三维培养中磷脂介质诱导的转化

我们改进的3D检测培养方法可用于研究肿瘤微环境中各种组分的作用，从而鉴定出新的生物标志物和药物靶点。该方法能够用于研究细胞表型和分子信号通路的变化，其结果与免疫系统的实际情况高度相似。此外，该方法也可根据特定研究需求进行调整和优化。

该方法有助于识别可用于乳腺癌早期检测的新型生物标志物。此外，分子层面的深入理解还可用于发现新的药物靶点。该方法可用于研究基因或多个基因扰动后的肿瘤发生和形态发生过程，从而揭示这些基因所发挥的作用。

首先，通过吸除培养基并用 2 毫升 PBS 洗涤来消化细胞。加入 900 微升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 37°C 孵育约 15 分钟，或直至细胞完全消化。在八孔腔载玻片的八个孔中制备 lrECM 基质层，每孔加入 60 微升 lrECM 进行包被。

将其置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中，孵育时间最长不超过15分钟。为制备细胞悬液，加入5毫升重悬培养基以终止胰蛋白酶活性，并在25摄氏度下以112 ×g离心10分钟。吸除废弃培养基，将细胞重悬于2毫升检测培养基中。

充分混匀悬浮液，确保形成单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并计算每孔接种6,000个细胞所需的细胞悬液体积。根据所需孔数，用铺被培养基稀释细胞悬液。

向制备好的低浓度细胞外基质（lrECM）培养床中加入 400 微升稀释后的细胞悬液，注意小心操作，避免扰动 lrECM 培养床。在 37°C、含 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育。3 小时后，向每孔加入 200 纳摩尔的血小板活化因子（PAF）。

每次换液时加入相同浓度的PAF，并每4天用新鲜培养基重新补充细胞。培养20天后，小心吸出每孔中的培养基，用400微升预热的PBS洗涤各孔。通过加入400微升新配制的4%多聚甲醛固定腺泡结构，在室温下孵育20分钟。

用预冷的 PBS 清洗各孔一次，然后加入含 0.5% Triton X-100 的 PBS，在 4 摄氏度下透化 10 分钟。10 分钟后，小心吸出 Triton X-100 溶液，用 400 微升新配制的 PBS 甘氨酸溶液清洗。加入 400 微升封闭液（含 10% 山羊血清的免疫荧光缓冲液），室温孵育 60 分钟。

移除一抗封闭液，加入200微升用一抗封闭液配制的2%二抗封闭抗体，室温孵育45至60分钟。将一抗用2%二抗封闭抗体溶液按1:100稀释后备用。移除二抗封闭液，加入新鲜配制的抗体，4摄氏度孵育过夜。

小心吸取一抗溶液，并用400 µL免疫荧光缓冲液洗涤三次。接着，用一抗封闭液将荧光素标记的二抗按1:200比例稀释，将切片置于二抗溶液中，室温孵育40至60分钟。用400 µL免疫荧光缓冲液冲洗切片20分钟，随后用PBS洗涤两次，每次10分钟。

使用含有0.5纳克/毫升核染料的PBS在室温下对细胞核进行复染，染色时间为5至6分钟。用400微升PBS洗涤载玻片三次，以去除多余的染料。小心地用移液器吸尽全部PBS，并确保彻底去除残留液体。

然后向每个孔中加入一滴封片试剂，并在室温下静置过夜。最后，在共聚焦显微镜下以40倍或63倍放大倍数对切片进行成像，采集步长为0.6毫米的光学Z轴断层图像。这些图像显示了用核染料染色的腺泡中细胞的细胞核。

此处展示了在lrECM上培养20天的MCF10A腺泡的三维结构及其相差图像。最中心的切面显示存在一个中空的腔室。PAF会破坏极性，并在MCF10A乳腺腺泡中诱导类似EMT的变化。

MCF10A 细胞在 lrECM 中以三维“顶层”培养方式生长。在第 0、4、8、12 和 16 天对培养物进行 PAF 处理。培养物维持 20 天后，进行免疫染色，检测 alpha6-整合素和细胞核染色、高尔基体蛋白 GM130（顶膜极性标志物）以及波形蛋白（EMT 标志物）。

此处显示的是相应腺泡最中央的堆叠部分。代表性数据来自三次生物学独立实验中的40-50个腺泡。lrECM基质床需仔细制备，确保均匀铺展且不含任何气泡。

此外，细胞悬液应充分混匀，并缓慢加入，以避免结块。可从三维培养物中提取蛋白质和RNA，用于研究不同的分子通路。