Name: 血管紧张素II诱导的腹主动脉瘤小鼠模型中中心静脉导管的药物治疗及3D超声监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 了解腹主动脉瘤小鼠模型的药物治疗方法，通过渗透泵植入和颈静脉导管实现重复给药，并利用三维超声监测动脉瘤进展。该方法为心血管疾病研究提供了可靠的药物测试平台。

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我们感谢波德瑟教授和埃爾邁爾教授的团队（维也纳医科大学生物医学研究中心及实验动物繁育与饲养核心设施）在动物实验方面提供的帮助。AAA三色染色由莫妮卡·韦斯和彼得·佩策尔鲍尔教授（维也纳医科大学皮肤病学系）协助完成。本研究工作得到奥地利科学基金（SFB项目F 5409-B21）的资助。马克·贝利本人获得英国心脏基金会（FS/18/12/33270）的支持。

动物实验已获得当地伦理委员会和奥地利科学部（BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016）的批准，符合欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU以及奥地利2012年动物实验法。人道终点设定如下：体重减轻≥15%、拒绝进食和/或饮水、活动减少（运动减少）或运动障碍、持续颤抖、搔抓、呼吸困难或弓背姿势，即使已进行疼痛/症状管理仍无改善。必要时，在深度麻醉下对动物实施安乐死，即注射过量的氯胺酮（约100 mg/kg）和赛拉嗪（约5 mg/kg）混合物，或采用颈椎脱位法。在进行手术操作时，全程采用无菌技术并佩戴无菌/清洁手套。
1. 泵的植入
<ol>
	<li>麻醉
	<ol>
		<li>保留载脂蛋白E缺陷小鼠（B6.129P2-Apoe）tm1Unc在正常饮食条件下进行实验，并优先选用12至14周龄的雄性动物，以代表人类疾病中男性占主导的现象。3.</li>
		<li>手术前1天（d-1，术前），根据小鼠体重，按照生产商说明书将血管紧张素II配制成所需浓度并灌注至渗透压泵中，随后将泵置于生理盐水中，于37 °C孵育过夜15. 
		&#8203;示例：对于一只25 g的小鼠，使用渗透泵（参见 材料表以1000 ng/kg/min的给药速率和0.25 µL/h的泵速持续28天，将1.8 mg Ang-II溶解于300 µL生理盐水中（终浓度为6000 ng/µL，以实现Ang-II给药量为1500 ng/h）。使用钝头填充针将溶液注入泵中，随后插入流速调节器以封闭泵体。</li>
		<li>将小鼠放入麻醉舱，使用3%-4%异氟烷与2 L/min氧气混合进行麻醉2 直至小鼠失去意识。将小鼠转移至预热至37 °C的加热板上，保持俯卧位，并通过鼻罩以1.8%–2%异氟烷维持麻醉。</li>
		<li>在双眼内涂抹眼用润滑剂，以防止干燥。</li>
		<li>皮下注射2.5%布托啡诺生理盐水溶液，剂量为每克体重10 µL，并通过脚趾夹捏反应验证麻醉深度。</li>
		<li>在小鼠背部左上方肩胛骨区域剃除一小块毛发。用10% (w/v) 聚维酮碘溶液对剃毛区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>泵插入（5–7 分钟，无需显微镜操作）
	<ol>
		<li>通过脚趾夹捏法确认小鼠已完全麻醉，然后使用手术刀在背部上方、中脊与左侧肩胛线之间做一条1厘米长的横向皮肤切口。</li>
		<li>用镊子提起皮肤，使用钝头弯剪向左后肢方向推进，皮下钝性分离形成皮下袋。打开剪刀，将张开的剪刀从切口拉出，重复操作以扩大皮下袋。</li>
		<li>将泵轻轻插入囊袋中，确保流量调节器朝向尾部（以尽量减少切口部位对Ang-II释放的潜在干扰）。 
		注意：口袋不仅应足够宽以容纳泵的植入，还应确保泵周围皮肤不会过紧，且泵与切口部位之间应至少保留5 mm的距离，以促进伤口的最佳愈合。</li>
		<li>用4-0可吸收缝线间断缝合关闭伤口。</li>
		<li>皮下注射10%葡萄糖生理盐水，剂量为10 µL/g。</li>
		<li>将聚维酮碘伤口喷雾涂抹于闭合伤口，将小鼠置于加热灯下使其恢复意识，术后3天内将小鼠放回笼中，并在200 mL饮用水中加入7.5 mg匹替拉明（用于延长镇痛）和20 mL 5%葡萄糖。</li>
		<li>每天多次检查小鼠是否有疼痛或不适的迹象。 
		&#8203;注意：由于主动脉破裂的发生率为20%–40%，且主要发生在术后3–10天内，因此需通过频繁监测动物状态以尽量降低其遭受持续剧烈疼痛或痛苦的风险。 impending 破裂的主要指征包括：脱离群体、蜷缩姿势、活动能力下降（严重时可表现为后肢瘫痪）以及在操作过程中反应减弱或无反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 颈静脉插管
注意：该手术操作需要配备 8x-10x 放大倍数的显微镜。
<ol>
	<li>使用血管通路系统（参见材料表），通过将3Fr端裁剪至所需长度（约在硅胶锚前5-7 mm处），并将导管推过血管通路系统（VAS）的22 G金属连接器，确保至少有3 mm的重叠部分，完成导管的准备。将铝帽安装在按钮上以保护端口。</li>
	<li>准备长度为1-1.5 cm的6-0丝线结扎线。</li>
	<li>将小鼠置于麻醉舱中，使用3%-4%异氟烷与2 L/min O2混合气体麻醉，直至小鼠失去意识。</li>
	<li>将小鼠转移至加热台（37 °C），仰卧位放置，并通过鼻罩持续给予1.8%-2%异氟烷维持麻醉状态。</li>
	<li>在双眼上涂抹眼用润滑剂，防止角膜干燥。</li>
	<li>皮下注射盐水配制的2.5%丁丙诺啡，剂量为10 µL/g小鼠体重。</li>
	<li>剃除小鼠颈部右侧腹面及上背部右侧的毛发（左侧将用于植入渗透压泵）。</li>
	<li>使用聚维酮碘溶液对剃毛区域进行消毒。</li>
	<li>通过脚趾夹捏法检查小鼠是否完全麻醉。</li>
	<li>颈外静脉准备（5-10分钟，显微镜下操作）
	<ol>
		<li>在颈部右侧锁骨上方做一道长约0.5 cm的横向锁骨上皮肤切口。</li>
		<li>使用钝头显微外科镊子分离结缔组织和脂肪组织，暴露颈外静脉。注意避免撕裂脂肪中的小血管。</li>
		<li>游离至少5 mm长度的血管，靠近胸肌部位。</li>
		<li>使用弯头显微镊子在静脉下方进行钝性分离，并穿过2-3根6-0结扎线。 
		&#8203;注意：若在目标区域发现侧支血管，应将结扎线置于侧支远端，或通过游离并用6-0结扎线结扎的方式永久闭合侧支。</li>
		<li>将结扎线收好，并在操作部位滴加一滴生理盐水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按钮植入（5-7分钟，无需显微镜操作）
	<ol>
		<li>将小鼠翻转，使其呈俯卧位；通过脚趾夹捏确认麻醉深度，并使用聚维酮碘溶液对剃毛区域进行消毒。</li>
		<li>使用手术刀在上背部中线与右肩胛线之间做一道长约1 cm的矢状切口。</li>
		<li>使用钝头弯剪通过钝性分离，在切口周围制作一个略大于VAS尺寸的圆形皮下囊袋。</li>
		<li>使用钝头弯剪在右肩上方朝向颈部腹侧切口处进行皮下隧道打通：轻微张开剪刀，向前推进，然后拉出，重复此动作直至隧道完成。 
		注意：此步骤中可将小鼠翻转至左侧卧位。</li>
		<li>当隧道到达腹侧切口时，从腹侧切口向背侧切口穿入手术钳。</li>
		<li>将导管的3Fr端固定于手术钳上，通过隧道将导管拉出，使导管从颈部腹侧切口穿出，同时确保VAS位于背侧切口处。</li>
		<li>将VAS的手术毡盘植入背部切口的皮下组织中。</li>
		<li>松开导管夹，用生理盐水或不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS-/-）冲洗导管；使用操作工具的叉端取下保护性铝帽，再用磁性端固定按钮，连接1 mL注射器并通过对应注射器注入液体，直至液体从1Fr端渗出，以检查导管通畅性。 
		注意：导管冲洗也可在步骤2.1中进行。</li>
		<li>将按钮向尾侧推入囊袋中，并在VAS法兰下方、毡盘上方使用至少两针4-0间断缝线闭合皮肤。 
		注意：确保按钮周围皮肤无张力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静脉插管（7-10分钟，显微镜下操作）
	<ol>
		<li>将小鼠恢复为仰卧位，通过脚趾夹捏确认麻醉深度，并在切口处滴加一滴生理盐水。</li>
		<li>尽可能靠头侧，用第一根结扎线将导管与颈外静脉一起结扎2-3个结，以闭合静脉并将导管外固定；将第二根结扎线尽可能靠近胸肌。</li>
		<li>使用显微剪刀以斜角剪切导管，调整至所需长度，使约3-5 mm导管进入静脉内，形成锐利末端。</li>
		<li>使用连接充满生理盐水的1 mL注射器的27 G针头，在牵拉已固定的头侧结扎线的同时，沿静脉平行方向刺入静脉形成穿刺孔。 
		注意：若出现回血渗漏，可用棉签施加压力直至出血停止。</li>
		<li>同样方法牵拉已固定的头侧结扎线，使用弯头镊子将导管滑入静脉内；推进导管直至其与静脉对齐。</li>
		<li>在导管插入静脉的部位，用第二根结扎线打2-3个结进行固定，检查是否无血液渗漏。可额外使用第三根结扎线及局部脂肪组织进一步加固导管。</li>
		<li>使用显微剪刀剪除两根结扎线的多余末端，并滴加一滴生理盐水。</li>
		<li>使用4-0可吸收缝线进行间断缝合关闭皮肤。</li>
		<li>皮下注射10%葡萄糖生理盐水溶液，剂量为10 µL/g小鼠体重。</li>
		<li>使用操作工具的叉端取下保护性铝帽，再用磁性端固定按钮，连接1 mL注射器并通过注射器注入所需体积的抑制剂或PBS/生理盐水。 
		注意：注射前应推动注射器活塞，直至有液滴出现，确保注射器内无空气或气泡。在将注射器从VAS上拆下时，保持对活塞的正压，防止血液被吸入导管尖端导致导管堵塞。</li>
		<li>对闭合伤口喷洒聚维酮碘伤口喷雾，将小鼠置于加热灯下恢复意识，随后放回笼中，并在术后3天内提供7.5 mg匹替拉胺（用于延长镇痛）以及200 mL饮水中含20 mL 5%葡萄糖的饮水。</li>
		<li>每天多次观察小鼠是否有疼痛或不适迹象。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每日注射（&#60;5分钟）
	<ol>
		<li>每日注射时，将小鼠置于麻醉舱中，使用3%-4%异氟烷与2 L/min O2混合气体麻醉，直至小鼠失去意识且呼吸减慢，然后按照步骤2.12.10进行注射。注射后检查颈部是否有肿胀，若有则提示导管已脱离静脉。此外，若导管堵塞，则无法完成注射。 
		&#8203;注意：每日按10 µL/g小鼠体重剂量注射一次，小鼠耐受良好。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 三维超声
<ol>
	<li>准备超声成像系统、加热台和凝胶加热器，将换能器连接至系统，并将其安装在平台上方的横向位置（即垂直于小鼠脊柱）。</li>
	<li>使用超声软件，将增益调节至30 dB，成像深度设为9.0 mm，成像宽度设为8.08 mm。</li>
	<li>将小鼠置于含3%-4%异氟烷与2 L/min O2混合气体的麻醉舱中，直至失去意识。随后将小鼠转移至加热台（37 °C）上，保持仰卧位，并通过鼻罩维持1.8%-2%异氟烷麻醉。</li>
	<li>在双眼上涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。</li>
	<li>剃除小鼠腹部的毛发。如有需要，涂抹脱毛膏1分钟，然后用湿纱布擦拭并清洁干净。</li>
	<li>在平台上的四个心电图（ECG）电极上各加一滴导电胶，并用胶带将小鼠四肢固定于电极上。</li>
	<li>在小鼠腹部涂抹温热的超声耦合剂，然后降低探头使其与动物体表接触。</li>
	<li>将主动脉识别为一个圆形、快速搏动的血管。 
	注：下腔静脉（IVC）位于主动脉旁侧；若用力下压探头，IVC会被压缩而主动脉保持稳定。可通过脉冲波多普勒（PW模式）以65°夹角进一步确认所分析的血管为主动脉而非下腔静脉，主动脉表现为较高的脉冲波速度。</li>
	<li>定位左肾动脉，并手动向上（头侧）扫描至多12 mm，确保目标区域（即肾上主动脉）无干扰。返回左肾动脉位置后，将探头置于左肾动脉头侧6 mm处。 
	注：三维超声将从起始点向尾侧一半距离（6 mm）开始，向上（头侧）记录指定长度（12 mm）。若存在干扰，可采取以下故障排除措施：轻微下压探头、抬起后再重新放下探头、增加超声耦合剂数量，或调整平台倾斜角度。</li>
	<li>三维超声图像采集
	<ol>
		<li>设置呼吸门控为25%延迟，门控窗为50%，心电触发（T1）设为50 ms（用于记录主动脉峰值收缩期扩张）。 
		注：可根据每只动物的呼吸频率和呼吸幅度优化呼吸门控参数，以消除运动伪影。</li>
		<li>在三维选项中，设置扫描距离为11.96&#160;mm，步长为0.076 mm，共生成157帧图像。</li>
		<li>程序将在约1-2分钟内自动完成157帧图像的采集。滚动查看图像质量，若质量不佳则重复采集，确认无误后保存图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二维直径图像采集
	<ol>
		<li>关闭呼吸门控和心电触发，手动定位肾上主动脉12 mm范围内直径最大的区域。</li>
		<li>采集一幅B模式图像16。</li>
		<li>此外，在不移动探头的前提下，使用系统默认设置在同一位置采集一幅心电门控千赫兹可视化（EKV）图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结束扫描
	<ol>
		<li>擦去腹部的超声耦合剂，将小鼠放回笼中。持续监测直至其完全恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 超声分析
<ol>
	<li>体积分析
	<ol>
		<li>在分析软件中，打开3D模式图像，然后在 图像处理 菜单，按下 载入3D，将157个二维帧合成为三维图像（即立方体）。</li>
		<li>在 体积测量 菜单，选择 平行 &amp;#38; 旋转方法然后软件将在单个窗格中显示三维图像。</li>
		<li>下 体积，按压 开始，通过单击添加第一个点，在主动脉周围移动光标，然后右键单击完成轮廓，绘制主动脉内壁的第一条轮廓线。</li>
		<li>跳过9-10帧（0.75-1 mm），然后以相同方式绘制下一个轮廓。重复此步骤直至到达最后一帧，共应得到16-17个轮廓。 
		注意：为了准确计算超过 12 mm 的体积，必须对第一帧和最后一帧绘制轮廓。</li>
		<li>从菜单中选择第一个轮廓并选择 优化这将启动边缘检测算法，使线条紧密贴合血管壁。通过拖动轮廓上的点至新位置，调整轮廓以精确贴合主动脉内壁边缘。 
		注意：在Ang-II模型中，可能存在壁内血栓。由于这是该模型的常见特征，体积测量时应包含血栓。</li>
		<li>优化所有轮廓并按下 完成 保存分析结果。计算出的体积将显示在左下角。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直径分析 
	注意：直径测量可采用内壁至内壁、外壁至外壁或内壁至外壁的方式，但所有测量必须保持方法一致。然而，在Ang-II模型中，可能存在壁内血栓，该部分应包含在分析中。
	<ol>
		<li>从三维模式图像中：通过目视检查评估157帧以确定最大直径。然后，从 测量 菜单，选择 线性 并在主动脉上绘制多条线以确定最大直径。</li>
		<li>从B型或EKV（心电门控千赫兹可视化）图像中：在动态图像序列中，通过目视观察确定主动脉的最大扩张状态（收缩期）。然后，从 测量 菜单，选择 线性 并在主动脉上绘制多条线以确定最大直径。 
		注意：心电图可用于确定心动周期，但目视识别可获得准确结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

由于血管紧张素II（Ang-II）模型技术要求低且具有类似人类疾病的特定特征，因此它是目前最常用的腹主动脉瘤（AAA）小鼠模型之一3,6。每只动物的手术时间约为10分钟，只要皮下囊袋足够宽大并位于动物背部较低位置，远离切口部位，皮下泵植入术通常可被小鼠良好耐受，从而避免影响伤口愈合。当皮肤在泵周围过紧时，可能引起组织刺激，导致炎症和结痂，并可能通过渗透压干扰泵的药物释放机制。在动物处死时测量泵内残留的Ang-II体积，有助于判断Ang-II是否在28天内成功释放。
最近有研究提出，Ang-II 模型非常适合用于研究主动脉瘤和主动脉夹层的进展，因其在病理特征上与人类疾病具有相似性6。尤为重要的是，测试能够抑制主动脉扩张并影响血管重塑的候选药物，符合当前临床需求。在我们的实验设计中，治疗开始前即已确定主动脉瘤形成的判定阈值：以第8天主动脉体积较基线增长125%作为标准，该标准考虑了小鼠间主动脉绝对尺寸的自然变异。该阈值和时间点来源于初步的时间进程实验，该实验通过组织学证实了主动脉壁的破坏（数据未显示），并在导管植入前导致35%的小鼠发生破裂，56%的小鼠出现腹主动脉瘤（AAA）。尽管研究纳入时设定了疾病已确立的最低阈值，但后续观察发现，初始阶段主动脉过度扩张也可能限制实验的可操作性。在第8天体积迅速增长至&#62;200%的动脉瘤中，55%的病例其体积不再进一步增大（图1D）。在实验设计和样本量计算时必须考虑这一因素，因为它可能掩盖治疗的真实效果。该模型的另一个特点是常发生主动脉破裂（胸段或腹段），发生率在20%–40%之间，且多数发生在Ang-II泵植入后的前10天内3,18,19。因此，将治疗起始时间定为第9天，可确保获得较高比例的已确立动脉瘤模型，同时颈静脉导管植入手术主要在预期能够存活至实验结束的小鼠上进行（在我们历史对照组中，仅有3/24只小鼠在第9天后发生破裂），从而节省时间、人力和成本。
除主动脉破裂这一严重情况外，小鼠对导管与血管通路按钮及渗透泵的同步植入耐受性良好，术后恢复期间对活动能力或行为无明显影响。对于经过培训的研究人员，颈静脉插管手术应耗时约30分钟。暴露于异氟烷麻醉的时间应尽可能缩短，并须密切监测动物呼吸频率，以防止呼吸抑制，若未及时处理可能导致致命后果20。在颈静脉穿刺插入导管后可能发生失血——若失血量较大，可能导致动物死亡——其原因可能是颈静脉近端未妥善结扎，或向隔离段血管供血的侧支未闭合。此时，应使用棉签对穿刺部位施加压力，直至出血减缓或停止，随后应尽快完成导管插入和结扎操作；可临时使用一小块胶原伤口敷料以辅助止血。
导管通畅性是最重要的因素之一，因为导管与静脉或血管通路按钮脱开会导致药物输送异常，药物会渗漏至皮下组织。根据制造商建议，导管与金属连接器之间至少应有3 mm的重叠长度，在本模型中（2020–2021年，n = 73），三年内仅记录到一例导管在按钮端脱开的情况（表现为注射液体从按钮处切口渗出），该情况通过手术切开伤口并重新建立连接得以修复。此外，在我们历史上的PBS对照组中，导管通畅性失败率约为10%（2/21），原因包括导管堵塞（无法注射）、导管从静脉脱开（注射时颈部明显肿胀）或伤口愈合并发症。这些问题可能与动物自伤行为有关，例如小鼠抓挠或啃咬。值得注意的是，干扰伤口愈合的药物治疗可能会增加失败率。提高通畅率的故障排除措施包括：增加插入静脉内的导管长度，确保结扎线在导管和静脉周围牢固打结，并按照制造商建议在注射过程中采用正压技术（如步骤2.12.10所述）。此外，应在动物处死时通过解剖并在显微镜下肉眼检查来确认导管通畅性。需特别注意，每日注射的药液量必须谨慎考虑。由于血浆容量调节血压，注射体积可能影响腹主动脉瘤（AAA）的扩张，因此对照动物需接受假手术处理并给予载体体积。根据我们的经验（及未发表的观察结果），每日最多250 µL的PBS剂量似乎耐受良好。最后，与泵植入类似，植入式血管通路按钮周围可能出现皮肤刺激。若观察到伴有组织失活或坏死的炎症反应，应通过清除无活力组织（坏死组织通常会自然与伤口分离）进行清创处理，并在必要时缝合皮肤；若炎症和坏死范围广泛，则需依据相关指南评估动物福利状况并考虑人道终点。
在背部单侧或双侧植入渗透压泵和/或VAS均不会干扰超声信号，也不会影响将小鼠稳定固定在超声检测平台上的适当位置。通过自动采集12 mm范围内共157帧图像以重建主动脉三维图像并进行容积测量，是一种简单且快速的操作14，仅需确保在目标区域主动脉无干扰即可。在此过程中一个需要注意的问题是，在试图消除图像干扰时对探头施加过大的压力，这可能在采集腹主动脉颅端图像时因压迫肋骨而影响呼吸频率，从而中断自动测量。传统上，主动脉直径是在B模式图像中由操作者手动寻找最大直径区域进行测量的。相较于B模式图像，EKV图像是一种技术进步，其能够解析微小的主动脉运动，生成高质量、慢放的搏动主动脉图像。此外，还可从采集的三维图像帧中确定主动脉最大直径，这157帧图像在心动周期收缩期（由于设定了ECG触发）对主动脉进行了全面的成像覆盖。
综上所述，本研究所提供的整合方案为在血管紧张素II（Ang-II）诱导的小鼠腹主动脉瘤（AAA）模型中进行静脉给药以及通过三维超声监测主动脉尺寸，提供了一种可靠且可重复的操作流程。监测和手术的时间点可根据具体实验需求进行调整，颈静脉插管操作也可独立实施，适用于任何需要通过静脉注射递送特定物质的实验设计。若使用导管封闭液以防止凝血，血管通路系统（VAS）还可用于重复采血。所述三维超声检查方法可调整用于测量肾下腹主动脉，该部位在弹性蛋白酶或氯化钙（CaCl2）诱导的急性损伤小鼠AAA模型中可形成动脉瘤。尽管三维超声成像具有能够全面显示受累主动脉区域及动脉瘤形态的优势，但其图像采集过程耗时较长，因此可能带来更高的成本。本方案另一需指出的局限性在于，动物需短暂麻醉以进行静脉注射，而腹腔注射通常可在清醒小鼠中完成。

腹主动脉瘤（AAA）是一种由于主动脉壁发生炎症和组织破坏过程导致的血管病理性扩张，最终可能导致动脉瘤破裂并引发患者死亡。尽管在腹主动脉瘤外科修复方面已取得显著进展，但迄今为止仍缺乏可有效阻止动脉瘤持续扩张、并可能降低破裂风险的保守性药物治疗手段。为阐明该疾病的触发因素和介导机制，并测试新的治疗策略，研究人员已开发出多种动物模型。其中，小鼠模型被广泛应用，能够涵盖人类组织中的多种病理特征。由于不同模型在病理机制上存在差异，研究特定分子/通路的功能或潜在治疗药物的疗效时，通常需要采用不止一种模型1,2。在常用的腹主动脉瘤诱导模型中，载脂蛋白E缺陷（ApoE KO）小鼠给予血管紧张素II（Ang-II）是最常见的方法之一3，与依赖主动脉壁急性损伤诱导动脉瘤形成的模型相比，该模型具有更类似慢性病程的病理特征4,5。因此，Ang-II模型特别适用于监测疾病进展，并且最近的研究表明，其在代谢和炎症反应方面与人类腹主动脉瘤疾病高度相似6。值得注意的是，Ang-II模型不仅可诱导腹主动脉瘤的形成，还可引起胸主动脉瘤以及伴有壁内血栓形成的主动脉夹层。
以已经形成的腹主动脉瘤（AAA）的进展为靶点的治疗策略，而非以预防疾病发生为目标，可能具有更高的转化价值，因为患者就诊时通常已存在需要治疗的既往病变7,8。为了实现可比较的实验设计，需要在诱导AAA前后监测主动脉尺寸，以确定疾病发展的阈值，并可能据此将小鼠分层分配至不同的治疗组。
给药方式取决于相应物质的吸收和稳定性。腹腔（i.p.）注射因操作简便、无需麻醉且不受注射体积限制而最常被采用9。然而，在选择给药途径时必须考虑药代动力学因素，因为腹腔给予的物质主要通过肝门静脉系统吸收，在进入体循环前可能经历肝脏代谢，从而因首过效应导致血浆浓度存在差异10。静脉（i.v.）注射可使物质获得最高的生物利用度，而通过使用导管和血管通路装置进行每日给药，可避免反复静脉穿刺带来的困难11,12,13。在腹主动脉瘤（AAA）研究背景下，药物在循环系统中的分布有助于使动脉瘤直接暴露于确定浓度的药物环境中。
本文介绍了一种通过皮下植入渗透泵在Ang-II小鼠模型中诱导腹主动脉瘤（AAA）的工作流程，该方法利用插入颈外静脉的导管连接血管通路端口，实现每日静脉给药，同时可在存在两个背部植入物的情况下，通过三维超声成像监测动脉瘤大小14。

<table><tbody><tr><td>4-0 Polysorb 缝线</td><td>Covidien</td><td>GL-46-MG</td><td>编织可吸收缝线 CV-23 Taper</td></tr><tr><td>6-0 丝线缝线</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td>PERMA-HAND 丝线</td></tr><tr><td>ALZET 2004 渗透压泵</td><td>DURECT Corp</td><td>298</td><td>渗透压微型泵</td></tr><tr><td>血管紧张素-II</td><td>Bachem</td><td>4006473.0100</td><td>醋酸血管紧张素 II</td></tr><tr><td>Aquasonic Clear 超声传导凝胶</td><td>Parker Labs</td><td>PUSG-0308</td><td>超声耦合凝胶</td></tr><tr><td>Betadona 伤口喷雾</td><td>Mundipharma</td><td></td><td>伤口消毒喷雾（聚维酮碘喷雾）</td></tr><tr><td>Betaisodona 溶液</td><td>Mundipharma</td><td>15973</td><td>伤口消毒溶液（聚维酮碘溶液）</td></tr><tr><td>小鼠股静脉/动脉导管</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>C10PU-MFV1301</td><td>1 至 3Fr，10.5 cm，1.2 cm 处带卡环，适配 22 G</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>操作工具</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>VABMG</td><td>用于磁性小鼠血管通路按钮的操作工具</td></tr><tr><td>HYLO NIGHT 眼用软膏</td><td>URSAPHARM</td><td>538922</td><td>眼部润滑软膏</td></tr><tr><td>各种规格的针头和注射器</td><td></td><td></td><td>1 mL 和 5 mL 注射器，27 G 和 30 G 针头</td></tr><tr><td>Olympus SZ51 体视显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>解剖与检查用显微镜</td></tr><tr><td>PinPort 注射器</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>PNP3M-50</td><td>血管通路按钮专用注射器</td></tr><tr><td>保护性铝帽</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>VABM1C</td><td>用于磁性单通道小鼠 VAB 的保护性铝帽</td></tr><tr><td>Signa 电极超声凝胶</td><td>Parker Labs</td><td>PE-1560</td><td>电极凝胶</td></tr><tr><td>小型电动剃毛器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科及显微外科器械</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suprasorb C</td><td>Lohmann &amp; Rauscher</td><td>20482</td><td>胶原蛋白伤口敷料</td></tr><tr><td>血管通路按钮（VAB）</td><td>Instech Laboratories Inc</td><td>VABM1B/22</td><td>小鼠用磁性单通道 22 G 血管通路按钮，含注射器</td></tr><tr><td>Vevo 3100 成像系统</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td>51073-51</td><td>超声成像系统</td></tr><tr><td>Vevo Lab 5.6.1 软件</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td></td><td>超声分析软件</td></tr><tr><td>Vevo MX550D 探头</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td></td><td>Vevo 3100 系统用线性阵列探头</td></tr><tr><td>Vevo 小鼠操作台</td><td>FUJIFILM VisualSonics Inc</td><td>11436</td><td>用于小鼠加热、核心温度监测及 ECG 垫片的生理监测平台</td></tr></tbody></table>

通过中心静脉导管在血管紧张素ii诱导的小鼠腹主动脉瘤模型中进行药物治疗及三维超声监测

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

由于在腹主动脉瘤（AAA）的临床管理中缺乏有效的药物治疗手段，动物模型（尤其是小鼠模型）被用于深入理解疾病的发病机制，并识别潜在的治疗靶点。在这些模型中测试新型候选药物以阻断AAA生长，通常需要在实验过程中进行重复给药。本文描述了一套整合的实验方案，包括AAA诱导、静脉导管植入以实现长期治疗，以及通过三维超声对AAA进行系列监测。在载脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠中，通过皮下植入的渗透压微型泵持续28天释放血管紧张素II来诱导动脉瘤形成。随后，进行颈外静脉插管手术，以便通过皮下血管通路按钮实现每日静脉给药或重复采血。尽管小鼠背部存在两个背侧植入物，通过连续的半自动化三维超声分析仍可便捷地监测AAA的发展，该方法可提供关于主动脉直径与体积扩张以及动脉瘤形态的全面信息，文中已通过实验示例加以说明。

代表性结果展示了通过超声在基线、第8天和第27天监测到的肾上腺上动脉瘤的发展和进展过程（图1A）。对图1A中第27天主动脉进行的三色染色（图1B）进一步显示了所形成动脉瘤的形态，包括管壁剥离和壁内血栓。主动脉体积（mm3）在12 mm长度范围内测定14，并从EKV图像中额外测量最大主动脉直径。将从基线到第8天主动脉体积增长达到125%作为界定动脉瘤初始形成的阈值。根据两年（2020–2021年，n = 157）的数据，仅有9%的动物未形成腹主动脉瘤（AAA）。然而，35%的小鼠在第9天导管植入前发生了主动脉破裂（胸段或腹段），因此最终有56%的存活动物形成了可明确诊断的AAA，可用于分组治疗研究（图1C）。值得注意的是，在我们历史上的PBS对照组（n = 21）中，动脉瘤发展程度不一（范围：128%–314%，第8天平均主动脉体积增长为199% ± 55% SD）。重要的是，初始扩张程度与后续疾病进展之间存在反向关系，即55%的快速进展型动脉瘤（第8天体积增长 >200%）在之后至第27天未再进一步发展，而其余动脉瘤中（第8天体积增长 >125% 且 <200%）有80%持续扩张直至实验结束（图1D）。
如近期报道14,17，上述方法已成功建立、验证并实施，例如用于记录组蛋白瓜氨酸化抑制剂（GSK484，用于抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成）在阻断已形成腹主动脉瘤（AAA）进展中的治疗效果。载脂蛋白E缺陷型小鼠通过皮下植入的渗透压泵持续28天接受血管紧张素II（Ang-II）输注，剂量为1000 ng/kg/min。根据第8天测得的主动脉体积，将动物按1:1比例分层，分别接受GSK484（0.2 µg/g/天）或磷酸盐缓冲液（PBS）处理，并于第9天接受颈静脉导管植入手术。药物注射以每克小鼠体重10 µL的剂量每日进行，直至研究结束17。图2展示了代表性超声结果（n = 2/组），显示绝对和相对体积或直径扩张的时间变化过程，结果表明GSK484治疗可抑制AAA的进展，而对照组小鼠的动脉瘤则持续扩大。
<img alt="利用超声成像、组织学图示和频率分析图表评估动脉瘤进展。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64124/64124fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1通过三维超声检测Ang-II小鼠模型中腹主动脉瘤的形成与进展 (A通过三维超声在肾上腺上方主动脉植入血管紧张素II泵前（基线，BL）、第8天（d8）和第27天（d27）进行监测。基于三维重建图像，在肾上腺上方主动脉12 mm节段（共157帧）测量其体积。最大主动脉直径由EKV图像确定。B小鼠安乐死后取材，对第27天的主动脉横切面进行三色染色。主动脉夹层的存在由L1/L2（第一管腔和第二管腔）指示，血管壁内血栓以*标注。 A 和 B. (C) 腹主动脉瘤的发病率（&gt;125% 主动脉容积增长（相对于基线）持续至第8天，并在前9天内出现主动脉破裂（胸段或腹段），数据来自为期2年的数据集（n = 157）。D从第8天到第27天初始快速形成进展频率&gt;从基线到第8天主动脉体积增长200%）与中度增长（&gt;125% 和 &lt;PBS对照处理小鼠（n = 21）从基线至第8天主动脉体积增长200%的动脉瘤 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64124/64124fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="比较对照组与GSK484在三个时间点的主动脉生长图；数据分析与结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64124/64124fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：通过血管通路按钮静脉注射GSK484或PBS抑制组蛋白瓜氨酸化以阻断Ang-II模型中腹主动脉瘤进展的代表性结果。 （A）在肾上主动脉12 mm节段内测得的主动脉体积（mm3）。（B）从基线（BL = 100%）计算的主动脉体积增长。（C）根据EKV图像确定的最大主动脉直径。（D）从基线计算的主动脉直径增长。GSK484数据来自先前发表的研究17。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64124/64124fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了在载脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠中，通过连续植入渗透泵释放血管紧张素II诱导腹主动脉瘤，并植入带有颈静脉导管的血管通路端口以进行重复药物治疗的方法。尽管存在背部植入物，仍可有效通过三维超声监测动脉瘤的发展。

通过中心静脉导管在血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤模型中进行药物治疗及三维超声监测

由于腹主动脉瘤（AAA）的临床管理缺乏有效的药物治疗手段，动物模型，尤其是小鼠模型……

该方案结合了一种模拟人类已知疾病的腹主动脉瘤小鼠模型，以及通过静脉导管进行的重复给药治疗，旨在满足临床上阻止动脉瘤进展的需求。本方案提供了在小鼠中测试减缓动脉瘤进展药物的完整工作流程，包括主动脉直径、体积及形态学变化的全面评估信息。增加三维超声。三维超声可适用于测量肾下主动脉，该部位在味觉偏好较低的小鼠模型中易形成动脉瘤。颈静脉插管可用于任何需要静脉注射的实验操作。对12至14周龄的雄性APOE缺陷小鼠进行麻醉后，剃除其背部左上方肩胛骨区域的小块毛发，使用10%聚维酮碘溶液对该剃毛区域进行消毒。用手术刀在背部上方皮肤做一长约1厘米的横向切口，切口位置位于脊柱中线与左侧肩胛线之间，用镊子提起皮肤，并使用钝头弯剪进行操作。通过向左后肢方向推动来制作一个皮下囊袋。打开剪刀并拉着张开的剪刀从切口处拉出，以扩大囊袋。将泵轻轻插入囊袋中，使流速调节器朝向尾部，以尽量减少切口部位释放的血管紧张素二可能造成的干扰。然后使用4.0可吸收间断缝线关闭伤口。使用血管通路系统时，将导管的三法式侧端剪至所需长度，并将导管推过血管通路系统（VAS）的22号金属连接器，确保至少有3毫米的重叠部分。将铝帽盖在按钮上以保护端口。剃除麻醉小鼠颈部腹侧右侧以及上背部右侧的毛发，然后涂抹聚维酮碘溶液以消毒剃毛区域。进行颈外静脉准备时，在颈部右侧锁骨上方做一处0.5厘米的横向皮肤切口。使用钝头显微外科镊子分离结缔组织和脂肪，暴露颈外静脉。注意避免撕裂脂肪中的小血管。在靠近胸肌处分离出约五毫米的血管。然后使用弯头显微镊子钝性分离静脉下方的组织，并穿过两到三条6.0丝线结扎线。将结扎线妥善收好，并在操作部位滴加一滴生理盐水。进行按钮植入时，将小鼠翻转至俯卧位。使用聚维酮碘溶液对已剃毛区域进行消毒。用手术刀在背部上方正中脊柱线与右侧肩胛线之间做一厘米长的矢状切口。接下来，使用钝头弯剪在切口周围进行钝性分离，制作一个略大于血管鞘（VAS）尺寸的环形口袋。用钝头弯剪在右侧肩部上方向头侧方向分离，朝向颈部的腹侧切口，通过轻微张开剪刀形成隧道。然后将张开的剪刀向外拉出，并在继续向前推进时重复此操作。当隧道到达腹侧切口时，将手术钳从腹侧切口穿过至背侧切口。将导管的三法式端固定于钳子上，并将导管经隧道拉出，使其从颈部腹侧切口穿出，同时使血管固定装置（VAS）位于背侧切口处。随后，将 VAS 手术用毛毡盘插入背部切口的皮下组织中。使用操作工具的叉端取下保护性铝帽，用磁性端固定按钮，并将1毫升注射器连接至相应的注射装置，注入生理盐水或PBS，直至液体从1 French端渗出，以此检查导管是否通畅。将按钮向尾侧推入皮下囊袋中，并在VAS法兰下方覆盖VAs的涤纶圆盘处，用两针4-0间断缝线向头侧缝合皮肤。进行静脉插管时，将小鼠翻转回仰卧位，并在切割侧滴加一滴生理盐水。分离结扎线，将第一根结扎线尽可能靠前（向头侧）在导管和颈静脉上打两到三个结，以结扎静脉并将导管固定于体外。将第二根结扎线尽可能靠近胸肌。使用显微剪刀剪成斜角，形成锐利末端，使导管有三到五毫米长度位于静脉内。然后，用已固定好的颅侧韧带牵拉静脉，将连接一毫升生理盐水注射器的27号针头平行于静脉刺入静脉内。接着，同样通过牵拉已固定好的颅侧韧带，用弯头镊子将导管沿针头滑入静脉。推进导管，直至其与静脉对齐。在导管插入部位用第二个结扎线打两到三个结，检查无血液渗漏。用显微剪刀剪去两条结扎线的多余末端，并滴加一滴生理盐水。然后用4.0可吸收间断缝线缝合皮肤。按照之前演示的方法，向小鼠注射所需体积的抑制剂或PBS生理盐水。在将注射器从VAS断开时，保持推杆的正压。小鼠苏醒后进行监测。使用超声软件调整参数，将增益设为30 dB，图像深度设为9.0毫米，宽度设为8.08毫米。接着，在平台上的四个心电图（ECG）电极上各滴加一滴导电凝胶，并用胶带将小鼠的四肢固定在电极上。在小鼠腹部涂抹温热的超声耦合剂，然后降低探头，使其与腹部接触。将主动脉识别为一个圆形、快速搏动的血管。定位左肾动脉，并手动向上（头侧）检查至多12毫米的区域，以确保目标区域无干扰。返回至左肾动脉。然后将探头置于动脉 cranially 六毫米处。进行三维超声采集时，将呼吸门控设置为 25% 延迟，窗宽为 50%，心电图触发设置为 50 毫秒。在三维选项中，将扫描距离设为 11.96 毫米，步长为 0.076 毫米。获取157帧图像后，在保存图像前滚动查看图像质量。进行二维直径采集时，关闭呼吸门控和心电图触发，手动定位腹腔动脉上方主动脉12毫米节段中直径最大的区域。按下屏幕上的B模式按钮，采集一幅B模式图像。此外，在不移动探头的情况下，使用系统的标准设置在同一位置获取一幅EKV图像。通过超声在基线第8天和第27天监测肾上动脉瘤的发展和进展。第27天主动脉的三色染色图像显示了所形成动脉瘤的形态，包括管壁剥离和壁内血栓。在第8天腹主动脉瘤（AAA）的发生率以及前9天内主动脉破裂的情况显示，有9%的小鼠未能形成AAA。然而，35%的小鼠在导管植入前即发生主动脉破裂，因此最终仅有56%的剩余小鼠成功建立稳定的AAA疾病模型，可用于分组治疗。在PBS对照组处理的小鼠中，初始扩张速度较快的动脉瘤与中等速度生长的动脉瘤相比，其早期扩张程度与后续疾病进展之间呈现出负相关关系。典型的超声结果表明，GSK 4 84 处理抑制了腹主动脉瘤（AAA）的进展，而对照组小鼠的动脉瘤则持续扩大。导管通畅至关重要，因为导管若从静脉或血管通路按钮处断开，会导致药物进入皮下间隙，从而在动脉瘤部位产生未知浓度的药物。实验结束时处死小鼠后，可对水和其它组织进行组织学检查，并开展血液分析，以表征药物的靶向及脱靶效应。

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科研

JoVE Journal

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医学

血管紧张素II诱导的腹主动脉瘤小鼠模型中中心静脉导管的药物治疗及3D超声监测

皮下植入渗透泵为化合物的长期且稳定的递送提供了一种便捷的方法。该方法已广泛用于研究小鼠的腹主动脉瘤和胸主动脉瘤。...

利用渗透泵进行皮下血管紧张素II输注在小鼠中诱导主动脉瘤

将聚氨酯导管插入主动脉管腔并结扎缝合主动脉，可因外膜滋养血管灌注不足而引起慢性缺氧。本文介绍了一种新型的腹主动脉瘤（AAA）动物模型，其特征与人类腹主动脉瘤相似。...

通过阻断外膜滋养血管灌注建立腹主动脉瘤的啮齿动物模型

本文介绍了一种使用不透射线的含铅硅橡胶灌注小鼠血管系统的详细方法，用于在主动脉瘤和主动脉夹层小鼠模型中定量测定主动脉直径。...

利用微计算机断层扫描对β-氨基丙腈诱导的小鼠主动脉瘤与主动脉夹层疾病模型进行定量分析

超声成像已成为测定小鼠胸主动脉和腹主动脉瘤管腔尺寸的常用方法。本方案描述了获取小鼠升主动脉和腹主动脉可靠且可重复的二维超声图像的操作流程。...

小鼠胸腹主动脉超声成像以测定动脉瘤尺寸

通过穿透小鼠肾下腹主动脉的双层管壁进入下腔静脉，建立主动脉-下腔静脉瘘，随后通过部分结扎下腔静脉在其流出道处形成狭窄。该可重复模型可用于研究中心静脉狭窄。...

利用动静脉瘘合并流出道狭窄建立中心静脉狭窄的小鼠模型

本文描述了一种利用高频超声成像技术在腹主动脉瘤小鼠模型上测量管腔直径、脉搏传播速度、可扩张性和径向应变的详细实验方案。...

腹主动脉瘤小鼠模型中脉搏传播速度、可扩张性和应变的测量

本方案描述了一种标准化的手术方法，通过将弹性蛋白酶直接作用于小鼠肾下腹主动脉的外膜，以建立弹性蛋白酶诱导的腹主动脉瘤（AAA）模型。...

通过血管周围应用弹性蛋白酶诱导的小鼠腹主动脉瘤模型

本论文介绍了一种利用氯化钙和弹性蛋白酶建立小鼠腹主动脉瘤模型的实验方案，该方法结合了既往建模技术的优点。此模型可用于研究腹主动脉瘤发生的病理生理机制。...

通过腹膜外氯化钙与弹性蛋白酶渗透建立的小鼠腹主动脉瘤模型

本方案介绍了一种系统性的手术方法，通过将弹性蛋白酶直接作用于肾下主动脉并经饮水给予ß-氨基丙腈，从而在小鼠体内建立晚期腹主动脉瘤模型。...

通过局部弹性蛋白酶联合口服β-氨基丙腈在小鼠中建立高级腹主动脉瘤模型

本方案提供了一种可重复且可靠的方法，通过弹性蛋白致敏联合血管周围应用弹性蛋白酶，在C57BL/6小鼠中诱导腹主动脉瘤（AAAs），建立包含免疫致敏成分的腹主动脉瘤模型。...

利用弹性蛋白致敏与血管周围弹性蛋白酶法可靠建立小鼠腹主动脉瘤模型

了解腹主动脉瘤小鼠模型的药物治疗方法，通过渗透泵植入和颈静脉导管实现重复给药，并利用三维超声监测动脉瘤进展。该方法为心血管疾病研究提供了可靠的药物测试平台。

通过中心静脉导管在血管紧张素II诱导的小鼠腹主动脉瘤模型中进行药物治疗及三维超声监测

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