门设计的样本数据库中记录样本采集的时间、日期及受试者编号。</li>
	<li>穿戴实验服、防护手套和护目镜，在室温（15 °C–25 °C）下以1,600（±150）×g离心10分钟，使用最大刹车档位。 
	注意：若使用其他类型的采血管，请参考制造商说明书。</li>
	<li>离心后，血浆上清液应呈清澈淡黄色。检查样本是否出现溶血迹象（图3），并使用一次性移液管（或一次性洗耳球移液器，或带滤芯吸头的P1000移液器）将血浆（上清液）转移至15 mL离心管中，避免扰动细胞层。在细胞层上方保留少量残留血浆体积（约5 mm）。</li>
	<li>若观察到溶血现象，应弃用该样本进行后续分析（图5）。有关溶血评估，请参见讨论部分的故障排除说明。</li>
	<li>将血浆置于15 mL离心管中，在室温（15 °C–25 °C）下以3,000（±150）×g离心10–20分钟。执行&#160;此步骤以去除第一次离心时可能残留并被带入的完整血细胞。</li>
	<li>离心后，小心从离心机中取出离心管，使用一次性移液管（或一次性洗耳球移液器，或带滤芯吸头的P1000移液器）将1–4 mL血浆转移至1–4 mL聚丙烯冻存管中。在离心管底部必须保留一定体积的残留血浆（约0.3 mL或7 mm高度），以避免血细胞污染血浆（图5）。</li>
	<li>立即将冻存管直立放入储存盒中，并在-80 °C下速冻，同时记录样本储存时间。确认样本已在规定的4小时内完成处理。</li>
	<li>使用P1000移液器配合滤芯吸头收集细胞层（白膜层），并转移至2 mL离心管中。立即冷冻并在-80 °C下保存。</li>
</ol>

<ol><li>Alix-Panabières, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA+as+liquid+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy.</a> Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).</li>
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<li>Alcoceba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy%3A+a+non-invasive+approach+for+Hodgkin+lymphoma+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping.</a> British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).</li>
<li>Szpechcinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+levels+in+plasma+of+patients+with+non-small-cell+lung+cancer+and+inflammatory+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease.</a> British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).</li>
<li>Earl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutation+profiling+in+the+liquid+biopsy+and+clinical+analysis+of+hereditary+and+familial+pancreatic+cancer+cases+reveals+kras+negativity+and+a+longer+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival.</a> Cancers. 13 (7), 1612(2021).</li>
<li>Lampignano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+evaluation+of+circulating+cell-free+DNA+extraction+and+downstream+analyses+for+the+development+of+standardized+%28pre%29analytical+work+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows.</a> Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).</li>
<li>Febbo, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+technical+data+elements+for+liquid+biopsy+data+submitted+to+public+databases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).</li>
<li>De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+use+liquid+biopsies+to+treat+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO+Open%22%5BJournal%5D)">How to use liquid biopsies to treat patients with cancer.</a> ESMO Open. 6 (2), 100060(2021).</li>
</ol>

Beatriz Bellosillo（BB）：BB 曾因演讲、咨询或顾问职务从安进（Amgen）、阿斯利康（Astra-Zeneca）、百卡蒂斯（Biocartis）、强生（Janssen）、默克雪兰诺（Merck-Serono）、诺华（Novartis）、凯杰（Qiagen）、罗氏诊断（Roche Diagnostics）、罗氏制药（Roche Pharma）、赛默飞世尔（ThermoFisher）、辉瑞（Pfizer）和百时美施贵宝（BMS）获得酬金。Sara López-Tarruella（SL）：SL 曾因演讲、咨询或顾问职务从阿斯利康/第一三共（Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo）、默沙东（MSD）、诺华（Novartis）、辉瑞（Pfizer）、罗氏制药（Roche Pharma）、吉利德（Gilead）、礼来（Lilly）、皮尔·法布雷（Pierre Fabre）、Seagen、葛兰素史克（GlaxoSmithKline）和Veracyte获得酬金。Noelia Tarazona（NT）：NT 曾因演讲、咨询或顾问职务从安进（Amgen）、辉瑞（Pfizer）、默克雪兰诺（Merck-Serono）、施维雅（Servier）、西班牙肿瘤内科学会（SEOM）和欧洲肿瘤内科学会（ESMO）获得酬金。Javier Hernandez-Losa（JHL）：曾因演讲、咨询或顾问职务从阿斯利康（Astra-Zeneca）、强生（Janssen）、诺华（Novartis）、罗氏诊断（Roche Diagnostics）、罗氏制药（Roche Pharma）、赛默飞世尔（ThermoFisher）、礼来（Lilly）和Diaceutics获得酬金。Rodrigo Toledo（RT）报告从诺华（Novartis）获得与本研究相关的研究资助，以及从阿斯利康（AstraZeneca）和贝达药业（Beigene）获得与本研究无关的研究资助。其余作者均无与本稿件相关的利益披露。

液体活检在癌症管理的不同阶段具有多种潜在应用。首先，在诊断时用于识别肿瘤分子标志物，以提示可能存在需进一步临床检查的肿瘤病灶。其次，在治疗期间用于疾病的实时监测、评估治疗的分子学反应、克隆演化，以及早期发现疾病复发或治疗耐药。最后，在手术治疗后，可作为检测微小残留病灶的工具。欧洲医学肿瘤学会（ESMO）近期发布了关于在转移性非小细胞肺癌（NSCLC）中实施循环肿瘤DNA（ctDNA）突变检测以识别可靶向治疗靶点的指南。这些指南涵盖了ctDNA分析的方法学考量、技术评估与验证，并讨论了一些挑战，例如体细胞嵌合现象、低变异等位基因频率（VAF）以及偶然发现的胚系致病性变异4。近期发布的ESMO转移性乳腺癌患者诊断、分期和治疗临床实践指南指出，在治疗策略发生改变或进入临床试验需要的情况下，可采用基于ctDNA的分析5。
样本应在提取后4小时内进行处理。超出该时间范围进行样本处理可能导致样本降解，进而引起溶血增加，影响游离DNA（cfDNA）浓度，并对下游应用（如miRNA谱分析）产生不利影响。...

“液体活检”这一术语于2010年被定义为存在于血液及其他体液中的分子（如蛋白质、脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA））、细胞或细胞外囊泡（如外泌体），这些物质来源于原发肿瘤1。液体活检样本的应用已彻底改变了转化肿瘤学研究，因为组织活检仅能获取特定时间和特定区域的样本，可能因肿瘤异质性而遗漏相关克隆。此外，在原发组织稀少或难以获取的肿瘤类型中，液体活检具有重要作用，因其可避免侵入性活检，从而降低医疗成本和患者风险。此外，肿瘤的分子特征会因治疗压力而持续演变，而液体活检样本可通过纵向采集（如在疾病的不同临床和治疗阶段——基线期、治疗中、最佳疗效期、疾病进展期甚至进展前）捕捉肿瘤克隆的动态变化。“实时液体活检”的概念意味着可实时监测肿瘤的动态变化，从而实现该疾病的精准医疗。液体活检在临床中具有多种潜在应用，包括癌症的筛查与早期检测、疾病的实时监测、微小残留病灶的检测、治疗耐药机制的研究以及患者在治疗层面的分层1。在许多肿瘤类型中，疾病复发和进展的早期检测仍是尚未满足的临床需求，也是提高癌症患者生存率和生活质量的关键因素。常规影像学手段和可溶性肿瘤标志物在此任务中可能缺乏足够的灵敏度和/或特异性。因此，临床上迫切需要新型预测标志物，例如基于循环游离核酸的标志物。
用于液体活检研究的样本类型包括但不限于血液、尿液、唾液和粪便样本。其他肿瘤特异性样本可包括细胞抽吸物、脑脊液、胸腔积液、囊肿液和腹水、痰液以及胰液2。前述液体可能含有不同类型的肿瘤来源物质、循环肿瘤细胞（CTC）或片段，如外泌体和无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）。核酸可能被包裹在细胞外囊泡（EVs）中，或因细胞死亡和损伤而释放到体液中。循环游离DNA（cfDNA）主要来源于凋亡或坏死的细胞，释放进入血液循环，存在于所有个体中，在炎症或肿瘤性疾病中其水平升高3。外泌体是由细胞分泌的较小细胞外囊泡（约30–150 nm），内含核酸、蛋白质和脂质。这些囊泡是细胞间通讯网络的一部分，常见于多种类型的体液中2。包裹在EVs内的核酸受到保护，免受体液中严苛环境的降解，因此在液体活检中为研究这些分子提供了更为稳定可靠的方法。
总体而言，液体活检样本中循环核酸的含量极低，因此需要采用高灵敏度的检测方法，例如数字PCR或下一代测序（NGS）。样本的分析前处理至关重要，必须防止血细胞裂解导致完整DNA释放，从而避免基因组DNA对游离DNA（cfDNA）产生污染。此外，在提取样本时需格外注意，避免引入酶法分析抑制物。
本文介绍了一种用于血浆和血清样本采集与保存的标准化方法，这是开展基于液体活检的下游应用（包括循环核酸分析）的关键第一步。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>10 mL 血清学一次性移液管</td><td>BIOFIL</td><td>GSP010010</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>10 mL 真空采血管 K2 EDTA 管</td><td>Becton Dickinson</td><td>367525</td><td>这些试管可用于血浆采集</td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯离心管</td><td>BIOFIL</td><td>CFT411150</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>3.5 mL BD Vacutainer 无抗凝剂采血管</td><td>Becton Dickinson</td><td>368965</td><td>可使用8.5 mL或3.5 mL试管进行血清采集</td></tr><tr><td>4 mL聚丙烯冻存管，圆底，可直立</td><td>康宁</td><td>430662</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>4 mL 真空采血管（K2 EDTA 管）</td><td>Becton Dickinson</td><td>367864</td><td>这些试管可用于血浆采集</td></tr><tr><td>4200 TapeStation 系统</td><td>安捷伦</td><td>G2991BA</td><td>有多种定量方法可供选择&amp;nbsp; cfDNA 的特定应用</td></tr><tr><td>5 mL 血清学一次性移液管</td><td>BIOFIL</td><td>GSP010005</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>8.5 mL BD Vacutainer 无抗凝剂采血管</td><td>Becton Dickinson</td><td>366468</td><td>可使用8.5 mL或3.5 mL试管进行血清采集</td></tr><tr><td>离心机，可达到约 3000 x &lt;em&gt;g&lt;/em&gt; 使用摆动桶转子</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Sorvall ST 16 &amp;nbsp;10688725</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>用于1的冷冻储存盒&amp;ndash;4 mL 冻存管</td><td>康宁</td><td>431120</td><td>使用4 mL小瓶进行储存时需要这些盒子</td></tr><tr><td>p1000 移液器吸头</td><td>CORNING</td><td>4809</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr><tr><td>QIAamp 循环核酸提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>任何市售的特异性用于cfDNA分离的试剂盒均可与本血液处理方案联合使用。</td></tr><tr><td>Streck&amp;nbsp;Cell-Free DNA BCT CE 管 10 mL</td><td>Streck</td><td>218997</td><td>这些试管可用于血浆采集</td></tr><tr><td>-80℃ 超低温冰箱 &amp;deg;C)</td><td>ESCO</td><td>2180104</td><td>可使用任何标准的试管/设备</td></tr></tbody></table>

一种用于下游游离dna检测的标准化液体活检预分析方案

A Standardized Liquid Biopsy Preanalytical Protocol for Downstream Circulating-Free DNA Applications

液体活检（LB）是指来源于原发性或转移性肿瘤的蛋白质、DNA、RNA、细胞或细胞外囊泡等分子，存在于血液及其他体液中。LB 已成为转化研究的重要手段，并逐步进入临床肿瘤学实践，为组织活检提供了一种微创替代方案。LB 可实现对肿瘤的实时监测 通过 一种微创样本采集方法，例如血液采集。其应用包括早期癌症检测、患者随访以监测疾病进展、微小残留病灶评估，以及分子水平进展和耐药机制的潜在识别。为了获得可用于临床报告的可靠分析结果，必须审慎考虑并严格遵循分析前处理步骤。样本采集、质量控制和储存是决定样本在后续应用中有效性的关键环节。本文介绍了我们液体活检工作模块中用于采集、处理和储存血浆与血清样本的标准化操作流程，以支持基于循环游离DNA的下游液体活检分析。本流程仅需常规实验设备，具有足够的灵活性，适用于大多数专注于生物学操作的实验室。

关键词：液体活检，循环游离DNA，血浆，血清，样本采集，样本处理，样本储存，分析前步骤

在对不含抗凝剂的采血管进行离心后，上层呈现淡黄色，对应于血清组分（图2）。小心移除此组分，并分装用于后续分析。
溶血可能出现在血浆或血清部分，上层液相会呈现红色，表明溶血的存在及其程度（图3）。
EDTA 管离心后，可观察到多个相或分层；上层（淡黄色）为血浆组分，占总血容量的 55%；中间薄层呈灰白色，为含有白细胞和血小板的白膜层，占总血容量的 &lt;1%；下层（红色）含有红细胞，占总血容量的 45%。吸取时应位于白细胞层上方 1 cm 处，确保不扰动细胞层，以减少血细胞对血浆的污染（图 5）。应小心移除此组分，并分装用于后续分析。
应使用基于电泳的方法评估从血浆样本中提取的游离DNA（cfDNA）的浓度和完整性。cfDNA采用市售的基于离心柱的试剂盒进行提取。定量分析使用专为cfDNA应用设...

液体活检已彻底改变了我们进行肿瘤学转化研究的方式，其中样本采集、质量和储存是其成功应用于临床的关键步骤。本文介绍了一种标准化且经过验证的下游游离DNA检测应用方案，可适用于大多数转化医学研究实验室。

一种用于下游游离DNA检测的标准化液体活检预分析方案

液体活检（liquid biopsy, LB）是指存在于血液和其他体液中的分子，例如蛋白质、DNA、RNA、细胞或细胞外囊泡等……

本方案是基于循环游离DNA的下游液体活检应用中血液样本处理与保存的标准操作流程。尽管该技术已应用数年，但这是首个公开发表的标准操作流程。本方案易于实施，仅需大多数转化医学或科研实验室常见的标准设备即可完成。所有实验室工作人员均可执行该方案。该方案有助于标准化样本的采集和储存流程，最终将影响临床应用，并减少不同中心在执行相同或类似下游分析时的变异性，而精确性在这些分析中至关重要。该方法在肿瘤学研究以及临床应用中尤为有用。然而，该方法也可应用于其他使用液体活检的非癌症疾病。在血液样本离心后，确定应移除多少血浆或血清可能较为困难，但遵循本具体指南将有助于解决这一问题。其余实验步骤非常简单，即使在实验室经验有限的情况下也易于操作。演示该操作的将是本实验室的技术员 Jorge。首先，在室温下将含有新鲜血液的离心管以1600 × g离心10分钟，并启用最大刹车。小心地从离心机中取出离心管。血清上清液的上层将呈现清澈的淡黄色。检查样本是否出现溶血迹象，并在适当时记录溶血的存在情况。在II级生物安全柜中，将血清以250 µL的等分试样转移至收集管中。分装样品必须正确标记。立即将血清在储存盒中直立放置于零下80摄氏度条件下冷冻，并记录样本储存时间。确认样本已在规定的4小时内完成处理。将EDTA管在室温下以1600 × g离心10分钟，并应用最大刹车。离心后，血浆上清液应呈现清澈的淡黄色。检查样本是否出现溶血迹象，并使用一次性移液管将血浆转移至15毫升离心管中，注意不要扰动细胞层。在细胞层上方保留约五毫米的少量血浆残留体积。若观察到溶血现象，应弃去该样本，不再用于后续分析。将血浆与15毫升离心管一同离心，以去除在初次离心步骤中可能残留的完整血细胞。小心地将离心管从离心机中取出，注意不要扰动管底的细胞沉淀，使用一次性移液管将1至4毫升血浆转移至1至4毫升的聚丙烯冻存管或Eppendorf管中。管底需保留一定残余血浆体积，以避免血细胞污染血浆。立即将血浆在储存盒中直立放置于-80摄氏度条件下冷冻，并记录样本储存时间。确认样本已正确标记，并在规定的四小时内完成处理。使用 P1000 加样器和带滤芯吸头收集细胞层，并转移至一个 2 毫升离心管中。立即在 -80 摄氏度下冷冻保存。此处展示了一个高质量cfDNA提取的示例，可用于下游应用；而该图像则代表了一个不合适的样本示例，其基因组污染程度较高。血浆或血清组分必须呈黄色，颜色深浅可能因个体样本而异。出现溶血的样本应予以弃用。在移除血浆组分时，注意不要去除任何细胞沉淀物。本方案也可用于其他基于核酸和蛋白质的应用，例如利用免疫检测技术检测血清和血浆样本中的非编码 RNA 或蛋白质。这是一种在许多实验室中广泛使用的技术。本方案有助于研究人员标准化分析操作流程，因为这是未来临床应用所必需的关键环节。

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