通过两种化学物质配对在Caenorhabditis elegans中实现厌恶性关联学习与记忆形成

学习和记忆对于动物在不断变化的环境中有效生存和繁殖至关重要，同时也是神经科学领域研究的主要课题之一。秀丽隐杆线虫因其神经系统的简单性，成为研究学习和记忆的理想模式生物。

其化学和电学连接图也已完全重建。秀丽隐杆线虫的行为学分析极为复杂，受多种参数影响，如化学、机械和温度刺激。首先，在六厘米的线虫生长培养基（NGM）平板上，均匀涂布0.2毫升溶于LB培养基的大肠杆菌OP50液体培养物，并在室温下孵育不超过24小时。

在第一天，使用铂金线虫挑取器从每块六厘米的NGM平板上挑选并放置五条充分喂食且处于产卵期的线虫，在室温下让其产卵约50枚，持续三小时，以获得同步化的成年线虫群体。为终止产卵，使用铂金线虫挑取器将亲本线虫从平板上移除。将线虫在室温下培养约五天，使其发育至完全成熟成虫阶段，而非年轻成虫阶段。

五天后，用1毫升0.25%的水性明胶溶液冲洗每个培养板，收集约200只成年动物至动物收集器中，该明胶溶液可防止动物黏附在塑料表面（如移液器吸头）。随后，将收集器在10毫升双蒸水中轻轻上下移动两次，以清洗动物。重复该过程两次。

将装有约200只动物的收集器轻轻浸入结晶皿中含40毫升pH为4的1%正丙醇与盐酸混合液中，持续1秒钟。随后，将收集器在含有10毫升双蒸水的6孔组织培养板的一个孔中轻轻浸入一次，以清洗收集器中的动物。然后，将收集器置于直径六厘米的NGM平板上的大肠杆菌OP50菌苔上，静置10分钟，使动物恢复。

接下来，用10毫升双蒸水轻轻上下移动收集器，清洗收集器中的生物体。重复此清洗步骤三次，然后进行趋化性实验。按照之前的方法，依次用丙醇混合液和双蒸水各清洗收集器中的生物体一次。

接下来，将收集器置于六厘米培养皿中NGM琼脂上的大肠杆菌OP50菌苔上，静置10分钟，使线虫恢复状态。随后，在10毫升双蒸水中轻轻上下移动收集器两次，重复此洗涤步骤三次，以防止细菌污染，然后进行趋化性实验。使用六厘米塑料培养皿制备趋化性实验用的螺旋平板。

然后使用剪断的移液器吸头（开口大于一毫米）将动物从收集器转移至含有1毫升0.25%水性明胶的2毫升微量离心管中。待动物通过重力沉降至管底后，吸除上清液。将动物重悬于1毫升趋化性分析缓冲液中，并静置约一分钟，使其再次通过重力沉降至管底。

然后，用移液器尽可能吸除上清液。接着，在培养皿中两个位置分别斜向点加4微升5%的水性1-丙醇溶液，再在另外两个位置分别点加4微升双蒸水。然后，使用切去末端、开口约为1毫米的移液器吸头，向三个培养皿的中央各点加6微升含有约60只动物的动物悬液，该悬液溶于趋化性分析缓冲液中。

用实验室纸巾灯芯尽可能吸除液体，注意不要触碰到动物。盖上培养皿盖子，将培养皿置于室温下，让动物在其中自由活动10分钟。为终止趋化反应，将此培养皿转移至盛有冰的玻璃培养皿中，放置3分钟。

接下来，将培养皿置于冰箱中，直至开始计数培养皿上的动物数量。在体视显微镜下，计数除中心圆圈区域外四个区域内的动物数量，并利用公式计算趋化指数。根据趋化指数值，通过对照组动物的趋化指数与训练组动物的趋化指数之差，计算学习指数。

在趋化性实验中，用1-丙醇和盐酸混合物处理过的动物对点在琼脂平板上的5% 1-丙醇不再表现出趋化性，而未经处理的对照组动物和参考组动物则对5% 1-丙醇具有趋化性。与仅用1% 1-丙醇、盐酸或双蒸水处理的动物相比，经过间隔训练（spaced training）使用水相1-丙醇和盐酸混合物处理的动物对5% 1-丙醇的趋化性显著降低。通过研究突变对记忆的影响发现，动物经典条件反射过程中短时程和长时程记忆的形成依赖于若干关键基因的功能。

每次训练后，动物应仅用双蒸水轻轻清洗一次。在使用该程序形成长期记忆后，可通过钙成像和电生理学技术鉴定负责该记忆的神经环路。结合遗传学分析和单神经元研究，可在分子水平和单细胞水平上探究记忆的存储与提取过程。