黑足蜱 Ixodes scapularis 基因编辑的胚胎注射技术

这是首项针对螯肢动物物种的胚胎显微注射方案。蜱类胚胎注射技术的建立将开辟多个研究方向，特别是蜱类基因功能及蜱与病原体相互作用的研究。该技术为后续开展蜱类基因的功能研究奠定了基础，并为利用基因驱动系统实现蜱类种群控制提供了可能。

该方法将有助于在分子水平上理解蜱虫与其携带病原体之间的相互作用。这将使我们能够鉴定可用于莱姆病及其他病原体疫苗开发的蛋白质。蜱虫-病原体相互作用以及蜱虫吸血过程中向宿主传播病原体等多个研究领域都将从本研究中受益。

如今，我们还可以理解一些更基础的问题，例如蜱虫如何逃避宿主的免疫反应，以及DNA修复机制的差异。在进行此操作之前，需要先了解蜱虫生物学的若干方面。由于胚胎内部压力较高，当针接触时会导致胚胎破裂。

准备用于注射的胚胎非常重要。首先，在注射前一周，将雌鱼从4°C转移至27°C的培养箱中，以启动产卵。当雌鱼在三到四天后开始产卵时，使用细头画笔清除所有卵，并同时准备对雌鱼进行基因器官消融。

为排空腺体，将饱血的蜱虫置于显微镜下的载玻片上，调整位置使口器在腹侧和背侧均可见。然后小心刺破背侧口器后方的区域，并用镊子从腹侧施加压力。将无绒擦拭纸的边缘置于穿刺部位，吸除流出的液态蜡状物质。

或者，无需通过解剖排空腺体，可在蜱虫口器周围使用组织粘合剂等胶水。当雌虫再次开始产卵时，使用细小的画笔收集新产出的卵，并将其放入1.5毫升的微量离心管中。向含有0至18小时龄卵的离心管中加入约200 µL的5%苯扎氯铵水溶液。

用画笔轻轻搅动卵子5分钟，防止卵子沉降至管底，然后用微量移液器吸去上清液，使卵子留在管中。向含有卵子的管中加入约200 µL蒸馏水。用画笔轻轻搅动，再用微量移液器从微量离心管中吸去水分。

用蒸馏水洗涤后，加入约 200 微升 5% 氯化钠溶液，用画笔轻轻搅动五分钟。然后，五分钟后从离心管中移除溶液，并用蒸馏水将卵洗涤两次。接着，在含有卵的微量离心管中加入约 100 微升 1% 氯化钠溶液。

首先，用双面胶将两张玻璃载玻片粘合在一起，留出约 0.5 厘米的间隙，以利于固定卵，并在载玻片间隙的双面胶上贴一块透明薄膜敷料。然后使用画笔将 8 到 10 枚卵依次排列在载玻片装置上。接着，将排列好卵的载玻片置于复式显微镜的载物台上，并用无绒擦拭纸吸除保存卵所用的 1% 氯化钠溶液。

将装满的注射针连接到与显微操作仪相连的显微注射器上。接着，在显微注射器上使用高压设置，轻轻将针头在卵表面摩擦以打开针尖。针头打开后，根据针尖开口大小降低显微注射器的压力。

然后尽快以10至15度的角度向载玻片上的所有卵进行注射，迅速踩下脚踏板，并立即将载玻片转移至含有湿润滤纸的培养皿中的高湿度环境中。将含有已注射胚胎的载玻片置于铺有湿润滤纸的大培养皿中培养5至6小时后，在贴附有已注射胚胎的透明薄膜敷料上添加一小滴蒸馏水。随后，用画笔轻轻移动卵。

接下来，将卵转移到一个小的培养皿中，并用蒸馏水浸没。保持卵完全浸没在水中，将培养皿放入一个六夸脱的塑料盒内，置于27°C、相对湿度高于90%的培养箱中孵育。注射后21至25天，当幼虫开始从注射后的胚胎中孵化时，每天观察一次，并将已孵化的幼虫转移至顶部带有筛网的玻璃小瓶中。

结果表明，在胚胎发育早期（12至18小时龄）注射卵，并将卵的长轴与载玻片边缘垂直排列，可提高注射卵的存活率。在所有注射的卵中，最高可达8.5%存活并孵化出幼虫。在开始此操作之前，务必记住步骤2.4（去除母蜱的蜡质）以及步骤3.1至3.4（使用苯扎氯铵软化胚胎的绒毛膜，以及使用氯化钠溶液对胚胎进行脱水处理），这些步骤有助于成功完成胚胎注射。

该方法主要是为蜱虫基因编辑而开发的，将使我们能够进行基因敲除和敲入，从而帮助我们理解蜱虫基因的功能。该技术将允许把已应用于许多其他生物体的基因编辑工具用于蜱虫研究，进而加速蜱虫分子生物学领域的研究进展。