Name: 蜜蜂组织中的组织学基础和细胞死亡检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学习免疫组织化学方法检测蜜蜂中肠和咽下腺的细胞凋亡与坏死，评估农药对蜜蜂健康的亚致死影响。该技术可揭示杀螨剂对有益昆虫的组织学效应。

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我衷心感谢斯洛文尼亚研究署提供的支持，资助编号 P4-133。

1. 蜜蜂研究的基础组织学
<ol>
	<li>蜜蜂组织解剖 
	注意：解剖工蜂时，使用带有LED光源的解剖显微镜。最适宜的放大倍数约为20倍。
	<ol>
		<li>操作与解剖
		<ol>
			<li>用镊子小心夹取一只工蜂，将其置于冰上（或-20 °C冰箱中）2分钟以固定其活动22。将蜜蜂以对角线方向用大头针固定于培养皿中，针从胸部最上部区域左右两侧各穿刺一次，分别从左至右和从右至左穿过。</li>
			<li>倒入昆虫生理盐水以浸没虫体。将培养皿置于显微镜下，调焦并调整视野。</li>
			<li>准备所需器械（见材料表）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>中肠解剖
		<ol>
			<li>从腹部开始，在蜜蜂身体右侧中部将剪刀尖插入第五腹板（A5）下方（图1），剪至第二腹板（A2）。</li>
			<li>保持剪刀内侧刀刃与虫体侧面平行，避免损伤内部器官。将剪刀向左转动并剪开一次，再向右转动剪开另一次。轻轻打开腹部左侧部分并用大头针固定。在另一侧重复此操作。</li>
			<li>一手持镊子轻轻向上提起蜜蜂的胃部，另一手持剪刀在食道末端处剪断。将胃和中肠从腹部拉出，并在直肠处剪断。使用移液器吸取昆虫生理盐水冲洗，去除粪便或组织碎片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>咽侧体-脑复合体（HPGs）解剖
		<ol>
			<li>如步骤1.1.1所述，将工蜂置于冰上固定。剪下头部，将其放置在较小的培养皿中，使触角朝上。用两枚大头针分别穿过左、右复眼，将头部固定。</li>
			<li>在两枚大头针内侧，从第一只复眼内侧横向剪开，延伸至唇基，然后在另一侧同样横穿第二只复眼剪开（图2）。</li>
			<li>剪除触角。掀起头壳面具并在残留连接处剪断。用镊子小心取出腺体，连同脑组织及部分复眼一并移出。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定、脱水与石蜡包埋 
	注意：佩戴防护手套。
	<ol>
		<li>将组织放入青霉素瓶中，加入占瓶体积3/4的10%福尔马林溶液。置于4 °C冰箱中保存。</li>
		<li>24小时后，依次用系列酒精进行脱水处理：70%、80%、90%、100%酒精各1小时，随后100% 2-丙醇1小时，再换为100% 2-丙醇浸泡12小时，最后再用100% 2-丙醇1小时。</li>
		<li>将组织放入组织包埋盒中，标记后置于玻璃容器内，加入2-丙醇与石蜡（1:1）混合液，在60 °C恒温箱中孵育24小时。</li>
		<li>将组织包埋盒转移至另一含纯石蜡（I）的容器中继续孵育24小时。更换新鲜石蜡重复该步骤两次（II和III），每次均为24小时。</li>
		<li>最后，准备包埋台并开始将组织包埋入石蜡中。
		<ol>
			<li>打开每个组织包埋盒，取下盖子。在模具中注满石蜡，用预热的镊子小心将组织置于模具中央。</li>
			<li>将组织包埋盒盖在模具上，并稍加覆盖一层石蜡。立即将模具置于包埋台的冷面上数秒钟，然后移至冷板上数分钟，直至石蜡完全凝固，模具与包埋盒可整体分离。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将制备完成的样品存放于密闭盒中，避免灰尘和高温。</li>
		<li>使用切片机切取4 µm厚的切片：先连续切两片相连的切片，再单独切一片。用镊子转移切片，使其漂浮于蒸馏水（42 °C）表面，然后收集到洁净载玻片上——将前两片并列置于载玻片左侧，第三片单独置于右侧，保持彼此明显分离。将标记好的载玻片置于加热装置上过夜，最后存放于专用于组织学样本的储存盒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱蜡与再水化 
	注意：佩戴防护手套。
	<ol>
		<li>准备九个科卜林瓶，将切片依次浸入三种透明剂（I、II、III）中，每种5分钟。</li>
		<li>依次浸入2-丙醇、96%乙醇（I、II）、90%酒精、80%酒精和蒸馏水中，每种试剂处理3分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苏木精-伊红染色（H&amp;E染色） 
	注意：佩戴防护手套。
	<ol>
		<li>准备六个科卜林瓶。</li>
		<li>进行苏木精-伊红（H&amp;E）染色时，将已脱蜡并再水化的切片浸入苏木精染液中5分钟，随后小心置于流动自来水下冲洗2分钟。接着依次浸入蒸馏水中1分钟，再放入伊红染液中4分钟（伊红染色无需使用科卜林瓶）。</li>
		<li>将载玻片依次浸入96%乙醇1分钟、2-丙醇2分钟，最后浸入透明剂中2分钟。</li>
		<li>滴加封片剂，加盖盖玻片，静置干燥。在光学显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示体节 A1-A7 标注的昆虫解剖结构图，用于昆虫学研究的详细结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：蜜蜂身体的背侧视图。 A1-A7 为背板。有关蜜蜂解剖的详细说明，参见 Carreck 等人24。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下的真菌组织，真菌学实验；细胞结构，500 μm 尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：咽侧体（HPGs）的背侧观，复眼部分与脑部相连（不可见）。 一只5至6日龄的年轻工蜂具有饱满且呈乳白色的咽侧体（HPGs）。腺泡位于脑部，并以分支结构延伸至头部区域，直至脑后部。在采集蜂中，这些腺体显著萎缩，仅留下细线状的残余组织。因此，建议将腺体与脑部一同取出，以便在后续操作中避免组织丢失。比例尺 = 500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
2. 组织切片中细胞死亡的检测
<ol>
	<li>细胞凋亡检测试剂盒（检测方法 A） 
	注意：请遵循制造商的说明书（参见材料表）。
	<ol>
		<li>准备考普林瓶（Coplin jars）。</li>
		<li>脱蜡和复水后（参见步骤 1.3），将切片浸入 0.85% NaCl 溶液，然后浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中（5 分钟）。</li>
		<li>将切片置于 4% 多聚甲醛中，2 次，每次 15 分钟。</li>
		<li>将切片平放在容器中，加入 100 µL 蛋白酶 K（20 µg/mL）溶液，静置 10–30 分钟。</li>
		<li>将切片放入 PBS 中（5 分钟）。</li>
		<li>将切片置于含 4% 多聚甲醛的 PBS 中（5 分钟）。</li>
		<li>将切片浸入 PBS 中（2 次，每次 5 分钟）。</li>
		<li>将切片平放在容器中，加入 100 µL 平衡缓冲液，静置 5–10 分钟。</li>
		<li>加入 100 µL TdT 反应混合液。在容器内切片周围放入纸巾，用水润湿纸巾，然后用塑料膜覆盖。37 °C 孵育 60 分钟。</li>
		<li>将切片放回染色架中，浸入 2× 柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液中 15 分钟。</li>
		<li>将切片在 PBS 中浸洗 3 次，每次 5 分钟，然后在 0.3% 过氧化氢中处理 3–5 分钟，再在 PBS 中浸洗 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>再次将切片平放在容器中，加入 100 µL 链霉亲和素-HRP（辣根过氧化物酶），静置 30 分钟（用塑料膜覆盖）。</li>
		<li>将切片在 PBS 中浸洗 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将切片平放在容器中，加入 100 µL 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）溶液。观察是否出现浅棕色背景。</li>
		<li>将切片放回染色架，用双蒸水多次冲洗。</li>
		<li>用封片介质将切片加盖盖玻片封片，并平放晾干。</li>
		<li>在光学显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞凋亡检测试剂盒（检测方法 B） 
	注意：请遵循制造商的说明书（参见材料表）。
	<ol>
		<li>准备考普林瓶（Coplin jars）。</li>
		<li>配制蛋白酶 K 溶液（20 µg/mL，用 PBS 稀释）。</li>
		<li>切片脱蜡和复水后（步骤 1.3），将切片置于 PBS 中 5 分钟。</li>
		<li>将切片平放在容器中，加入蛋白酶 K（20 µg/mL，每 5 cm² 样本加 60 µL）。</li>
		<li>用蒸馏水清洗切片 2 次，每次 2 分钟。</li>
		<li>在室温下用内源性过氧化物酶淬灭液（3% 过氧化氢）处理。</li>
		<li>用 PBS 或水冲洗切片 2 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将切片平放在容器中，加入平衡缓冲液（75 µL/5 cm2），室温下处理 10 秒。</li>
		<li>小心擦去组织周围的液体。</li>
		<li>向每个切片加入 TdT 酶（末端脱氧核苷酸转移酶），在湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。在托盘内切片周围放入纸巾，用水润湿纸巾，然后用塑料膜覆盖。</li>
		<li>孵育后，将样本放回染色架中，在终止/洗涤缓冲液中静置 10 分钟。</li>
		<li>将抗地高辛抗体-过氧化物酶偶联物恢复至室温。</li>
		<li>在 PBS 中清洗切片 3 次，每次 1 分钟。</li>
		<li>小心擦去组织周围的液体。</li>
		<li>向切片加入两滴抗地高辛-过氧化物酶偶联物（65 µL/5 cm²），在湿盒中孵育 30 分钟。</li>
		<li>在 PBS 中清洗 4 次，每次 2 分钟，然后配制工作浓度的过氧化物酶底物溶液，轻轻拍去多余液体，并吸除切片周围的液体。</li>
		<li>用过氧化物酶底物（75 µL/5 cm²）覆盖切片，染色 5 分钟。取一张切片在显微镜下观察，确定最佳染色时间。</li>
		<li>在染色架中用蒸馏水清洗切片（3 次，每次 1 分钟）。</li>
		<li>将切片在蒸馏水中孵育 5 分钟。</li>
		<li>用苏木精复染 2 分钟。</li>
		<li>将切片置于流动自来水下冲洗 3 分钟。</li>
		<li>用蒸馏水清洗切片。</li>
		<li>用封片介质将切片加盖盖玻片封片，并平放晾干。</li>
		<li>在光学显微镜下观察。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞凋亡检测试剂盒（检测方法 C） 
	注意：请遵循制造商的说明书（参见材料表）。
	<ol>
		<li>准备考普林瓶（Coplin jars）。</li>
		<li>对组织切片进行脱蜡和复水（参见步骤 1.3）。</li>
		<li>用蛋白酶 K 处理组织（37 °C 孵育 15–30 分钟）。</li>
		<li>将切片放回染色架，用 PBS 冲洗 2 次。</li>
		<li>加入 50 µL “TUNEL 反应混合液”。在容器内放入湿润的纸巾，用塑料膜覆盖，37 °C 孵育 60 分钟。</li>
		<li>用 PBS 冲洗 3 次。</li>
		<li>将切片放入容器中，擦干组织样本周围的区域。</li>
		<li>向样本加入 50 µL Converter-AP 溶液，在湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 PBS 冲洗 3 次。</li>
		<li>加入 50–100 µL 底物溶液，避光静置 10 分钟。 
		注意：在光学显微镜下观察染色情况。</li>
		<li>用 PBS 冲洗切片 3 次。</li>
		<li>将切片转移至苏木精中复染 2 分钟，然后在流动自来水下小心冲洗 5 分钟。</li>
		<li>用含水封片介质将切片加盖盖玻片封片，并平放晾干。</li>
		<li>在光学显微镜下观察。在中肠或 HPGs 样本中，通过光学显微镜计数每个样本中 70 至 100 个细胞，评估受影响（阳性）细胞的比例。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

在生物体内，细胞死亡分为凋亡或坏死25&#160;，并可能伴随自噬现象26。凋亡细胞与坏死细胞的区别在于，凋亡是一种程序性细胞死亡形式，出现在正常细胞中；而坏死则是由致死性条件（如意外、疾病）引起的27,28。凋亡可通过基于TUNEL技术的检测试剂盒进行检测（通过标记凋亡过程中产生的双链DNA断裂处的3′-羟基末端来检测DNA片段化）。不同试剂盒在检测细胞清除方面具有不同的灵敏度水平。
其中一种检测方法（检测C）具有高灵敏度，可同时检测凋亡和坏死29；另一种检测方法（检测B）在检测凋亡性细胞死亡方面表现出更高的灵敏度30。检测C的原理是检测凋亡早期阶段的DNA断裂。在固定并通透凋亡细胞后，将组织与TUNEL反应混合液共同孵育。在此过程中，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的作用是催...

蜜蜂（Apis mellifera L.）是众多野生传粉昆虫中对农作物授粉最为重要的传粉者。数千年来，不断变化的环境促使蜜蜂在形态、生理、行为以及对多种病原体和寄生虫的耐受性方面发生适应性演化。因此，全球范围内已形成高度多样化的蜜蜂物种和亚种1。这些结果与先前的研究发现一致，表明蜜蜂消化道结构存在遗传变异，但也提示中肠的改变可能由环境因素所致2,3。
蜜蜂的消化道分为三个主要部分：前肠、中肠（胃）和后肠4。胃是消化花粉以及花蜜/蜂蜜的重要器官；后肠则通过吸收水分和离子实现渗透调节2。蜜蜂工蜂的咽下腺位于头部，可合成并分泌蜂王浆成分，用于饲喂幼虫、蜂后及蜂群其他成员。咽下腺的大小随年龄和任务变化，并依赖于良好的营养（优质花粉）。6至18日龄的哺育蜂负责育幼工作，其咽下腺体积增大5,6。在采集蜂中，咽下腺退化，仅分泌对蜂蜜中复杂糖类转化为简单糖类至关重要的酶类（如α-葡萄糖苷酶、亮氨酸芳基氨基肽酶、转化酶）7。
蜜蜂会受到多种生物性和非生物性胁迫因素的影响8，其消化道可能受到多种有害刺激物的影响。保护机体免受病原体侵袭的第一道屏障是中肠的围食膜，该结构由肠道黏膜组成，可抵御病原体入侵4。咽下腺（HPGs）的发育和功能受饮食、年龄和蜂群状态的影响9，同时也受到杀虫剂、杀螨剂10以及病原体11,12,13的干扰。由于防治瓦螨所使用的杀螨剂在蜂巢中残留，以及来自环境中的农药，都会影响采集蜂和哺育蜂14,15。目前对蜜蜂蜂群最大的威胁是瓦螨（Varroa destructor），它不仅作为传播病毒的媒介导致蜂群衰亡16&#160;，还通过取食寄主的脂肪体（蜜蜂体内重要的生命器官）而影响个体生理及蜂群整体功能17。
然而，集约化农田生境可为蜜蜂提供短期的食物来源。因此，农业环境管理措施应提高农业景观中蜜源植物的可获得性18。为了评估不同亚种6,19,20,21&#160;，或这些因素在细胞或组织水平（尤其是中肠和咽侧体）的亚致死效应，组织学和免疫组织化学方法在蜜蜂组织学研究中具有实用性和足够的准确性。

<table><tbody><tr><td>2-丙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApopTag 过氧化物酶试剂盒（ApopTag 过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7100</td><td>检测方法 B，https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA&lt;br/&gt; jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE&lt;br/&gt; j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx&lt;br/&gt; H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA&lt;br/&gt; vD_BwE；S7101 包含阳性对照</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeadEnd 比色法 TUNEL 系统</td><td>Promega</td><td>G7360</td><td>检测方法 A，https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360</td></tr><tr><td>解剖显微镜&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>包埋盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EnVision 系统碱性磷酸酶试剂盒</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>醇溶性</td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td>95%（或纯度较低）、90%、80%</td></tr><tr><td>Faramount 水性封片介质</td><td>Dako</td><td></td><td>封片介质</td></tr><tr><td>展片台</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td>Fine science tools</td><td>11294-00</td><td>标准 #4</td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td></td><td></td><td>甲醛</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice 透明剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>透明剂</td></tr><tr><td>3% 过氧化氢</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫针&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td>Entosphinx</td><td>44594</td><td>不锈钢昆虫针 &amp;ndash; 白色，2 号</td></tr><tr><td>ISCDDK, AP（原位细胞死亡检测试剂盒，碱性磷酸酶）</td><td>Roche</td><td>11684809910</td><td>检测方法 C，https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b&lt;br/&gt; ul.pdf</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室时钟</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td></td><td></td><td>载玻片盒必须用塑料膜包裹保存，以防灰尘污染</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>模块化组织包埋站</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast 包埋剂</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td></td><td></td><td>1.5 mL；3 mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td></td><td></td><td>填充冷凝硅胶&amp;nbsp;（Xantoprene L 蓝色和 Universal liquid plus 激活剂）</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Merck</td><td>21627</td><td></td></tr><tr><td>Ringer 氏溶液&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td></td><td></td><td>7.5 g NaCl，2.38 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，2.72 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，1 L 蒸馏水</td></tr><tr><td>剪刀&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td>Fine science tools</td><td>1406-09, 14061-09</td><td>直头和弯头，9 cm</td></tr><tr><td>Universal liquid plus 激活剂&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钟表镊&amp;rsquo;s 镊子（用于蜜蜂解剖）</td><td>Fine science tools</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水彩画笔</td><td></td><td></td><td>2 支</td></tr><tr><td>Xantoprene L 蓝色&amp;nbsp;（用于蜜蜂解剖）</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

蜜蜂组织学基础及组织中细胞死亡检测

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

蜜蜂（Apis mellifera L.）在蜂巢内（哺育蜂及其他巢内蜂）和蜂巢外（采集蜂）会暴露于气候变化和天气波动、多种杀虫剂、病原体以及营养不良等环境，这些因素主要通过口器进入，并主要影响成年蜜蜂的消化道。为了理解并预防这些内外部应激因素对蜜蜂的影响，一种有效的研究方法是免疫组织化学方法。本文描述了一种基本实验方案，用于制备成年蜜蜂的中肠（胃盲囊）和咽下腺（HPGs），以进行组织学分析。同时详细阐述了一种方法，用于评估细胞损伤程度，并区分作为组织自然再生过程的坏死与程序性细胞死亡（凋亡）。文中展示了成年蜜蜂经草酸及杀虫剂（杀虫剂和杀螨剂）处理后的实验结果，以及对胃盲囊和咽下腺中细胞死亡的判定。此外，还讨论了该方法的优缺点。

中肠细胞死亡检测 
从斯洛文尼亚卢布尔雅那农业研究所实验蜂场新羽化的工蜂（Apis mellifera carnica）个体接受3% 草酸（OA）处理23。草酸在养蜂业中常用于防治Varroa destructor。处理后，将工蜂（每组三只）置于冰上固定，解剖中肠并用10%福尔马林固定。组织随后经系列酒精溶液脱水，最终包埋于石蜡中。使用切片机切成7 µm厚的切片后，制备组织样本用于分析。在光学显微镜下，计算受影响细胞的百分比（每三个中肠样本中各计数70–100个细胞）。Assay B的结果表明，OA处理显著影响了中肠细胞（图3）。Assay A显示处理组与对照组蜜蜂之间无差异；细胞死亡率低于10%。仅饲喂糖浆的对照组蜜蜂，其中肠形态未受影响且保存良好。
<img alt="组织学微系统，染色组织切片，细胞形态，比较研...

免疫组织化学方法可用于蜜蜂研究，以检测和评估成年蜜蜂中肠和咽下腺中细胞凋亡和坏死的程度。

蜂群内部（哺育蜂及其他巢内蜂）和蜂群外部（采集蜂）的蜜蜂（Apis mellifera L.）暴露于气候和天气条件……

该方案在多种经农药处理的蜜蜂生物学与毒理学研究中具有重要应用价值。它有助于检测用于蜂群防治狄氏瓦螨的杀螨剂对蜜蜂组织产生的细胞水平反应。该方法可与蜜蜂或其他有益昆虫的行为学分析相结合，成为检测组织亚显微效应的有力工具。首先，用镊子小心地夹取一只工蜂，将其置于冰上或零下20摄氏度的冷冻环境中两分钟，以使其 immobilize（固定）。将蜜蜂以对角线方向用昆虫针从左至右、再从右至左两次穿过胸部最上部的位置，固定在培养皿中。加入昆虫生理盐水，使虫体完全浸没。将培养皿置于体视显微镜下，调焦并调整。解剖中肠时，从腹部开始，在蜜蜂身体右侧中央将剪刀的一侧刀尖插入第五腹板（tergite A5）下方，剪至第二腹板（tergite A2）。操作时保持剪刀内侧刀片与身体侧面平行，以避免损伤内部器官。向左转动剪刀并进行切割。轻轻打开蜜蜂腹部的左侧并用大头针固定。用一只手的镊子轻轻向上提起蜜蜂的胃部，同时用另一只手的剪刀在食道末端处剪断。将胃和中肠从腹部拉开，并在直肠处剪断。使用含有昆虫生理盐水的移液管，清除任何粪便或组织碎片。如需解剖下咽腺，将一只工蜂如前所述置于冰上固定。切下头部，将其放置在一个较小的培养皿上，使触角朝上。用两枚细针固定头部，一枚穿过左复眼，另一枚穿过右复眼。在细针内侧的左复眼内侧边缘处做一横切口，继续切至唇基，然后在另一侧的右复眼处做对称的另一切口。剪下触角。掀起头部的保护膜，并剪去仍附着的部分。用镊子小心地将腺体连同脑组织以及部分复眼一起取出。进行苏木精和伊红染色时，将脱蜡并复水的切片放入苏木精中染色五分钟。然后，将其小心置于流动的自来水下冲洗两分钟。接着，将切片放入蒸馏水中一分钟，再放入伊红中染色四分钟。将切片置于96%乙醇中1分钟，然后放入2-丙醇中2分钟，最后放入透明剂中2分钟。加入封片剂并盖上盖玻片，使其干燥。在光学显微镜下观察。 准备 Coplin 染色缸。配制蛋白酶 K。脱蜡并水化切片后，将载玻片放入 PBS 中孵育 5 分钟。将切片平放在容器中，加入蛋白酶K。用蒸馏水洗涤切片。在室温下淬灭内源性过氧化物酶。用 PBS 或水冲洗载玻片。将载玻片平放入容器中，室温下加入平衡缓冲液，孵育 10 秒。用吸水纸吸去组织周围的液体后，向每个切片上加入末端脱氧核苷酸转移酶，于 37 摄氏度的湿化孵育盒中孵育 1 小时。孵育前，在托盘内载玻片周围放置浸湿的纸巾，并用塑料膜覆盖。孵育后，将标本置于支架上，放入终止洗涤缓冲液中。用 PBS 洗涤载玻片并擦净组织周围后，向切片上滴加两滴温热的抗地高辛过氧化物酶偶联物，在湿盒中孵育 30 分钟。用PBS洗涤后，配制工作浓度的过氧化物酶底物，将切片覆盖该底物并染色5分钟。将切片置于显微镜下观察，确定最佳染色时间。将切片在染色架和蒸馏水中洗涤后，再于蒸馏水中孵育5分钟。用苏木精复染两分钟。将玻片置于流动的自来水下冲洗三分钟，然后放入蒸馏水中清洗。将玻片用盖玻片和封片介质封片，并平放晾干。在光学显微镜下观察。使用光学显微镜计算受影响细胞的百分比。结果表明，草酸处理显著影响了中肠细胞。免疫染色显示，在咽下腺的凋亡细胞核中出现阳性红色或棕色反应产物。经吡虫啉或蝇毒磷处理后，大多数腺细胞中均检测到阳性反应产物。在掀起蜜蜂头部的面罩时，需注意不要损伤或扯下咽下腺的部分结构。该技术可检测蜜蜂的亚临床变化，也适用于检测环境因素对蜜蜂及其他一些生物体的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

蜜蜂组织中的组织学基础和细胞死亡检测

蜜蜂可通过 appetitive 嗅觉学习范式（PER-conditioning）进行条件化训练。利用气味作为刺激，我们建立了一种方法，在记录行为的同时，结合钙成像技术检测蘑菇体神经元中由气味诱发的神经活动。 体内.

在体 Ca2+ 成像观察蜜蜂嗅觉学习过程中蘑菇体神经元的活动

我们介绍一种简单的方法，利用一种高溶解性的染料LysoTracker，对小鼠胚胎以及分化中的胚胎干细胞（ES细胞）培养物中程序性细胞死亡（PCD）的区域进行可视化观察。...

利用LysoTracker检测胚胎及分化中的胚胎干细胞的程序性细胞死亡

在蜜蜂工蜂中，衰老取决于社会行为而非实际年龄。本文展示了如何获得具有显著不同衰老模式的工蜂类型，并对其细胞衰老进行分析。...

在蜜蜂模型中获取衰老减缓、加速和逆转的样本

细胞膜脱落的微颗粒（MPs）是具有生物活性的囊泡，可在多种模型中分离并研究其病理生理学效应。本文介绍一种从T淋巴细胞衍生微颗粒（LMPs）的制备方法，并展示其对气道上皮细胞的促凋亡作用。...

淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

脂肪组织（AT）可影响机体全身的稳态，因此了解脂肪细胞分化与功能的分子机制具有重要意义。本文提供了一种实验方案，通过分析脂肪细胞的稳态、分化过程以及缺氧暴露（作为诱导脂肪细胞凋亡的模型），以深入理解这些生物学过程。...

通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

果蝇（Drosophila）被广泛用作研究神经变性的模式系统。本方案描述了一种通过检测大脑中空泡形成来量化神经变性的方法。此外，通过将对照组和实验组果蝇作为同一样本进行处理和切片，该方法还能最大限度地减少实验操作带来的影响。...

大规模组织学定量分析神经退行性变 果蝇

蜜蜂及其他昆虫的腹部背血管起到类似于哺乳动物心脏的功能，在营养物质运输、废物清除、免疫功能等方面发挥着重要作用。本文介绍了一种用于观察和进行药理学操控蜜蜂心率的实验方案。...

蜜蜂背血管的解剖与观察：心脏功能研究方法

为了检测药理学试剂对蜜蜂大脑不同区域磷脂酶C（PLC）的抑制作用，我们提供了一种生物化学检测方法，用于测定这些区域中的PLC活性。该检测方法可用于比较不同组织之间的PLC活性，也可用于比较表现出不同行为的蜜蜂之间的PLC活性。...

蜜蜂脑匀浆中磷脂酶C活性的检测

咽下腺腺泡大小是衡量哺育蜂营养状况的可靠指标。本文提供了详细的实验方案，用于解剖、染色、成像和测量哺育蜂咽下腺腺泡。...

测量蜜蜂（Apis mellifera）工蜂咽下腺腺泡大小

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9系统降低成年蜜蜂脑中蛋白质表达以验证抗体特异性的实验方案。...

利用 CRISPR-Cas9 技术在蜜蜂脑切片中进行抗 RDL 和抗 mGlutR1 受体抗体检测

学习免疫组织化学方法检测蜜蜂中肠和咽下腺的细胞凋亡与坏死，评估农药对蜜蜂健康的亚致死影响。该技术可揭示杀螨剂对有益昆虫的组织学效应。

蜜蜂组织学基础及组织中细胞死亡检测

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