Name: 使用正电子发射断层扫描对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中的 CD19+ B 细胞进行成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学习使用正电子发射断层扫描技术对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中的CD19阳性B细胞进行活体成像，实现中枢神经系统B细胞分布与动态变化的高精度定量分析。

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我们感谢斯坦福大学SCi3小动物成像中心提供的支持，以及Frezghi Habte博士在PET/CT技术方面的协助。液相色谱-质谱（LC-MS）由斯坦福大学质谱中心（SUMS）的核心技术人员完成，我们感谢该中心工作人员提供的此项服务。我们感谢Horizon Therapeutics慷慨提供hCD19-mAb，特别感谢Jodi Karnell在技术上的指导与支持。本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH NINDS）资助（项目编号：1 R01 NS114220-01A1）。

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</ol>

CD19 抗体由 Horizon Therapeutics 提供。

本文介绍了一种利用CD19-PET在多发性硬化（MS）小鼠模型中成像人源CD19+ B细胞的简化方法。由于MS的临床表现具有异质性，且患者对治疗的反应各不相同，因此在临床管理中常面临挑战，迫切需要新的治疗选择和监测手段。正电子发射断层扫描（PET）成像可作为监测疾病进展及个体对B细胞清除疗法反应的有力工具。除MS外，CD19-PET成像还可用于监测淋巴瘤和白血病亚型或其他B细胞介导疾病治疗后的B细胞清除情况。本实验方案及代表性数据展示了在神经系统疾病中进行B细胞成像的应用价值。
为了在多发性硬化症（MS）的背景下研究人类CD19+ B细胞，我们选用了B细胞依赖性的MOG1-125 EAE模型7。与其他EAE模型类似，该模型表现出进行性瘫痪症状以及免疫细胞向中枢神经系统（CNS）的浸润。然而，MOG1-125模型的独特之处在于它是一种由B细胞驱动的模型：小鼠在软脑膜的蛛网膜下腔、脑干、实质和脑室中存在数量不等的B细胞。这些淋巴细胞可零星分布于上述区域，或形成滤泡样结构，而这类结构在多发性硬化症患者中亦有观察到8,9。除了使用未处理小鼠作为对照外，还可使用仅含完全弗氏佐剂（CFA）的诱导试剂盒（即与给予EAE小鼠的诱导乳剂成分相同，但不含MOG蛋白）。在EAE小鼠模型中，血脑屏障（BBB）功能障碍，允许抗体等较大分子穿过。CD19-mAb放射性示踪剂仅在B细胞存在时才会结合并滞留在中枢神经系统内；若无B细胞存在，示踪剂将重新循环回血液中。我们已通过γ计数及在测量组织放射性水平前进行灌流的离体（ex vivo）自显影技术，在中枢神经系统组织中验证了这一现象。此外，我们在早期发表的研究中也证实了基于单克隆抗体的PET放射性示踪剂（即免疫PET成像方法）可用于检测中枢神经系统中的B细胞1,2。
由于DOTA螯合剂已用于临床PET成像中铜-64标记的多肽和抗体，我们旨在将hCD19-mAb转化为用于多发性硬化症（MS）患者临床成像的应用。DOTA对铜-64具有足够的结合亲和力 体内。该 体内 稳定性非常重要，因为游离的 64铜会进入肝脏，可能掩盖结合放射性示踪剂的信号；因此，测量肝脏中的信号以计算与其他器官相比的相对信号强度非常重要。肌肉通常被用作对照组织，但在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）情况下，肌肉中可能存在炎症。该放射性核素的半衰期为 64Cu 的半衰期为 12.7 小时，这为 DOTA-hCD19-mAb 与其靶标结合提供了充足的时间，同时确保 PET 可检测到信号。在制备偶联物时，应先进行小规模（75–125 µg）的预实验，以确定添加至单克隆抗体（mAb）的 DOTA 用量，从而获得目标 DOTA/mAb 摩尔比（例如，每摩尔 mAb 使用 6–10 倍摩尔过量的 DOTA-NHS-酯，可能得到 1–2 个 DOTA/mAb 的偶联物）。反应时间与温度（例如，2–4 小时或 4 °C 或室温下过夜）也会影响 DOTA/mAb 比值，需进行优化。可通过非放射性铜滴定法计算每个 mAb 所偶联的 DOTA 数量；然而，我们建议采用 MALDI-MS 和/或 LC-MS 以获得更可靠和准确的结果。
计算得到的DOTA/mAb比值是特定样品的平均值，预期会存在一定变异。对于MALDI分析，每个样品需对偶联和未偶联的单克隆抗体（mAb）分别采集多个质谱信号点。随后我们计算偶联与未偶联mAb的比值，以确定每个mAb上DOTA的平均数量。DOTA/mAb比值至关重要，因为螯合剂过多会干扰抗体的结合能力，而过少则会导致放射性标记不一致和信号强度低。为了保持信号强度和结合动力学的一致性，不同批次偶联物之间的该比值应尽可能接近；理想情况下，同一项研究中的所有实验应使用同一批次的偶联物。一种有望减少因过度偶联而影响免疫反应性的技术是位点特异性偶联10，该方法使螯合剂选择性地结合于抗体重链糖链的特定位置，从而确保每个mAb上仅添加一个螯合剂分子。
应优化放射性标记反应条件，以确保最高的标记效率和产率，因为抗体、DOTA/单克隆抗体比例以及64Cu比活度等因素的差异均会影响放射性标记效果。采用最佳的64Cu与单克隆抗体结合物比例，可能使放射性示踪剂在无需纯化的条件下使用，从而缩短放射性标记所需时间，并减少因重力流柱操作和放射性衰变造成的损失。当使用相同的64Cu与单克隆抗体结合物比例时，还可获得一致且可靠的摩尔比活度，这在比较多组小鼠或多个成像研究的结果时尤为重要。ITLC条件也可根据用户需求进行调整。如果必须进行纯化，应保留一份等分试样用于HPLC和/或紫外/可见光光谱分析，以便计算摩尔比活度。
需要注意的是，使用放射性标记抗体进行成像可能具有挑战性。用于放射性示踪剂的抗体必须具有生物学惰性，以避免产生生理效应。此外，由于抗体在血液中存留时间较长，必须等待足够长的时间，以确保单克隆抗体完成循环、靶向结合及清除过程，从而在不损害图像质量的前提下获得理想的信噪比。通常情况下，对于64Cu标记的单克隆抗体，等待20至48小时已足够；但在评估一种新的单克隆抗体PET示踪剂时，应于注射后2、4、6、12、24和48小时进行成像，以确定在特定啮齿类动物模型中成像的最佳时间点。对于获取具有最高信噪比的自显影（ARG）图像，同样需要遵循这一原则。本方案中的代表性图像采集于注射后18至20小时，但具体时间点应根据所使用的放射性同位素进行调整。针对CD19不同表位结合的不同抗体将产生不同的结果，因此应对其进行严格的表征分析。
在分析脊髓信号时，将小鼠仰卧位放置于扫描床中非常重要，以减少呼吸引起的运动。此外，对于因EAE疾病进展而导致脊柱弯曲度增加的小鼠，仰卧位有助于拉直脊柱。在试图检测脊柱和脊髓信号时，另一个需要考虑的重要因素是避免在小鼠侧腹注射MOG1-125，因为注射部位可能由于局部免疫反应而结合示踪剂。注射部位与脊髓位置接近，可能干扰脊髓的分析；因此，本研究所述应用中优先选择胸部注射。
所采用的图像分析技术专用于中枢神经系统（CNS）成像。只要正电子发射断层扫描（PET）与计算机断层扫描（CT）的配准准确，图像分析软件中的脑图谱工具即可提供可重复且可靠的结果。通过使用半自动化的三维脑图谱并调整其以匹配每只小鼠的颅骨形状，可在不同动物之间实现一致的感兴趣区域（ROI）。由于目前尚无自动化或半自动化方法用于分析脊髓中的信号，因此必须手动绘制感兴趣区域。值得注意的是，在定量CD19+ B细胞（或任何同时存在于骨髓和脊髓中的细胞类型）时，必须尽可能消除来自脊柱和骨髓的信号。其原因是，已知正常小鼠骨髓中的CD19+ B细胞数量多于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠，因为在EAE模型中，B细胞会离开外周进入中枢神经系统5,11。这种骨髓信号可能掩盖脊髓中的真实信号。
为了在最小化脊柱和骨髓信号干扰的同时明确脊髓的真实信号，可对CT图像进行大津阈值分割，以创建脊柱的固定感兴趣区域（ROI）。随后可在脊柱内部轻松绘制独立的脊髓ROI。该技术也可用于测量股骨中的骨髓。此方法对于研究示踪剂在脊髓中的结合情况具有重要价值。然而，由于PET的空间分辨率相对较低，且在扫描小鼠较小解剖区域时存在部分容积效应等问题，需结合其他方法使用。 离体 验证性技术（如γ计数、放射自显影）能够验证放射性示踪剂在脊髓中的结合，且不受血液、脑脊液或脊柱信号溢出的干扰。
在EAE小鼠中，颈段/胸段脊髓内的信号强弱通常取决于疾病的严重程度以及适应性免疫反应期间浸润的B细胞数量。由于浸润的B细胞数量存在差异，且与正常小鼠骨盆/脊柱骨髓中的B细胞相比，中枢神经系统（CNS）中的B细胞数量较少，因此在小鼠中对脊髓组织进行体内定量具有挑战性。鉴于小动物成像中PET的空间分辨率有限，骨髓的信号可能会溢出至脊髓信号区域。本研究中完成的离体生物分布分析和自显影技术有助于区分并验证椎体与脊髓组织中的PET信号。在解剖前对小鼠进行灌注，以清除血液池中未结合的示踪剂，从而确保γ计数和自显影结果反映的是实际结合于各器官内的示踪剂，而非滞留在该器官血液池中的示踪剂。
放射性示踪剂通过血液在体内循环，特别是使用抗体示踪剂时，初始注射后血液中通常会有未结合的放射性示踪剂持续存在数周。由于我们成像的目标是含有大量血管的脑和脊髓，因此有必要明确信号中有多少真正来源于示踪剂在目标脑组织或组织中的结合，而有多少来自血池中的信号。因此，需要将脑部信号除以心脏/血池信号。在临床环境中，可采用相同的图像分析技术，如对椎骨进行Otsu阈值分割以及对脊髓组织划定感兴趣区域（ROI），以实现定量分析。鉴于人类组织体积较小鼠显著更大，部分容积效应的影响应明显减小，从而提高定量准确性，并避免需要通过ex vivo技术来验证in vivo的结果。在临床中使用正电子发射断层扫描（PET）将使临床医生能够根据每位患者的B细胞负荷情况个性化制定治疗方案。
ARG 特别适用于获取高分辨率图像，从而更准确地界定示踪剂结合在脑干和小脑等小区域中的空间位置。相同的切片和/或相邻切片可保存下来用于免疫组织化学染色，以确认 B 细胞的存在。我们此前曾使用 CD45R/B220 对中枢神经系统组织进行染色（补充图 S1），以将 B 细胞数量与 PET 和 ARG 信号进行关联5,9。随后可将染色结果与 ARG 结果进行空间上的比较，以验证放射性示踪剂信号是否与染色模式一致。B 细胞可在脑干中呈簇状或弥散性分布；PET 的灵敏度足够高，能够检测到该信号，这对临床转化具有积极意义。对于脊髓 ARG 检测，将脊髓从椎骨中取出可确保所测得的信号来源于脊髓组织中的示踪剂结合，而非骨髓和/或血液，后者可能由于部分容积效应而掩盖 PET 图像。
与ARG类似， 离体 γ计数可实现对单个器官中放射性信号的定量。采用该技术时，需测量组织的湿重，并确保组织位于相应离心管底部，再将离心管放入γ计数器中。离心管必须标记小鼠编号和组织类型，以确保使用正确的样品管；随后将管子置于校准过的天平上称重，器官质量需精确至0.0001 mg（即0.1 μg）。某些组织体积极小，加样前后管子质量的差异可能仅为0.0001 mg量级。组织应在解剖后立即称重，以防止水分流失导致质量偏低。称重后，脑和脊髓样品管应加入PBS填充，以防止在冷冻用于放射自显影（ARG）前发生干燥。

多发性硬化症是一种免疫介导的神经系统疾病；每位患者的临床表现具有独特性，这给患者和临床医生的管理带来了挑战1该疾病本身的特征是脑和脊髓中出现脱髓鞘病灶及免疫细胞浸润，导致身体功能和认知能力受损2. 多发性硬化是一种T细胞介导疾病的传统范式，首次在一项利妥昔单抗的II期关键性临床试验中受到挑战3，一种靶向CD20的疗法+ B细胞亚群。此后又开发出更多靶向CD19的B细胞疗法4，一种在更广泛范围的B细胞上表达的泛B细胞生物标志物，在诊断和治疗上均具有优势。此外，现有的评估治疗效果的方法（即监测复发次数和磁共振成像[MRI]活动性）无法提供早期疗效反应指标，从而使患者因治疗方案选择和优化不足而面临中枢神经系统损伤的重大风险。因此，迫切需要开发能够监测特定免疫细胞（如CD19）的策略+ B细胞在多发性硬化症患者中枢神经系统和外周的实时动态。
PET成像是一种强大的成像技术，能够 体内 特定目标（如CD19）的全身体内可视化，以及血液采样、复发率记录和病灶监测 通过 MRI可提供治疗效果的快照，而PET成像则使研究人员和临床医生能够监测疗法在整个身体范围内的有效性。这种主动式的治疗监测方法使临床医生能够实时评估药物疗效，并根据需要迅速调整治疗方案。通过监测与疾病相关的细胞群体的位置和密度，还可利用患者特异性的解剖信息进行疾病严重程度的纵向评估。因此，建立可重复的分析方法，以在临床和临床前环境中可靠地发挥PET成像的全部潜力，显得至关重要。
本文描述了方法（图1进行 PET 成像， 离体 γ计数和CD19的放射自显影（ARG）+ B细胞与一种 64铜标记的抗人CD19单克隆抗体（mAb），称为16C4-TM（64Cu-hCD19-mAb) 在表达人源 CD19（hCD19）的转基因小鼠中，利用人重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 1-125（MOG）诱导的多发性硬化实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中的应用1-125我们还提供了在脑和脊髓中准确且可重复地评估放射性示踪剂结合的方法，这两个部位是疾病发病机制的关键区域，在此及其他神经退行性疾病模型中常受到严重影响。这些技术可实现对B细胞在疾病病理过程中作用的无创性研究，并具有临床转化潜力，可用于评估多发性硬化症中抗B细胞疗法的疗效。

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 50 kDa MWCO 离心过滤器</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>离心过滤器</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;64&lt;/sup&gt;Cu-CuCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>圣路易斯华盛顿大学；威斯康星大学麦迪逊分校；或其他供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 放射性薄层扫描成像仪</td><td>Eckert &amp;amp; Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td>自显影暗盒</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>铝制，8&quot; × 10&quot;</td></tr><tr><td>自显影胶片</td><td>&amp;nbsp;GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>储存式磷屏 BAS-IP SR 2025 E 超高分辨率，20 × 25 cm，仅屏幕</td></tr><tr><td>蝶翼针导管</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-酯</td><td>Macrocyclics</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE 诱导试剂盒</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>盖革计数器</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET/CT 扫描仪</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex 自动γ计数器</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>&amp;nbsp;00H-2146-K0</td><td>5 &amp;mu;m SEC-s3000 400 &amp;Aring;，300 × 7.8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 柱</td><td>Cytiva</td><td>17085301</td><td>DNA 重力柱</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG 分析软件</td></tr><tr><td>低蛋白吸附收集管（1.5 mL）</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>840281400</td><td>紫外-可见微/纳升分光光度计</td></tr><tr><td>PCR 管，0.2 mL，DNA 级</td><td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 磷光成像仪 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>Version 4 Patch 3</td><td>PET 分析软件；需购买脑图谱附加模块</td></tr><tr><td>Zeba 脱盐离心柱，7K MWCO，0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>脱盐柱</td></tr></tbody></table>

使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 cd19+ b 细胞

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

多发性硬化症（MS）是影响青壮年人群最常见的中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病，随着病情进展，常导致神经功能缺损和残疾。B淋巴细胞在MS的病理过程中发挥复杂而关键的作用，并已成为多项处于临床试验阶段治疗手段的靶点。目前尚无准确方法用于为特定抗B细胞疗法筛选适宜患者，也无法无创地量化这些治疗对中枢神经系统及外周器官中B细胞负荷的影响。正电子发射断层扫描（PET）成像技术具有巨大潜力，可提供关于 体内 活体受试者中B细胞的空间-时间分布与负荷
本文报道了针对人CD19的PET示踪剂的合成与应用方法+ 在已建立的由B细胞驱动的多发性硬化症（MS）小鼠模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，该模型通过使用人重组髓鞘少突胶质细胞糖蛋白1-125（human recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein 1-125）诱导产生。本文所述为检测和定量CD19的优化技术+ 使用B细胞研究脑和脊髓 体内 PET成像。此外，本文还报道了简化的实验方法 离体 对疾病相关器官（包括骨髓、脊髓和脾脏）进行γ计数，以及对中枢神经系统组织中CD19示踪剂结合进行高分辨率放射自显影。

hCD19-mAb 经 DOTA 偶联并用放射性同位素标记 64Cu 如图所示 图2. EAE 小鼠与正常小鼠接受 PET/CT 扫描（图3注射后 18-24 小时 64Cu-DOTA-hCD19-mAb。采用PET分析软件对PET/CT图像进行配准，并通过手动勾画感兴趣区域（ROI）或半自动三维脑图谱分析中枢神经系统组织。感兴趣区域中放射性示踪剂的结合（ROI内放射性摄取）图4) 在EAE小鼠中高于在正常小鼠中。 离体 γ计数和自显影技术显示，与正常小鼠相比，EAE小鼠的脊髓（包括腰段和颈胸段）和脑部（仅自显影技术）结合信号增强图5 和 图6). 离体 灌注小鼠的γ计数也显示外周器官（包括脾脏、股骨和骨髓）中放射性示踪剂结合减少（图5)，与该EAE模型中B细胞离开外周并浸润中枢神经系统的表现一致。
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg" /> 
图2：生成偶联及放射性标记的方案 64铜标记的人源特异性CD19单克隆抗体，16C4-TM mAb（64Cu-DOTA-hCD19-mAb），以及质量控制数据。 (ADOTA-NHS-酯与hCD19单克隆抗体反应生成hCD19-DOTA偶联物（比例非按实际）及放射性标记 64Cu-CuCl3 以生成 64Cu-DOTA-hCD19-单克隆抗体&#160;(B) 代表性ITLC色谱图。40-60 cm处的峰为放射性标记抗体；未结合的 64Cu-CuCl3 随流动相移动，并在200至240 cm范围内存在。未检测到游离的 64Cu-CuCl3 在此色谱图中。C) 放射性标记抗体的质量控制规格。缩写：DOTA-NHS 酯 = 1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单酯N-羟基琥珀酰亚胺酯；ITLC/HPLC = 瞬时薄层色谱/高效液相色谱；MALDI/LC-MS = 基质辅助激光解吸/电离-液相色谱-质谱；CPM = 每分钟计数 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg" /> 
图3：照片展示如何将小鼠固定在PET扫描仪内的3D打印床中，以实现高质量的脊髓和脑部成像，同时最大限度减少运动。（A）3D打印的四只小鼠用扫描床（也称为“小鼠旅馆”），配备加热元件和麻醉导管。（B）处于仰卧位的麻醉小鼠，以最大化脊柱的平直度；每只小鼠在床内的位置均被记录。（C）用胶带将小鼠头部牢固固定，以减少脑部运动，同时在腹部固定以减少呼吸引起的运动，但不影响正常呼吸。（D）将小鼠床置于扫描仪内，并用胶带固定于扫描床上。从扫描仪连接麻醉导管至小鼠床，并将异氟烷浓度设定为2%。在关闭扫描仪门之前，监测小鼠呼吸，以确保异氟烷浓度适当。缩写：PET = 正电子发射断层扫描。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg" /> 
图4：使用PET分析软件进行脊髓成像、脑部分析及结果处理。 (A) i) 在脊柱上绘制感兴趣区域（粉红色和棕褐色），以区分腰椎与胸椎和颈椎，并为Otsu阈值分割准备图像。 ii) 使用Otsu阈值法对脊椎骨（青绿色和红色）进行了分割。 iii) 然后在 3D ROI 菜单中将椎骨设为不可变，并将脊髓划分为颈段/胸段（紫色）和腰段（深蓝色）ROI。 iv) 去除椎体ROI，保留脊髓ROI并应用代表性脑图谱。B) 以每只动物心脏 ROI 标准化的 %ID/g 表示的 CNS 不同区域 PET 结果的代表性分析。PET 采集采用 10 分钟静态扫描 通过 PET/CT成像。使用半自动脑图谱方法定量的脑区，如图中所示 A. iv) 代表性结果表明，示踪剂在脑部和胸段脊髓中的结合显著增加或呈显著上升趋势。统计学分析采用 Student's t-检验（*：p &#60; 0.0332）。缩写：PET = 正电子发射断层扫描；ROIs = 感兴趣区域；CNS = 中枢神经系统；CT = 计算机断层扫描；%ID/g = 每克组织摄取的注射剂量百分比；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg" /> 
图5：代表性定量分析结果 离体 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠和正常小鼠各器官中的γ计数，以%ID/g表示。 PET 扫描后，用 PBS 灌注小鼠以清除血液中游离或与血液中 CD19 结合的放射性示踪剂+ B细胞，迅速解剖并称重各器官以获得准确重量。与对照小鼠相比，EAE小鼠脾脏和骨髓中的示踪剂结合显著减少。EAE小鼠腰段及颈胸段脊髓均观察到放射性示踪剂结合增加。脑组织未显示放射性示踪信号显著升高，但呈接近显著性增加的趋势。统计学分析采用Student's t-检验（*：p &#60; 0.0332；****：p &#60; 0.0001）。缩写：PET = 正电子发射断层扫描；%ID/g = 每克组织摄取的注射剂量百分比；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎；PBS = 磷酸盐缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg" /> 
图6：离体 自显影图像显示，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠与正常对照小鼠相比，64Cu-DOTA-hCD19-mAb 在脑部矢状切片和完整脊髓中的结合情况。 数字化磷屏存储膜在暴露于放射性组织样本约10个半衰期（127小时或5天）后，使用磷屏成像仪进行扫描。结果图像显示，EAE小鼠脑部的信号明显高于正常小鼠脑切片，这与该模型中已知含有B细胞的区域相符5。具体而言，EAE小鼠脑切片的脑干、小脑和脑室区域显示出更高的示踪剂信号。EAE小鼠脑切片中信号的增强与上述全脑PET定量结果一致。同样地，与正常脊髓相比，EAE小鼠的颈段/胸段以及腰段脊髓均显示出放射性示踪剂结合增加，这与离体 γ计数结果相吻合。缩写：PET = 正电子发射断层扫描；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎；Vent = 脑室；Cb = 小脑；BS = 脑干；TSc = 胸段与颈段脊髓合并；LSc = 腰段脊髓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图 S1：使用 CD45R/B220 对正常小鼠和 EAE 小鼠脑组织的中枢神经系统组织进行染色。 在 EAE 小鼠中可观察到脑干、脑膜和白质中的 B 细胞（n = 7 只 EAE 小鼠，n = 5 只正常小鼠，每只动物平均四张切片）。该图来自5。比例尺 = 5 mm（矢状面脑图像，低倍镜 [1x]），100 µm（脑干、脑膜和小脑白质，高倍镜 [20x]）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl Fig 1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文详细介绍了对一种人源特异性抗CD19单克隆抗体进行放射性标记的方法，以及如何利用该标记抗体在多发性硬化小鼠模型中定量中枢神经系统及外周组织中的B细胞 体内 PET成像， 离体 γ计数和放射自显影方法。

使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19+ B 细胞

多发性硬化症（MS）是影响青壮年的最常见中枢神经系统（CNS）脱髓鞘疾病，常导致神经功能障碍……

该技术利用PET成像来阐明B细胞在中枢神经系统内的体内分布与动态变化。我们的方法在研究神经系统疾病时具有优势，因为在这些疾病中，受累的脊髓使得分析更加困难。因此，本技术具有几项主要优势。首先，我们开发了一种新的工具，用于追踪泛B细胞生物标志物，从而能够捕获多种B细胞亚群并在体内对其进行可视化。其次，我们的脊髓分析方法能够在此区域内对PET信号进行高度准确且可重复的定量分析。该技术的最大优势在于其不依赖于特定疾病类型。在任何关注B细胞和/或脊髓的场景中，均可将其用于从临床前到临床的PET成像。将抗体注射至小鼠体内并进行放射性标记后18至24小时，通过在小鼠眼睛上涂抹眼用凝胶，为其扫描做好准备。确保四只小鼠用的扫描床配备有加热垫，并将异氟烷浓度设定在1.5%至2%之间。将小鼠仰卧位放置于扫描床上，并轻轻牵拉小鼠尾巴以伸直脊柱。将小鼠置于仰卧位后，使用柔软的显微镜胶带将其头部和腹部固定，以尽量减少呼吸运动。在实验记录本中记录每只小鼠的扫描位置。固定第一组小鼠后，关闭床板，并通过执行一次CT扫描来检查床板的位置。单击 CT 中心视野，当检查床到位后，运行 CT 试扫描以确认位置是否正确。重复上述步骤直至检查床位置满意为止。在扫描床适当位置贴一小块白色胶带，以标记后续研究中正确的床位放置位置。打开运动控制器菜单，点击“PET中心视野”将小鼠移入PET环内。当床体进入PET环后，点击“运行”启动扫描程序，等待扫描仪自动完成PET扫描，并从PET环移动至CT进行CT图像采集。由于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠因疾病进展导致脊柱明显弯曲，仰卧位扫描有助于拉直脊柱。在动物背部侧面做一切口，去除皮肤和毛发以暴露脊柱。在颈部、肋骨下方以及骨盆顶部的三个横断面处切开脊柱，将腰段与颈段和胸段分离。小心移除分段的脊柱，得到两部分：腰段和颈胸段。然后，从骨盆端开始小心修剪脊柱，分离腰段脊柱，直至腰段脊髓可见。为取出腰段脊髓，使用一支装有PBS的带滑动接头注射器，用拇指和食指在注射器与脊柱之间形成密封，轻柔推动注射器中的PBS，将脊髓冲出并置于吸水垫上。对于颈段和胸段脊髓，将注射器从颈椎端插入，重复上述操作。将脊髓组织放入γ计数管中。记录干重，并加入PBS以确保组织位于管底，避免干燥。将试管置于冰上，待测定时使用。要开始分析脊髓中的感兴趣区域，请从导航菜单中打开 3D 感兴趣区域工具。在“感兴趣区域”标题下，使用菜单底部的加号创建六个感兴趣区域：腰段感兴趣区域、颈胸段感兴趣区域、腰段骨骼、胸段骨骼、腰段脊髓、胸段脊髓。为避免 PET 信号造成视觉干扰，请单击 F3 关闭 PET。转到 3D 感兴趣区域工具操作界面的顶部，单击光标符号右侧的实心圆点，以打开 3D 绘画模式以及膨胀/腐蚀菜单。选择“球形”，并将大小更改为 20 像素。同样，将膨胀值设置为加五。在继续操作之前，请转到菜单底部，确保已选中感兴趣的腰椎区域。在CT图像上找到脊柱的L6椎体。从L6上方的一个椎体开始，在髋部上方的五个椎体范围内绘制一个大致的腰椎感兴趣区域。然后切换到颈胸段感兴趣区域，追踪脊柱其余部分至颅底。绘制完大致的感兴趣区域后，转至操作界面顶部，选择“分割算法”菜单。在下拉菜单中选择“大津阈值法”，然后选择输入的腰椎感兴趣区域，并确保在菜单底部选中腰椎骨骼。在“图像”旁边的下拉菜单中，确保已选择 CT 扫描图像，此处以数字零表示。单击“应用”，然后对颈椎-胸椎感兴趣区域和胸段骨骼重复此操作。使用 Otsu 阈值法生成骨骼感兴趣区域后，返回导航菜单，删除该感兴趣区域，或在粗略腰椎和颈椎-胸椎两个感兴趣区域的 H 列中勾选复选框以隐藏它们。勾选两个目标骨骼区域的 I 列，以防止其被编辑。最后，返回到 3D 感兴趣区域工具操作界面的顶部，进入 3D 绘图菜单，绘制脊髓感兴趣区域。再次选择球体工具，在骨骼内部追踪腰段和胸段的脊髓，确保在菜单底部选择了正确的感兴趣区域。若要擦除任何感兴趣区域，请按住 Command/Control 键并在需要擦除的区域上绘制。从三个平面检查脊髓感兴趣区域，确保没有感兴趣区域绘制在脊柱外部。如果 PET 信号已关闭，请在绘制完脊髓感兴趣区域后按 F3 键以重新打开 PET，或选择视觉控制器，然后单击 PET 栏。返回导航菜单。点击网格图标以显示表格。将表格复制到电子表格软件中，并保存文件。PET成像显示，与对照小鼠相比，EAE小鼠脑部和胸段脊髓的放射性示踪剂结合增加。离体γ计数显示，EAE小鼠腰段和颈胸段脊髓以及脑组织的示踪剂结合均较对照小鼠升高。离体自显影图像显示，与对照小鼠相比，EAE小鼠矢状位脑切片中脑干、小脑和脑室区域的放射性示踪剂结合增加。同样，在EAE小鼠的颈胸段和腰段脊髓中，与正常脊髓相比，观察到放射性示踪剂结合增加。在完成PET成像和γ计数后，我们可通过流式细胞术和免疫组织化学等分子生物学技术，进一步研究PET信号与目标分子之间的关系。本技术为研究人员探索B细胞在多种疾病领域（包括脑卒中、多发性硬化症、其他自身免疫性疾病以及癌症）中的体内作用提供了新的途径。

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使用正电子发射断层扫描对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中的 CD19+ B 细胞进行成像

该视频展示了通过注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白与灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium...

小鼠模型中实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

本视频演示了通过注射髓鞘来源的多肽并联合佐剂以激活自身反应性T细胞来诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的方法。这些T细胞会迁移至脑部。同时给予百日咳毒素以增加血脑屏障的通透性，使这些T细胞及其他免疫细胞得以进入脑组织。这些免疫细胞引发脱髓鞘，导致神经传导受损，从而诱发EAE。...

在本视频中，采用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）建立小鼠多发性硬化模型。将含有神经元肽和佐剂的乳剂注射至小鼠体内，引发免疫反应，激活自身反应性T细胞。随后注射百日咳毒素（PTX）以增加血脑屏障通透性，使自身反应性T细胞得以浸润脑组织。此类浸润启动信号级联反应，最终导致髓鞘损伤，模拟多发性硬化症的脱髓鞘病变状态。...

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

小鼠多发性硬化EAE模型中视神经炎和脑部炎症的生物发光与近红外成像

本文介绍了在体内实验性自身免疫性脑脊髓炎过程中研究神经血管单元功能障碍的实验方案。我们重点阐述了如何测定血脑屏障通透性以及与白细胞穿越胶质界膜相关的明胶酶活性。...

在体内可视化实验性自身免疫性脑脊髓炎期间神经血管单元内皮和胶质屏障的损伤

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

用于在多发性硬化症溶血卵磷脂大鼠模型中 体内 测量髓鞘含量的正电子发射断层扫描成像

本方案描述了非侵入性追踪经基因工程改造以表达嵌合抗原受体的T细胞的方法学 体内...

动态成像嵌合抗原受体T细胞与[18F]四氟硼酸盐正电子发射断层扫描/计算机断层扫描

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

学习使用正电子发射断层扫描技术对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中的CD19阳性B细胞进行活体成像，实现中枢神经系统B细胞分布与动态变化的高精度定量分析。

使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19⁺ B 细胞

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