从培养的人源间充质干细胞中分离、表征及治疗性应用细胞外囊泡

该方案满足了间充质干细胞来源的细胞外囊泡简单、可靠收集及其在科研转化中应用的需求。通过差速离心法收集细胞外囊泡操作简便、易于放大且可重复，将对相关领域具有重要价值。来源于间充质干细胞的细胞外囊泡在现代疾病治疗中具有广阔的应用前景。

我不会害怕犯错。这个操作简单易学。这个简单程序中的许多细节都可以通过视频更清晰地展示出来。

首先，将间充质干细胞培养至融合度超过90%。每皿更换为8 mL添加补充物的α-MEM培养基。培养48小时后，细胞应均匀生长，随后将培养基完全收集至50 mL离心管中。

然后，在 4 摄氏度条件下，以 800 × g 离心培养基 10 分钟。将上清液转移至 1.5 mL 锥形管中，以去除细胞碎片和细胞残渣。在 4 摄氏度条件下，以 16,000 × g 离心上清液 30 分钟。

使用移液器将悬液转移至超速离心管中。然后在4°C条件下以150,000 × g离心2小时。每皿用50 µL PBS重悬微囊泡沉淀。

弃去上清液，收集沉淀物，即为外泌体。将来自七皿细胞的外泌体重悬于 50 µL PBS 中。在 15 mL 离心管中，取 1 µL 细胞外囊泡加入 1,499 µL PBS 中进行稀释，并混匀。

然后，启动与追踪分析仪兼容的软件。用蒸馏水填充样品池，随后让仪器开始进行样品池检测。使用已配制的标准溶液对仪器进行校准。

确保软件检测界面显示的粒子数量在50至400之间，最好接近200，然后点击确定。接下来，用5 mL蒸馏水冲洗样品池。在样品分析前，用1 mL蒸馏水冲洗通道。

确保软件检测界面显示的粒子数少于10。在1.5 mL锥形管中，用250 µL PBS重悬细胞外囊泡。在另一支1.5 mL锥形管中，配制PKH26染料的工作液。

将重悬的细胞外囊泡与工作液混合。室温下静置5分钟，然后加入500 µL去除了细胞外囊泡的胎牛血清以终止反应。对于微囊泡，于4°C、16,000 × g离心30分钟。

弃去上清液。加入 1 mL PBS 清洗沉淀物。再次离心，弃去上清液以去除未结合的染料。

对于微囊泡，于4°C条件下以16,000 × g离心30分钟。用200 µL PBS重悬沉淀物。取20 µL悬液滴加至载玻片上，在荧光显微镜下观察。

将细胞外囊泡重悬于 200 µL PBS 中，然后按 10:1 的体积比与肝素溶液混合。将小鼠放入尾静脉成像系统中。按下开关以抬起杠杆。

借助尾静脉示意图，通过尾静脉系统注射细胞外囊泡悬液。使用纳米颗粒追踪分析（NTA）对粒径分布进行分析表明，来源于人源间充质干细胞的外泌体粒径范围为40至335 nm，峰值粒径约为100 nm。此外，微囊泡的粒径范围为50至445 nm，峰值粒径为150 nm。

外泌体的形态学表征显示其具有典型的杯状结构。通过肉眼观察可见标记后的沉淀物，以及荧光显微镜观察，证明细胞外囊泡被PKH26高效标记。操作者在收集上清液时应特别注意，必须将细胞吹打均匀，以充分收集间充质干细胞中滞留的释放出的细胞外囊泡。

为了验证注射是否成功，可进行荧光标记的细胞外囊泡（EVs）的活体成像，或移植部位特定组织的冰冻切片分析，以评估其生物分布情况。