培养的人间充质干细胞细胞外囊泡的分离、表征和治疗应用
2022年9月23日
本协议描述了用于从培养的人MSC中分离和表征代表性EV（外泌体和微囊泡）的差异离心。本文还解释了这些电动汽车的进一步应用。
该程序解决了对简单可靠的间充质干细胞衍生的细胞外囊泡收集的需求，以及在研究翻译中的应用。通过差速离心收集细胞外囊泡简单、易于扩展且可重现，这将对该领域有用。细胞外囊泡不明显}从模糊不清}间充质干细胞是模糊不清}在现代疾病治疗中的应用。
我不会害怕错误。此操作简单易学。这个简单的程序中有许多细节可以通过视频更好地呈现。
首先，将间充质干细胞培养至90%以上汇合。用 8 mL 补充的 α-MEM 替换每个培养皿中的培养基。培养48小时后，细胞必须均匀生长，以将培养基完全收集到50 mL离心管中。
然后，将培养基在4摄氏度下以800×g离心10分钟。将上清液转移到 1.5 mL 锥形管中以去除细胞碎片和细胞碎片。将上清液在16， 000×g下在4摄氏度下离心30分钟。
使用移液器将悬浮液转移到超速离心管中。然后，在4摄氏度下以150， 000×g离心两小时。将微泡沉淀重悬于每皿 50 uL PBS 中。
弃去上清液并收集残留物，即外泌体。将七个细胞培养皿中的外泌体重悬于50uL的PBS中。在 15 mL 管中，在 1， 499 uL PBS 中稀释 1 uL 细胞外囊泡并混合。
然后，启动跟踪分析器的兼容软件。用蒸馏水填充样品池，然后让仪器开始检查样品池。用准备好的标准溶液校准仪器。
确保软件检测界面显示的颗粒数在 50 到 400 之间，最好在 200 左右，然后单击确定。接下来，用 5 mL 蒸馏水冲洗样品池。样品分析前，用 1 mL 蒸馏水冲洗通道。
确保软件检测界面显示的颗粒数小于10。在 1.5 mL 锥形管中，用 250 uL PBS 重悬细胞外囊泡。在另一个 1.5 mL 锥形管中，制备 PKH26 染料的工作溶液。
将重悬的细胞外囊泡与工作溶液混合。让它在室温下静置五分钟，然后加入 500 uL 耗尽 EV 的 FBS 以停止反应。对于微囊泡，在4摄氏度下以16， 000×g离心30分钟。
弃去上清液。加入 1 mL PBS 冲洗残留物。再次离心，弃去上清液以除去未结合的染料。
对于微囊泡，在4摄氏度下以16， 000×g离心30分钟。用 200 uL PBS 重悬残留物。将20uL悬浮液滴在载玻片上，并在荧光显微镜下观察。
将细胞外囊泡重悬于200uL的PBS中，然后以10:1的体积比与肝素溶液混合。将鼠标放入尾静脉成像系统。按下开关提起拉杆。
在尾静脉插画师的帮助下，通过尾静脉系统地注射细胞外囊泡悬浮液。使用NTA对粒径分布的分析表明，来自人间充质干细胞的外泌体大小范围为40至335 nm，峰尺寸约为100 nm。此外，微囊泡的大小范围为50至445nm，峰尺寸为150nm。
外泌体的形态学特征表明它们表现出典型的杯形。通过PKH26有效地标记细胞外囊泡，通过大体视图观察到标记的沉淀以及荧光显微镜。操作人员在收集上清液时应注意，因为必须均匀吹动细胞才能完全收集间充质干细胞中保留的释放EV。
为了验证注射的成功，可以对荧光标记的EV或植入特定组织部位的冷冻切片的生物分布进行体内成像。
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概述
本研究提出了一种详细的协议，用于从培养的人类间充质干细胞（MSCs）中分离和表征细胞外囊泡（EVs），特别是外泌体和微囊泡。该方法利用差速离心来提供一种可靠的方法来收集这些EVs，它们在疾病治疗和研究转化中具有重要的应用潜力。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞外囊泡
- 间充质干细胞
- 疾病治疗的生物应用
背景
- EVs的分离对于理解它们在细胞通信和治疗潜力中的作用至关重要。
- 当前的EV收集方法需要简单、可重复和可扩展。
- 本协议旨在满足这些需求，同时增强研究适用性。
使用的方法
- 用于EV分离的差速离心
- 人类间充质干细胞作为生物系统
- 用于EV表征和分析的荧光显微镜
主要结果
- 成功分离了具有明确大小范围的外泌体和微囊泡：外泌体（40-335 nm，峰值在100 nm）和微囊泡（50-445 nm，峰值在150 nm）。
- 在显微镜下表现出典型的杯状形态。
- 使用PKH26染料对EV进行有效标记，用于跟踪和分析。
结论
- 该研究有效地展示了一种从MSCs收集EV的可重复方法。
- 强调了该方法在细胞通信和治疗应用中推进EV研究的实用性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of extracellular vesicles (EVs) from human mesenchymal stem cells (MSCs) addresses a critical need for scalable, reproducible tools in early-stage biopharma R&D. This protocol enables standardized EV preparation, supporting translational research and facilitating the development of EV-based therapeutics. The approach enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of MSC-derived EVs as functional mediators in disease-relevant pathways.
- Supports biological de-risking by providing well-characterized vesicle populations for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in target validation through quantitative EV characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized EV samples for downstream labeling, imaging, and functional assays.
- Improves assay reproducibility and scalability by using defined isolation and quantification steps.
- Enables reliable compound or intervention evaluation in EV-modulated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV isolation with translational workflows for local transplantation and systemic injection studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling in vivo biodistribution and tissue targeting analysis.
- Provides a platform for risk-adjusted advancement of EV-based therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized EV isolation, quantitative characterization, and downstream application in both in vitro and in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification using MSC-EVs as functional probes.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable EV preparations for assay development and screening readiness.
- Analytics: Provides particle size distribution and fluorescence-based tracking for comparative analysis.
- Translational Research: Enables biodistribution and tissue targeting studies to inform preclinical development.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable protocol for repeated use across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable EV isolation and characterization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early pipeline stages.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-based therapeutic and biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, differential centrifugation, and nanoparticle tracking analysis.
- Needs access to ultracentrifugation and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible EV isolation and quantification.
- Adaptable to various MSC sources and downstream model systems.
- Careful handling during supernatant collection is critical for optimal EV yield and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:04
Differential Centrifugation for Isolation of Exosomes and Microvesicles
2:25
Detection of Particle Numbers and Size Distribution of Extracellular Vesicles
3:29
Labeling of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells
4:50
Systemic Injection of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells
5:24
Results: Characterization of Extracellular Vesicles Derived from Mesenchymal Stem Cells
6:19
Conclusion
