体外筛选适配体以区分感染性与非感染性病毒

本方案描述了如何筛选能够区分感染性病毒与非感染性病毒的DNA适配体，以获得可判断临床或环境样本感染能力的传感分子。该技术可用于获取多种其他病毒（包括新发病毒）的特异性适配体，因其无需预先了解病毒的结构或序列信息。该技术有助于开发适配体传感器，用于临床诊断和环境中感染性病毒的监测，以判断个体是否具有传染性，或评估环境消毒方法是否达到预期效果。

筛选可能是一个困难的过程，特别是对于初次接触该技术的研究人员而言。优化PCR条件并通过qPCR监测筛选进程至关重要。本实验操作将由我实验室的研究生Marcos Gramajo进行演示。

首先，设计初始的单链DNA（SS-DNA）文库和引物。从商业渠道获取经标准脱盐纯化的DNA寡核苷酸。通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化单链DNA文库和引物，随后进行乙醇沉淀。

接下来，获取感染性和非感染性病毒的储备液，或按照文稿中所述方法进行制备。为变性单链DNA文库，将10微升浓度为100微摩尔的单链DNA文库与240微升SELEX缓冲液混合。在干浴仪中95摄氏度加热15分钟，然后将离心管置于冰上冷却15分钟。

将250微升SS-DNA文库与50微升感染性病毒在SELEX缓冲液中混合，用于正向筛选。室温孵育两小时。然后将400微升1毫摩尔的T20序列加入0.5毫升滤膜中，以阻断非特异性结合位点。

将滤膜孵育30分钟。在14,000 G条件下离心10分钟，以去除T20溶液。随后用SELEX缓冲液洗涤滤膜三次，以去除过量的T20序列。

接下来，将SS-DNA文库与感染性病毒混合物加入已封闭的100千道尔顿滤膜中，离心以洗去未结合的序列。加入400微升SELEX缓冲液并离心，重复洗涤滤膜三次。保留滤膜中的组分，弃去滤过液。

为洗脱结合的序列，更换离心过滤管的收集管，并向滤膜中加入300微升含有8摩尔尿素的SELEX缓冲液。将滤膜在95摄氏度加热15分钟，然后离心以收集含有洗脱序列的穿流液。操作完成后，用10%次氯酸钠溶液清洗材料。

接下来，将前一步骤中收集的单链 DNA 感染性病毒溶液加入已封闭的 10 千道尔顿滤膜中，在 14,000 G 条件下离心 15 分钟，弃去滤过液。用 300 微升 SELEX 缓冲液洗涤滤膜三次，通过离心去除尿素，每次均弃去滤过液。将滤膜倒置放入干净的收集管中，离心 5 分钟，回收滤膜中的溶液。

使用移液器测量回收溶液的最终体积，并标记为第1A轮样品。取第1A轮样品的90%作为第一轮的模板，在优化条件下进行PCR反应。为利用链霉亲和素修饰的磁珠（MB）回收单链DNA（SS-DNA），将产物分装为每份50 µL，加入含有50 µL磁珠的微量离心管中。室温下轻微振荡孵育30分钟。

然后将离心管置于磁力架上以分离磁珠（MB），并用移液器吸除上清液。向离心管中加入200微升结合与洗涤缓冲液，洗涤磁珠两次。随后将离心管从磁力架上取下，轻轻振荡，再通过移液将磁珠重悬于缓冲液中，形成均匀的溶液。

将试管再次置于磁力架上，移除上清液。第二次洗涤后，将磁珠重悬于100微升SELEX缓冲液中，95摄氏度加热10分钟。立即把试管放入磁力架，收集含有单链DNA文库的上清液。

重复此回收步骤，加入 50 微升 SELEX 缓冲液。测量回收组分的最终体积，并标记为第 1X 轮。为使单链 DNA 文库变性，取第 1X 轮样品的 60%，并与 50 微升 SELEX 缓冲液混合。

将样品在干浴中加热，然后将离心管置于冰上15分钟。接下来，在SELEX缓冲液中将变性的单链DNA文库与每种病毒各50微升混合，作为去除非特异性结合的反向筛选步骤，并在室温下孵育1小时。在用离心过滤器阻断非特异性结合位点后，将与病毒溶液孵育过的变性单链DNA文库混合物加入已阻断的100千道尔顿滤膜中。

将滤器在14,000 G离心10分钟，收集穿滤液。取300微升组分，与含有100 million拷贝/毫升的50微升感染性病毒混合。室温孵育2小时。

按照文中所述，配制标准的qPCR预混液，并对纯化的单链DNA文库进行梯度稀释。运行qPCR以确定阈值循环数。运行结束后，利用标准曲线对第1A轮和第1X轮中的单链DNA含量进行定量。

然后，通过将结合的DNA量除以初始DNA量来计算洗脱效率，并绘制洗脱效率随轮次的变化曲线。最后，绘制不同轮次的熔解曲线。对于高通量测序，选择合适的市售试剂盒。

制备代表高、中、低富集水平的多轮筛选文库，并为每个文库在接头中使用不同的索引组合，同时制备最终文库。随后将制备好的最终文库送至测序机构。进行测序分析时，测序机构已对序列进行解复用处理。

使用命令行程序 Cutadapt 去除测序接头和选择引物。然后使用 FASTX-Toolkit 程序去除低质量序列。接着，利用 FASTX-Toolkit 中的 FASTX_reverse_complement 功能对反向方向的序列文件进行处理，并将其与正向方向的序列文件合并。

然后使用内置的 CAT 程序将文件合并为单个文件。利用 FASTAptamer 分析工具包分析不同筛选文库中序列的富集情况。首先，使用 FASTAptamer count 和 FASTAptamer cluster 功能将相似序列归类到同一簇中。

接下来，使用 FASTAptamer enrich 功能获取有关序列和聚类富集的信息。根据序列分析获得的富集信息，鉴定候选适配体序列。选择若干适配体序列，并通过结合实验进行初步筛选。

在本项分析中，采用qPCR监测针对传染性SARS-CoV-2特异性适配体的SELEX筛选进程。洗脱产量在SELEX的前几轮中逐轮增加，并在第八轮和第九轮趋于稳定。通过比较熔解曲线，观察到高熔解温度峰从77至79摄氏度发生偏移。

此外，在最后两轮筛选中观察到一个低熔解温度的峰。图中显示了连续筛选轮次中获得的SARS2 AR10序列每百万读段的相对丰度。SARS2 AR10的预测结构表明其具有有序的二级结构，包含一个茎环区域，可能参与对病毒的识别。

一旦获得适配体，便可将其整合到电光传感器等其他类型的传感器中，以开发便携式且快速的病毒检测方法，从而判断病毒的感染性。我们预计，可获得针对病毒不同变异株或血清型的特异性适配体，从而实现对威胁社会最严重变异株的快速监测。