使用正电子发射断层扫描在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中成像 CD19⁺ B 细胞

该技术利用PET成像来阐明B细胞在中枢神经系统内的体内分布与动态变化。我们的方法在研究神经系统疾病时具有优势，因为在这些疾病中，受累的脊髓使得分析更加困难。因此，本技术具有几项主要优势。

首先，我们开发了一种新的工具，用于追踪泛B细胞生物标志物，从而能够捕获多种B细胞亚群并在体内对其进行可视化。其次，我们的脊髓分析方法能够在此区域内对PET信号进行高度准确且可重复的定量分析。该技术的最大优势在于其不依赖于特定疾病类型。

在任何关注B细胞和/或脊髓的场景中，均可将其用于从临床前到临床的PET成像。将抗体注射至小鼠体内并进行放射性标记后18至24小时，通过在小鼠眼睛上涂抹眼用凝胶，为其扫描做好准备。确保四只小鼠用的扫描床配备有加热垫，并将异氟烷浓度设定在1.5%至2%之间。将小鼠仰卧位放置于扫描床上，并轻轻牵拉小鼠尾巴以伸直脊柱。

将小鼠置于仰卧位后，使用柔软的显微镜胶带将其头部和腹部固定，以尽量减少呼吸运动。在实验记录本中记录每只小鼠的扫描位置。固定第一组小鼠后，关闭床板，并通过执行一次CT扫描来检查床板的位置。

单击 CT 中心视野，当检查床到位后，运行 CT 试扫描以确认位置是否正确。重复上述步骤直至检查床位置满意为止。在扫描床适当位置贴一小块白色胶带，以标记后续研究中正确的床位放置位置。

打开运动控制器菜单，点击“PET中心视野”将小鼠移入PET环内。当床体进入PET环后，点击“运行”启动扫描程序，等待扫描仪自动完成PET扫描，并从PET环移动至CT进行CT图像采集。由于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠因疾病进展导致脊柱明显弯曲，仰卧位扫描有助于拉直脊柱。

在动物背部侧面做一切口，去除皮肤和毛发以暴露脊柱。在颈部、肋骨下方以及骨盆顶部的三个横断面处切开脊柱，将腰段与颈段和胸段分离。小心移除分段的脊柱，得到两部分：腰段和颈胸段。

然后，从骨盆端开始小心修剪脊柱，分离腰段脊柱，直至腰段脊髓可见。为取出腰段脊髓，使用一支装有PBS的带滑动接头注射器，用拇指和食指在注射器与脊柱之间形成密封，轻柔推动注射器中的PBS，将脊髓冲出并置于吸水垫上。对于颈段和胸段脊髓，将注射器从颈椎端插入，重复上述操作。

将脊髓组织放入γ计数管中。记录干重，并加入PBS以确保组织位于管底，避免干燥。将试管置于冰上，待测定时使用。

要开始分析脊髓中的感兴趣区域，请从导航菜单中打开 3D 感兴趣区域工具。在“感兴趣区域”标题下，使用菜单底部的加号创建六个感兴趣区域：腰段感兴趣区域、颈胸段感兴趣区域、腰段骨骼、胸段骨骼、腰段脊髓、胸段脊髓。为避免 PET 信号造成视觉干扰，请单击 F3 关闭 PET。

转到 3D 感兴趣区域工具操作界面的顶部，单击光标符号右侧的实心圆点，以打开 3D 绘画模式以及膨胀/腐蚀菜单。选择“球形”，并将大小更改为 20 像素。同样，将膨胀值设置为加五。

在继续操作之前，请转到菜单底部，确保已选中感兴趣的腰椎区域。在CT图像上找到脊柱的L6椎体。从L6上方的一个椎体开始，在髋部上方的五个椎体范围内绘制一个大致的腰椎感兴趣区域。

然后切换到颈胸段感兴趣区域，追踪脊柱其余部分至颅底。绘制完大致的感兴趣区域后，转至操作界面顶部，选择“分割算法”菜单。在下拉菜单中选择“大津阈值法”，然后选择输入的腰椎感兴趣区域，并确保在菜单底部选中腰椎骨骼。

在“图像”旁边的下拉菜单中，确保已选择 CT 扫描图像，此处以数字零表示。单击“应用”，然后对颈椎-胸椎感兴趣区域和胸段骨骼重复此操作。使用 Otsu 阈值法生成骨骼感兴趣区域后，返回导航菜单，删除该感兴趣区域，或在粗略腰椎和颈椎-胸椎两个感兴趣区域的 H 列中勾选复选框以隐藏它们。

勾选两个目标骨骼区域的 I 列，以防止其被编辑。最后，返回到 3D 感兴趣区域工具操作界面的顶部，进入 3D 绘图菜单，绘制脊髓感兴趣区域。再次选择球体工具，在骨骼内部追踪腰段和胸段的脊髓，确保在菜单底部选择了正确的感兴趣区域。

若要擦除任何感兴趣区域，请按住 Command/Control 键并在需要擦除的区域上绘制。从三个平面检查脊髓感兴趣区域，确保没有感兴趣区域绘制在脊柱外部。如果 PET 信号已关闭，请在绘制完脊髓感兴趣区域后按 F3 键以重新打开 PET，或选择视觉控制器，然后单击 PET 栏。

返回导航菜单。点击网格图标以显示表格。将表格复制到电子表格软件中，并保存文件。

PET成像显示，与对照小鼠相比，EAE小鼠脑部和胸段脊髓的放射性示踪剂结合增加。离体γ计数显示，EAE小鼠腰段和颈胸段脊髓以及脑组织的示踪剂结合均较对照小鼠升高。离体自显影图像显示，与对照小鼠相比，EAE小鼠矢状位脑切片中脑干、小脑和脑室区域的放射性示踪剂结合增加。

同样，在EAE小鼠的颈胸段和腰段脊髓中，与正常脊髓相比，观察到放射性示踪剂结合增加。在完成PET成像和γ计数后，我们可通过流式细胞术和免疫组织化学等分子生物学技术，进一步研究PET信号与目标分子之间的关系。本技术为研究人员探索B细胞在多种疾病领域（包括脑卒中、多发性硬化症、其他自身免疫性疾病以及癌症）中的体内作用提供了新的途径。