Name: 通过配对秀丽隐杆线虫中的两种化学物质来形成厌恶联想学习和记忆形成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习使用1-丙醇和盐酸对秀丽隐杆线虫进行厌恶性条件化训练，以研究短期和长期联想记忆形成的神经机制。该方法揭示了经典条件反射中的关键基因作用。

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我们感谢Takashi Murayama、Ei-ichiro Saita、Iou Ven Chang和Hitomi Ohtaki在技术方面提供的帮助以及对本文手稿的宝贵意见。菌株由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由美国国立卫生研究院（NIH）研究资源国家中心（NCRR）资助。本研究工作得到了冲绳科学技术大学院大学经费的支持。

1. 配方
<ol>
	<li>NGM 琼脂平板（步骤 2.1）
	<ol>
		<li>制备6 cm NGM平板时，将2.5 g蛋白胨、3 g NaCl和17 g琼脂溶解于850 mL双蒸水中2O (ddH₂O)2O）。用ddH₂O定容至总体积为972 mL2O.</li>
		<li>高压灭菌后，冷却至约 65 °C，加入 1 mL 溶于乙醇的 5 mg/mL 胆固醇溶液，以及各 1 mL 的 1 M CaCl₂ 和 1 M MgSO₄。2 和 1 M MgSO₄4，以及25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0）。充分混匀后，将8 mL培养基分装至直径为6 cm的培养皿中。</li>
		<li>将带盖的培养板在室温下放置于实验台上1天，然后放入塑料容器中，置于冷室中保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备LB（Luria-Bertani）培养基（步骤2.1）：将10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl溶解于1 L去离子水中2O. 用 5 N NaOH 调节 pH 至 7.0（几滴），并经高压灭菌。
	<ol>
		<li>将15 g琼脂加入LB培养基中制备LB平板。灭菌后冷却至约60 °C，每皿分装12 mL至直径为9 cm的培养皿中。将平板置于塑料容器中，存放于冷室中备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作动物收集器（步骤 2.4）：用胶水将尼龙网（30 µm 孔径）固定在透明亚克力圆管底部（长 3.5 cm，外径 3 cm，壁厚 2 mm）。</li>
	<li>配制0.25%水性明胶溶液（步骤2.4），将0.25 g明胶溶于100 mL ddH₂O中2O. 高压灭菌消毒。</li>
	<li>趋化性实验平板（步骤 5.1）
	<ol>
		<li>为进行趋化性实验配制琼脂平板，将 15 g 琼脂溶解于 993 mL ddH₂O 中2通过高压灭菌，将溶液冷却至约 65 °C。</li>
		<li>然后，加入5 mL经高压灭菌的1 M磷酸钾缓冲液（pH 6.0）和1 mL 1 M CaCl₂。2，以及&#160;1 mL 1 M MgSO₄4 加入琼脂溶液中。所有这些溶液均通过高压灭菌分别进行灭菌。</li>
		<li>将10 mL混合溶液分装至6 cm的培养皿中。将这些培养皿盖上皿盖，置于室温下静置两天，随后转移至塑料器皿内的湿润纸巾上，于室温保存备用。这些培养皿最多可使用10天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制趋化性检测缓冲液（步骤 5.4），将 5 mL 1 M 磷酸钾（pH 6.0）与 1 mL 1 M CaCl₂ 混合2, 1 mL 1 M MgSO₄4，以及 993 mL 的 ddH₂O2O. 将所有这些溶液分别通过高压灭菌进行灭菌。</li>
	<li>配制40 mL CS/US混合溶液（1%水相1-丙醇和HCl [pH 4.0]）（步骤3.1和步骤4.1），将0.4 mL纯1-丙醇和4 µL 5 M HCl（终浓度为0.1 mM）加入39.6 mL ddH₂O中2O. 将溶液置于室温保存。</li>
	<li>为了制备 ddH₂O2O，使用水净化系统将自来水处理两次（参见 材料表).</li>
	<li>制备液体培养物（OD600 约 0.7）的 大肠杆菌 使用牙签将新鲜菌落接种至10 mL LB培养基中，在37 °C下培养7–8小时以获得OP50菌液。细菌培养时间过长可能会影响诱导效果，原因可能是产生了次级代谢产物。</li>
</ol>
2. 同步化秀丽隐杆线虫（C.&#160; elegans）的制备
<ol>
	<li>采用标准方法26，在6 cm NGM平板上培养动物（步骤1.1）。通过将0.2 mL LB培养基中的大肠杆菌（E. coli）OP50液体培养物涂布于NGM平板（见步骤1.9），并在室温下孵育不超过24小时来制备NGM平板（陈旧的细菌可能影响条件化结果）。 
	注意：C. elegans的学习与记忆对机械、化学和温度刺激极为敏感。因此，强烈建议在17 °C至20 °C的室温条件下培养动物、保存所有试剂（包括水）并进行所有实验。必须避免涡旋振荡、剧烈移液和离心等物理与机械刺激。出于未知原因，1-丙醇应每三个月至少更换一次新鲜试剂。重要的是，动物必须在充足食物条件下培养，因为饥饿会严重影响条件化结果。</li>
	<li>第1天，使用铂金线虫挑取器从四块6 cm NGM平板上各挑取五只摄食充分的产卵期雌雄同体成虫（对于产卵较慢的突变体动物可适当增加数量），放置于平板上，在室温下让其产卵约3小时，以获得同步化的成年动物群体。使用铂金线虫挑取器移除亲本动物以终止产卵。 
	注意：接种后的平板应置于室温保存，以尽量减少对动物的应激。</li>
	<li>在室温下继续培养动物约5天，此时间为动物发育至成熟成虫阶段（非年轻成虫阶段）所需的时间。 
	注意：由于年轻成虫对条件化所用化学物质的敏感性高于成熟成虫（补充图1），因此培养时间应在4.5至5.5天之间根据具体条件适当调整。条件化后，年轻成虫可能表现出较低的趋化指数（C.I.）值。</li>
	<li>使用动物收集器（见步骤1.4），以1 mL 0.25%水性明胶溶液（步骤1.4）冲洗每块平板，收集约200只成年动物。该水性明胶可防止动物黏附于移液枪头等塑料器皿表面。</li>
	<li>将收集器中的动物用ddH2O（步骤1.8）清洗：在约10 mL ddH2O中极其轻柔地上下移动收集器2次，重复此过程共3次（每次均使用约10 mL ddH2O），以防止细菌污染。 
	&#8203;注意：细菌污染会严重影响动物的趋化行为。</li>
</ol>
3. 短期关联学习与记忆的大规模训练
注意：质量训练工作流程见图1。
<ol>
	<li>将装有约200只动物的收集器轻轻浸入结晶皿中40 mL的1% 1-丙醇与HCl混合液（与1-丙醇混合后pH为4.0；见步骤1.7）中约1秒。 
	注意：对于对照组动物，操作相同，但仅浸入1%的水性1-丙醇溶液中。另设一组仅用HCl（pH 4.0）处理动物作为额外对照更佳。</li>
	<li>在6孔细胞培养板的一个孔中，将收集器在10 mL ddH2O中轻轻上下浸入一次，清洗收集器中的动物。 
	注意：此清洗步骤必须非常轻柔，且仅进行一次，因为过度清洗可能影响学习行为。</li>
	<li>重复步骤3.1和3.2共10次，中间不停顿（试次间间隔[ITI]为0分钟）。 
	&#8203;注意：每次均使用新鲜的ddH2O，室温下操作。</li>
	<li>将收集器置于6 cm NGM平板上的E. coli OP50菌苔上，室温静置10分钟，使动物休息。</li>
	<li>用ddH2O清洗收集器中的动物：在约10 mL ddH2O中非常轻柔地将收集器上下移动2次，再重复此过程2次（共3次），每次使用约10 mL ddH2O，以防止细菌污染。</li>
	<li>按以下所述进行趋化性实验（步骤5）。</li>
</ol>
4. 长期关联学习与记忆的间隔训练
注意：参见图2以了解间隔训练的工作流程。
<ol>
	<li>将含有约200只动物的动物收集器轻轻浸入盛有40 mL 1% 1-丙醇与HCl混合液（与1-丙醇混合后pH为4.0；见步骤1.7）的结晶皿中，持续约1.0秒。 
	注意：仅使用1%水溶液1-丙醇作为对照组进行相同操作。另设仅用HCl（pH 4.0）处理动物的组别作为另一对照组更佳。</li>
	<li>将收集器在6孔细胞培养板的一个孔中，短暂浸入10 mL ddH2O中清洗一次，以洗涤收集器中的动物。 
	注意：此洗涤步骤必须非常短暂，过度洗涤可能影响学习过程。</li>
	<li>将收集器置于直径为6 cm的培养皿中的NGM琼脂平板上涂布的E. coli OP50菌苔上，在室温下静置10分钟，使动物休息。 
	注意：此10分钟的静息期作为ITI&#160;对动物巩固记忆以形成长期记忆（LTM）至关重要。</li>
	<li>重复步骤4.1–4.3共10次。</li>
	<li>用ddH2O清洗收集器中的动物：将收集器在约10 mL室温ddH2O中轻轻上下移动2次，随后再重复该过程2次（共3次），每次使用约10 mL ddH2O，以防止细菌污染。</li>
	<li>按以下所述进行趋化性实验（步骤5）。</li>
</ol>
5. 趋化性实验
<ol>
	<li>在6 cm塑料培养皿中制备用于趋化性实验的琼脂平板（见步骤1.5）。</li>
	<li>将动物转移至收集器（步骤 2.5）中，该收集器置于塑料培养皿盖的平坦表面上，使用剪断的移液器吸头将收集器中的动物转入含 1 mL 0.25% 水性明胶的 2 mL 微离心管中，移液器吸头需带有 &#62;1 毫米（内径）开口 
	注意：为尽量减少对动物的剪切应力，应使用切口的移液器吸头。</li>
	<li>待动物依靠重力沉降至管底约1分钟后，移除上清液（无需离心）。</li>
	<li>轻轻将动物重悬于1 mL趋化性检测缓冲液中（见步骤1.6），静置约1分钟，使其依靠重力沉降至管底（勿离心）。用移液器尽可能吸除上清液。</li>
	<li>同时，在两个位置分别斜向点样 4 µL 5% 水性 1-丙醇，并分别点样 4 µL 去离子水2以相同方式在另外两个位置进行 O，如图所示 图3A对于对1-丙醇敏感性较低的突变体的趋化性实验，可点样较高浓度的水相1-丙醇，使未经训练的突变体趋化指数（C.I.）值约为0.6，如图所示 补充表1. 
	注意：斑点操作应尽快完成。在趋化性实验中，使用5%的水溶液1-丙醇进行斑点，因为1%的水溶液1-丙醇浓度过低，不足以吸引线虫。相反，在预处理阶段应使用1%的水溶液1-丙醇，因为当线虫暴露于高于1%浓度的水溶液1-丙醇时，其趋化指数（C.I.）值会降低。</li>
	<li>在三个用于趋化性分析的平板中央，使用截断的移液器吸头（开口内径约1.0 mm），各点加6 µL含有约60只动物的动物悬液（趋化性分析缓冲液，步骤5.4）。用实验室纸巾灯芯尽可能吸除液体，注意不要触碰动物，然后盖上平板盖子。 
	注意：应尽快完成这些操作步骤。</li>
	<li>让动物在室温下于培养板上自由移动10分钟，然后将培养板转移至置于冰上的玻璃培养皿中，持续3分钟以终止趋化作用。随后将培养板保存在冰箱中，直至计数培养板上的动物数量。</li>
	<li>在体视显微镜下计数四个区域中的动物数量（中心圆内的除外），并利用所示公式计算趋化指数（C.I.） 图3B根据C.I.值计算学习指数（L.I.），即对照动物的C.I.值与条件化动物的C.I.值之间的差值（L.I. = C.I.参考文献- C.I.条件培养的). 
	注意：参照动物的 C.I. 值（C.I.参考文献) 是仅用1%水溶液1-丙醇处理的动物的C.I.值的平均值。</li>
</ol>

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<li>Gustafsson, B., Wingstrom, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+mechanisms+underlying+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Physiological mechanisms underlying long-term potentiation.</a> Trends in Neuroscience. 11 (4), 156-162 (1988).</li>
<li>Kauer, J. A., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+persistent+postsynaptic+modification+mediates+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A persistent postsynaptic modification mediates long-term potentiation in the hippocampus.</a> Neuron. 1 (10), 911-917 (1988).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

在本研究中，所有试剂均平均保持在约 18 °C 的室温条件下，动物也在室温下的实验台上培养，以避免对动物造成应激。此外，所有实验操作均在室温下进行。动物最初在 20 °C 的培养箱中培养，随后使用室温试剂在约 24 °C 的实验台上进行条件处理。在这些条件下，条件处理的结果变异较大。在较低的室温下，C. elegans 生长缓慢，需要比 20 °C 更长的培养时间才能达到成年成熟阶段，因为年轻的成年动物对用于条件处理的化学物质比成熟的成年动物更敏感，可能表现出较低的 C.I. 值。
成功诱导条件化的最关键步骤是在每次化学处理后立即用ddH2O清洗动物。因此，应通过使用切口吸头、将试剂保持在室温（RT），并在ddH2O中极其轻柔地缓慢上下移动动物收集器，以尽量减少机械和温度刺激。每次条件化处理后对动物进行彻底清洗可能会影响其学习与记忆能力。趋化性检测平板的条件也显著影响实验结果。过于干燥或过于湿润的平板会阻碍动物的顺畅运动。平板制备方法如步骤1所述；理想的平板应在点样后约5分钟内完全吸收4 µL的ddH2O或5%水溶液1-丙醇液滴。如上所述，动物的年龄对于成功诱导条件化同样至关重要。年轻成虫对机械和化学处理较为敏感，可能导致结果不稳定，而年龄过大的动物也可能不适合进行条件化处理。
1-丙醇的保质期因品牌和批次而异，在室温下通常少于3个月。当未处理动物的C.I.值变差时，建议使用新鲜的1-丙醇进行条件化和趋化性实验。
通过集中训练形成记忆不受翻译抑制剂（环己酰亚胺和放线菌酮）和转录抑制剂（放线菌素D）处理的影响，而通过间隔训练形成记忆则显著受到这些抑制剂的抑制20,21。此外，前一种记忆可被低温休克消除，而后一种记忆比前者维持时间更长，且对低温休克具有抗性。这些结果表明，前者为短期记忆（STM），后者为长期记忆（LTM）20,21。然而，通过集中训练形成的记忆可能包含短期记忆和中期（中间期）记忆，因为短期记忆对CREB转录因子的依赖性较弱（图5A）。这与短期记忆可维持超过1小时的结果一致20,21。短期记忆和长期记忆的形成均高度依赖于nmr-1，该基因仅在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的六对神经元（AVA、AVD、AVE、RIM、AVG和PVC）中表达27,28。因此，在这些神经元中，NMDA受体可能作为1%水溶液1-丙醇与盐酸（pH 4.0）信号的分子一致性检测器，介导突触可塑性，其中短期记忆和长期记忆所需的突触增强可由突触前和突触后神经元的同步放电所引发29,30,31,32,33。&#160;因此，厌恶性关联记忆可能在中间神经元之间形成。
本研究中描述的方法应适用于以1-壬醇作为条件刺激（CS）、氯化钾作为非条件刺激（US）的趋性嗅觉学习以及短期和长期关联记忆21。比较参与趋性记忆与厌恶性记忆形成的神经回路具有重要意义。

学习和记忆对于动物在不断变化的环境中有效生存和繁殖至关重要。C. elegans 是研究学习与记忆分子和细胞机制的理想模式生物，因其神经系统结构简单，且其化学和电突触连接图已通过薄切片连续电子显微图像完全重建1,2,3。
C. elegans 能够学会将培养温度与饥饿关联起来，并迁移离开其生长温度，形成持续数小时的厌恶记忆4,5。&#160;在无食物条件下用氯化钠（NaCl）对 C. elegans 进行训练，会导致其对 NaCl 的趋化性降低6,7,8。当丁酮与食物同时出现时，由于趋利性学习，线虫对丁酮的趋向性增强9,10,11。尽管这些现象被解释为联想学习与记忆10,12，但在 C. elegans 的学习与记忆范式中，联想学习与非联想性的敏感化、习惯化及适应之间的区别尚不明确13,14。事实上，经过丁酮与食物剥夺训练（厌恶训练）的动物，其丁酮感觉神经元 AWCON 与靶神经元之间的连接因来自其他神经元（包括 AIA 中间神经元）的胰岛素信号而减弱；而经过丁酮与食物共同训练（趋利性训练）的动物，则表现出 AWCON 与靶神经元之间连接的增强15。胰岛素信号通路通过核内 EGL-4 及其他转录调节因子引发基因表达的改变16,17。因此，这种厌恶性和趋利性学习与记忆分别类似于 Aplysia 鳃缩反射中突触前感觉神经元的非联想性习惯化与敏感化18,19。
通过将两种化学物质分别作为条件刺激（CS）和非条件刺激（US），我们及其他研究者已建立了用于条件化训练的实验方案 秀丽隐杆线虫 形成联想学习与记忆，而无需使用食物或饥饿作为非条件刺激20,21,22,23在本研究中，实验方案经过修改，采用1-丙醇和盐酸（HCl，pH 4.0）分别作为条件刺激（CS）和非条件刺激（US），以建立厌恶学习及短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）的动物模型。 naive 秀丽隐杆线虫 被1-丙醇吸引24 被酸排斥25当使用1-丙醇和HCl（pH 4.0）混合物进行处理时， 秀丽隐杆线虫 对1-丙醇的趋化性消失或变得非常微弱。

<table><tbody><tr><td>500 mL 烧杯</td><td>HARIO</td><td>B-500-H32</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-104-96RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TTW110RS-Q</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mL 移液器吸头</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H-111-R100NS-Q</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 塑料离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 塑料离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>As One</td><td>2-5237-04</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清移液管</td><td>As One</td><td>2-5237-06</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Aron Alpha（塑料胶水）</td><td>Toagosei</td><td>High Speed EX</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Tomy Digital Biology</td><td>SX-300</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 蛋白胨</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶式 0.2 &amp;micro;m 滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>本生灯</td><td>EISCO</td><td>SKU&amp;nbsp;CH0089A</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06730-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 突变株</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>034-03002</td><td></td></tr><tr><td>透明丙烯酸圆柱管</td><td>Asahi Kasei</td><td></td><td>3.5 cm（长度），30 mm（外径），2 mm（厚度）</td></tr><tr><td>结晶皿</td><td>Pyrex</td><td>3140-80</td><td></td></tr><tr><td>牙科喷灯</td><td>Phoenix-Dent</td><td>APT-3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28726-05</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电动移液器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>073-06295</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿（直径 10 cm）</td><td>As One&amp;nbsp;</td><td>Trade FLAT Mark</td><td></td></tr><tr><td>加热磁力搅拌器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP131324</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Nacalai Tesque</td><td>37345-15</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>SANYO</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S-200</td><td>Nippon Paper Crecia</td><td>62011</td><td></td></tr><tr><td>实验服</td><td>TOYO LINT FREE</td><td>FH240C</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21002-85</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌子</td><td>SANSYO</td><td>93-5412</td><td></td></tr><tr><td>金属药匙</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>647-06531</td><td></td></tr><tr><td>腈类手套</td><td>Kimberly-Clark</td><td>KC100</td><td></td></tr><tr><td>尼龙筛网（孔径：30 &amp;mu;m）</td><td>SEFAR</td><td>NY30-HD</td><td></td></tr><tr><td>P10 移液枪</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P200 移液枪</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液枪</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>HORIBA&amp;nbsp;</td><td>Navi F-52</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿（直径 9 cm）</td><td>IWAKI</td><td>SH90-15E</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿（直径 6 cm）</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1194.500</td><td></td></tr><tr><td>塑料称量舟</td><td>As One</td><td>1-5233-01</td><td></td></tr><tr><td>铂金丝（用于线虫挑取针）</td><td>Nilaco</td><td>PT-351265</td><td></td></tr><tr><td>1-丙醇</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>279544</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28721-55</td><td></td></tr><tr><td>护目镜</td><td>Kimberly-Clark</td><td>#25646</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>牙签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯水净化系统</td><td>Merck</td><td>Elix Essential 10 UV</td><td></td></tr><tr><td>纯水净化系统</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Synthesis A10</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>METTLER&amp;nbsp;</td><td>TOREDO</td><td></td></tr><tr><td>野生型 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 菌株 N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过两种化学物质配对在caenorhabditis elegans中实现厌恶性关联学习与记忆形成

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

线虫 Caenorhabditis elegans 是研究学习与记忆在分子和细胞水平机制的理想模式生物，因其神经系统结构简单，且其化学和电突触连接图谱已通过薄切片连续电子显微图像完全重建。本文中，我们描述了利用集中式和间隔式训练对 C. elegans 进行条件化处理以分别形成短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）的详细实验方案。通过将1-丙醇和盐酸分别作为条件刺激和非条件刺激进行配对，成功诱导了 C. elegans 形成厌恶性关联的短期记忆和长期记忆。未经训练的动物原本会被1-丙醇吸引，而经过训练的动物则不再被吸引或仅有极微弱的趋性。与其他生物（如 Aplysia 和 Drosophila）类似，“学习与记忆相关基因”在记忆形成过程中发挥着关键作用。特别是，在 C. elegans 中仅表达于六对中间神经元中的NMDA型谷氨酸受体，对于短期记忆和长期记忆的形成均是必需的，可能作为共激活的检测因子发挥作用。因此，记忆痕迹可能存在于这些中间神经元之间。

C. elegans 通过集中训练形成短期厌恶性关联记忆，其中以1%水溶液1-丙醇和盐酸（pH 4.0）分别作为条件刺激（CS）和非条件刺激（US）。根据上述方案，同步化线虫在18 °C室温下于培养台中培养5天，随后在18 °C室温下用ddH2O 轻柔清洗2次。接着，将线虫用1%水溶液1-丙醇与盐酸（pH 4.0）的混合液处理1秒进行条件化。同时，我们还设置了仅使用ddH2O、仅使用1%水溶液1-丙醇或仅使用盐酸（pH 4.0）处理的对照组。条件化后，线虫用ddH2O 清洗1次。该条件化过程连续重复10次，中间无间隔（无ITIs）。重复7次以上至10次可成功实现条件化；超过10次则导致学习效率降低21。训练结束后，线虫在室温（18 °C）下于细菌食物上休息10分钟。随后用ddH2O 清洗3次，将线虫重悬于0.25%水溶液明胶中并转移至微量离心管，依靠重力沉降至管底。尽可能去除上清液后，将线虫用趋化性检测缓冲液轻柔重悬，再依靠重力使其再次沉降至管底。
在尽可能去除上清液后，将动物悬液点在趋化性分析平板的中心圆上，平板置于18 °C室温环境中，随后让动物在18 °C室温下自由移动10分钟。趋化指数（C.I.）值的计算方法见图3B所示公式。如图4A所示，经1% 1-丙醇与HCl混合物训练的动物对点在琼脂平板上的5% 1-丙醇不再表现出趋化吸引，而未经训练的对照组动物和参考组动物则均对5% 1-丙醇表现出相似的趋化吸引。在集中训练（步骤3）后，该记忆在3 h内即不再可检测20。此外，集中训练形成的记忆对低温休克敏感20。这些结果表明，秀丽隐杆线虫（C. elegans）通过集中训练成功形成了厌恶性短期记忆（STM）。
动物还通过间隔训练进行了10次条件化，每次训练步骤之间间隔10分钟（步骤4.）。在间隔时间内，装有动物的收集器被放置于6 cm NGM平板上的细菌草坪中，室温（RT）为18 °C。经过间隔训练并使用1%水溶液1-丙醇与HCl（pH 4.0）混合物处理的动物，与仅使用1% 1-丙醇、仅使用HCl（pH 4.0）或仅使用ddH2O处理的动物相比，对5% 1-丙醇的趋向性显著降低（图4B）。间隔训练后，动物的记忆保持时间超过12 h20,21。此外，当动物被施以翻译或转录抑制剂时，记忆无法形成，且该记忆对冷休克具有抗性20,21。因此，C. elegans通过间隔训练成功形成了厌恶性长时记忆（LTM）。
我们还研究了“学习与记忆相关基因”的突变对短期记忆（STM）和长期记忆（LTM）形成的影响。 crh-1 基因编码普遍存在的转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB）， glr-1 和 nmr-1 编码α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）型和 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）型谷氨酸受体亚基，分别 stau-1 编码双链RNA结合蛋白Staufen同工型。这些基因在经典条件反射中发挥重要作用 C. elegans, 果蝇, Aplysia，以及小鼠。使用1%水溶液正丙醇与盐酸（pH 4.0）的混合液，STM和LTM的形成依赖于所有这些基因图5A，B).
<img alt="趋化性实验示意图；涉及动物收集器、NGM 平板、ddH₂O 洗涤的实验过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：群体训练实验示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="趋化性实验流程图：动物收集、清洗、NGM 平板静置、条件刺激/非条件刺激浸渍。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：间隔训练实验示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="趋化性示意图，含趋化指数（C.I.）公式；区分水和5% 1-丙醇。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：趋化性实验及趋化指数。（A）趋化性实验平板的示意图。将直径为6 cm的培养皿按图示分为四个区域，在距离中心2 cm处的两个对角位置，分别点加4 μL的5% 1-丙醇水溶液或ddH2O。（B）趋化指数（Chemotaxis index）通过图示公式计算，即在趋化实验结束后，统计区域“a”和“b”中的动物数量后代入公式得出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="密集训练与分散训练的柱状图；丙醇和盐酸对行为表现的影响；显著性标注。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：经化学物质训练后动物的趋化指数值。 同步化的野生型 N2 动物分别接受以下条件训练：（A）密集训练 10 次，或（B）分散训练 10 次。所用的密集训练和分散训练方案流程图分别见 图 1 和 图 2。训练结束后，动物在 18 °C 的室温下于 6 cm 琼脂平板上自由移动 10 分钟，以进行趋化行为检测。趋化指数（C.I.）值的计算方法见 图 3B 所示公式。本图数据详见 补充表 1。未经训练的对照动物数据在两个图中均被重新绘制。柱状图显示第一四分位数、中位数和第三四分位数。星号（*P &lt; 0.05）表示通过单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Dunnett 多重比较检验确定的统计学显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="显示N2品系和基因突变体学习指数（L.I.）的集中训练与分散训练柱状图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64137/64137fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：条件化处理的突变体动物的学习指数值。 同步化的野生型N2及所示突变体动物使用1%水溶液1-丙醇与HCl（pH 4.0）进行（A）10次集中训练或（B）10次分散训练。所用集中训练和分散训练方案的流程图分别见图1和图2。训练后，动物在18 °C室温下于6 cm琼脂平板上自由活动10分钟，以进行趋化性检测。本图数据见补充表2。柱状图显示第一四分位数、中位数和第三四分位数。星号（*P &lt; 0.05）表示经单因素方差分析（one-way ANOVA）后进行Dunnett多重比较检验得出的统计学显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/64137fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
补充图1：年轻成年动物对化学处理敏感。孵化后第4天和第5天的野生型N2动物连续进行10次盐酸（HCl，pH 4.0）大规模训练，随后检测其对5%水溶液1-丙醇的趋化性。柱状图表示均值 ± 标准误（n = 19）。星号（*P &lt; 0.05）表示通过双因素方差分析（two-way ANOVA）结合Tukey-Kramer事后检验确定的统计学显著差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充表 1：对应于图 4的数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/Supplemental%20Table%20S1.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2：对应于图 5的数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64137/Supplemental%20Table%20S2.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

我们先前已建立了秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）通过集中训练和间隔训练分别形成短期和长期关联记忆的实验方案。本文详细描述了将1-丙醇和盐酸分别作为条件刺激和非条件刺激配对，对秀丽隐杆线虫（C. elegans）进行条件化处理以形成厌恶性关联记忆的具体实验步骤。

通过两种化学物质配对在Caenorhabditis elegans中实现厌恶性关联学习与记忆形成

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种具有吸引力的模式生物，可用于在分子和细胞水平上研究学习与记忆，因为其……

学习和记忆对于动物在不断变化的环境中有效生存和繁殖至关重要，同时也是神经科学领域研究的主要课题之一。秀丽隐杆线虫因其神经系统的简单性，成为研究学习和记忆的理想模式生物。其化学和电学连接图也已完全重建。秀丽隐杆线虫的行为学分析极为复杂，受多种参数影响，如化学、机械和温度刺激。首先，在六厘米的线虫生长培养基（NGM）平板上，均匀涂布0.2毫升溶于LB培养基的大肠杆菌OP50液体培养物，并在室温下孵育不超过24小时。在第一天，使用铂金线虫挑取器从每块六厘米的NGM平板上挑选并放置五条充分喂食且处于产卵期的线虫，在室温下让其产卵约50枚，持续三小时，以获得同步化的成年线虫群体。为终止产卵，使用铂金线虫挑取器将亲本线虫从平板上移除。将线虫在室温下培养约五天，使其发育至完全成熟成虫阶段，而非年轻成虫阶段。五天后，用1毫升0.25%的水性明胶溶液冲洗每个培养板，收集约200只成年动物至动物收集器中，该明胶溶液可防止动物黏附在塑料表面（如移液器吸头）。随后，将收集器在10毫升双蒸水中轻轻上下移动两次，以清洗动物。重复该过程两次。将装有约200只动物的收集器轻轻浸入结晶皿中含40毫升pH为4的1%正丙醇与盐酸混合液中，持续1秒钟。随后，将收集器在含有10毫升双蒸水的6孔组织培养板的一个孔中轻轻浸入一次，以清洗收集器中的动物。然后，将收集器置于直径六厘米的NGM平板上的大肠杆菌OP50菌苔上，静置10分钟，使动物恢复。接下来，用10毫升双蒸水轻轻上下移动收集器，清洗收集器中的生物体。重复此清洗步骤三次，然后进行趋化性实验。按照之前的方法，依次用丙醇混合液和双蒸水各清洗收集器中的生物体一次。接下来，将收集器置于六厘米培养皿中NGM琼脂上的大肠杆菌OP50菌苔上，静置10分钟，使线虫恢复状态。随后，在10毫升双蒸水中轻轻上下移动收集器两次，重复此洗涤步骤三次，以防止细菌污染，然后进行趋化性实验。使用六厘米塑料培养皿制备趋化性实验用的螺旋平板。然后使用剪断的移液器吸头（开口大于一毫米）将动物从收集器转移至含有1毫升0.25%水性明胶的2毫升微量离心管中。待动物通过重力沉降至管底后，吸除上清液。将动物重悬于1毫升趋化性分析缓冲液中，并静置约一分钟，使其再次通过重力沉降至管底。然后，用移液器尽可能吸除上清液。接着，在培养皿中两个位置分别斜向点加4微升5%的水性1-丙醇溶液，再在另外两个位置分别点加4微升双蒸水。然后，使用切去末端、开口约为1毫米的移液器吸头，向三个培养皿的中央各点加6微升含有约60只动物的动物悬液，该悬液溶于趋化性分析缓冲液中。用实验室纸巾灯芯尽可能吸除液体，注意不要触碰到动物。盖上培养皿盖子，将培养皿置于室温下，让动物在其中自由活动10分钟。为终止趋化反应，将此培养皿转移至盛有冰的玻璃培养皿中，放置3分钟。接下来，将培养皿置于冰箱中，直至开始计数培养皿上的动物数量。在体视显微镜下，计数除中心圆圈区域外四个区域内的动物数量，并利用公式计算趋化指数。根据趋化指数值，通过对照组动物的趋化指数与训练组动物的趋化指数之差，计算学习指数。在趋化性实验中，用1-丙醇和盐酸混合物处理过的动物对点在琼脂平板上的5% 1-丙醇不再表现出趋化性，而未经处理的对照组动物和参考组动物则对5% 1-丙醇具有趋化性。与仅用1% 1-丙醇、盐酸或双蒸水处理的动物相比，经过间隔训练（spaced training）使用水相1-丙醇和盐酸混合物处理的动物对5% 1-丙醇的趋化性显著降低。通过研究突变对记忆的影响发现，动物经典条件反射过程中短时程和长时程记忆的形成依赖于若干关键基因的功能。每次训练后，动物应仅用双蒸水轻轻清洗一次。在使用该程序形成长期记忆后，可通过钙成像和电生理学技术鉴定负责该记忆的神经环路。结合遗传学分析和单神经元研究，可在分子水平和单细胞水平上探究记忆的存储与提取过程。

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