分离带有荧光线粒体的条件性永生小鼠肾小球内皮细胞

具有稳定荧光线粒体的永生化肾小球内皮细胞是体外研究不同刺激对线粒体结构影响的理想工具。本文所述方法可获得大量肾小球内皮细胞。通过对肾小球内皮细胞（GEC）测试小分子化合物，可筛选出针对糖尿病肾病的单药治疗方案，其中GEC是主要受累细胞。

所述方法易于操作，且无需特殊设备。然而，重要的是要遵循所述步骤并对设备进行灭菌，以避免污染。首先，将分离肾小球细胞所需的灌流和分离材料放置于工作台面上。

使用 0.2 微米滤器过滤新配制的 Hanks' Balanced Salt Solution（HBSS），并在超净台中保存以避免污染。然后，将 200 微升磁珠与 20 毫升 HBSS 混合。将含 10% FCS 的 RPMI 及内皮细胞培养基在 37 摄氏度水浴中预热。

然后，用 2 毫升浓度为 10 微克/毫升的 IV 型胶原蛋白在室温下预包被六孔板中的两个孔，孵育 45 分钟。用 PBS 洗涤平板两次，以去除用于稀释胶原蛋白的乙酸。包被好的平板应立即使用，或在 2 至 8 摄氏度下保存，最多可保存四周。

用70%乙醇清洁手术器械和工作区域。随后将手术器械高压灭菌30分钟。打开麻醉小鼠的腹腔后，将蝶形针插入左心室。

为了注入100微升珠溶液以扩张血液循环，需用19号针头小心刺破肾下方的下腔静脉，继续灌注珠溶液。接着用镊子轻轻去除脂肪组织，用细手术剪刀C切除双侧肾脏，并将其置于含有1毫升冰上HBSS的培养皿中。用无菌手术刀将肾脏切成约1毫米大小的碎块。

将切碎的肾脏与1毫米新鲜配制的II型胶原酶在37摄氏度下于水平摇床上轻柔振荡孵育35分钟。消化完成后，加入4毫升含10%胎牛血清（FBS）的RPMI培养基以中和胶原酶活性。将消化后的组织通过无菌的100微米细胞滤网过滤至50毫升离心管中。

使用无菌的1.5毫升离心管底部将消化后的组织在滤网上轻轻研磨，使肾小球通过滤网。用15毫升HBSS冲洗细胞滤网。随后，将滤过液在室温下以200 ×g离心5分钟。

此时，离心管中含有三层。上层含有小管状结构等较小的组织，中层为带有肾小球的组织团块，下层则为碎片。小心吸除上清液及上层白色物质。

然后，将含有珠子及肾小球和碎片的沉淀物用1.5毫升HBSS重悬，并转移至一个2毫升离心管中。将离心管置于磁力浓缩器中，吸除上清液，随后用1毫升HBSS洗涤珠子两次。取20微升细胞悬液滴加到载玻片上。

然后，在显微镜下观察载玻片上是否存在肾小球。接着，将沉淀重悬于内皮细胞生长培养基中，并将悬液转移至2毫升离心管中。每3毫升培养基加入1微升干扰素γ，将细胞接种于6孔板中，在33摄氏度条件下孵育。

培养三天后，小心地将一毫升培养基更换为新鲜培养基。在此阶段，细胞为包含多种肾小球细胞的异质性细胞群体。七天后，将培养基更换为两毫升新鲜内皮细胞生长培养基，并添加干扰素γ以启动细胞增殖。

培养10天后，当细胞达到80%融合度时，用胰蛋白酶消化传代，并将其转移至经IV型胶原包被的T-25培养瓶中。培养21天后，将细胞转移至T-75培养瓶中。向T-75培养瓶中加入3毫升0.25%胰蛋白酶，在37°C下孵育5分钟。随后，用3毫升内皮细胞生长培养基中和胰蛋白酶，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心5分钟。

吸弃上清液，用含有1% BSA、2 mmol/L EDTA、1%青霉素/链霉素的1毫升PBS洗涤细胞。再次离心后，将沉淀重悬于200微升CD31抗体包被的磁珠和800微升PBS中。将细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育45分钟，并持续振荡。

接下来，将试管置于磁力浓缩器中，并用含有 BSA、EDTA 和青霉素/链霉素的 PBS 洗涤细胞四次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于 3 毫升内皮细胞生长培养基中，该培养基需添加干扰素 γ。每孔加入 1.5 毫升细胞悬液，接种于六孔板中预先包被 IV 型胶原的孔板中，在 33 摄氏度的适宜条件下进行培养。

培养四天后，将750微升培养基更换为新鲜的内皮细胞生长培养基，并添加干扰素γ。培养10至14天后，使用配备488纳米滤光片的落射荧光显微镜，观察表达荧光线粒体的CD31阳性肾小球内皮细胞（GECs）克隆的生长情况。21天后，或当细胞融合度达到80%至90%时，将细胞转移至T-25培养瓶中。

使用含有10% FCS的RPMI培养基维持培养。或者，细胞可进行冷冻保存。用胰蛋白酶传代细胞，方法如前所述。

然后，离心细胞并将沉淀重悬于3 mL冻存液中。将细胞分装至冻存管中，于液氮气相温度下保存。本方案描述了一种肾小球内皮细胞分离的方法。

从分离的肾小球中，细胞在培养三天后开始缓慢生长。七天后，细胞呈现异质性，并出现其他肾小球细胞类型，如足细胞、壁层上皮细胞和系膜细胞。当细胞融合度达到70%至80%时，通过内皮细胞的阳性筛选去除其他肾小球细胞。

表达 CD31 的 MitoDendra2 GECs 对足细胞标志物呈阴性，表现为突触足蛋白染色阴性。检测了葡萄糖浓度对线粒体结构的影响。与正常葡萄糖条件下可见的细长线粒体相比，高葡萄糖诱导了线粒体的断裂或分裂，表现为明显的球状线粒体。

此外，使用405纳米激光对单个活体MitoDendra2 GEC细胞中选定的线粒体亚群进行光转化。图中显示了在正常和高浓度葡萄糖处理的细胞中，选定区域内的线粒体成功由绿色转变为红色。这种转变使得研究人员能够观察MitoDendra2 GEC细胞中的线粒体融合事件。

在正常葡萄糖条件下，由于线粒体基质融合，观察到黄色的绿色和红色荧光合并信号。相比之下，在高葡萄糖处理的GECs中，线粒体主要呈碎片化状态。将细胞接种于六孔板中的一个孔内，并加入少量生长培养基，对于使细胞贴附于培养皿表面至关重要。

分离的内皮细胞可用于进行线粒体功能和结构研究。使用带有荧光线粒体特征的永生化内皮细胞将为药物发现开辟道路。可在这些细胞上测试小分子，并通过活细胞成像来检测其对线粒体功能的影响。